O Osteossarcoma (OS) é o tumor ósseo pediátrico mais comum. O tratamento atual consiste em remoção cirúrgica e quimioterapia multimodal neo- e adjuvante. No entanto, um terço dos pacientes são acometidos por recorrência pós-cirúrgica e metástases distantes sendo que apenas 20% daqueles com metástase sobrevivem após 5 anos. Diversos miRNAs vêm sendo apontados como metastamiRs, dentre eles o miR-10b. Este microRNA encontra-se hiperexpresso em uma série de tumores e associado a pior prognóstico. Estudos prévios têm demostrado que o miR-10b atua nos processos invasivos principalmente pareando-se de forma incompleta com o RNA mensageiro do gene HOXD10 e assim inibindo a sua tradução. Este fator de transcrição, assim como todos os membros da família dos genes HOX, exerce sua função ativando e reprimindo genes vitais para os processos de crescimento e diferenciação celular (inclusive durante o desenvolvimento do tecido ósseo), sendo também descrito como desregulado em diversos tumores. Em vista disso, o presente trabalho teve como objetivo estudar a influência do miR-10b no OS e sua associação com o gene HOXD10 em relação aos processos de proliferação, invasão e migração celular. Para tanto, foi avaliada a expressão de ambos em amostras tumorais, bem como os efeitos da modulação da expressão de miR-10b na capacidade proliferativa e invasiva de linhagens celulares de OS. Nossos resultados mostraram uma associação inversa entre os níveis de expressão do miR-10b e o grau de malignidade. O aumento de miR-10b in vitro levou a supressão da capacidade clonogênica e à redução dos processos de adesão, migração e invasão, sugerindo um papel de supressor tumoral em OS. Não foi encontrada correlação entre a expressão gênica do miR-10b e a do HOXD10, e ainda o aumento deste microRNA não alterou a expressão proteica do fator de transcrição. Sendo assim, o mecanismo pelo qual miR-10b contribui para a agressividade do OS permanece indefinido, mas parece ser independente de HOXD10. Paralelamente, a expressão do gene KLF4 (recentemente descrito como alvo direto de miR-10b) e de genes sabidamente associados à invasão (MMP2 e ROCK1) e proliferação (TP53 e BCL2) tampouco foi afetada após transfecção. Por outro lado, apesar de não ter sido confirmado como alvo de miR-10b no nosso estudo, HOXD10 foi encontrado significativamente hiperexpresso nas amostras de OS. Assim, considerando a importância da desregulação de vias de desenvolvimento no surgimento de tumores pediátricos e a participação do HOXD10 no desenvolvimento ósseo, o seu papel como oncogene e seu potencial como alvo terapêutico neste tipo tumoral merecem estudos posteriores. / Osteosarcoma (OS) is the most common pediatric bone tumor. The current treatment consists of surgical removal and neo- and adjuvant multimodal chemotherapy. Nonetheless, one-third of patients are affected by post-surgical recurrence and distant metastases, with only 20% of metastatic cases surviving after 5 years. Several miRNAs have been designated as metastamiRs, among them miR-10b. This microRNA is overexpressed in a series of tumors and associated with poor prognosis. Previous studies have shown that miR-10b acts on invasive processes mainly by pairing with the messenger RNA of the HOXD10 and thereby inhibiting its translation. This transcription factor, like all members of the HOX family, exerts its function by activating and/or repressing vital genes for cell growth and differentiation (even during the development of bone tissue) and is also described as deregulated in several tumors. In view of this, the aim of this work was to study the influence of miR-10b on OS and its association with the HOXD10 in relation to proliferation, invasion and cell migration. For this, the expression of both genes in tumor samples, as well as the effects of miR-10b expression modulation on the proliferative and invasive capacity of OS cell lines, were evaluated. Our results showed an inverse association between miR-10b expression levels and the degree of malignancy. The increase of miR-10b in vitro led to the suppression of clonogenic capacity and reduction of adhesion, migration and invasion, suggesting a role as a tumor suppressor in OS. No correlation was found between the gene expression of miR-10b and HOXD10, while the increase of the microRNA did not alter the protein levels of the transcription factor. Thus, the mechanism by which miR- 10b could contribute to OS aggressiveness remains undefined, though it appears to be independent of HOXD10. In parallel, the expression of KLF4 (recently described as a direct miR-10b target) and of genes known to be associated with invasion (MMP2 and ROCK1) and proliferation (TP53 and BCL2) was not affected after transfection. On the other hand, although HOXD10 was not confirmed as a miR-10b target in our study, this gene was found to be significantly overexpressed in the OS samples. Thus, considering the importance of the deregulation of developmental pathways on pediatric tumors and HOXD10 contribution on bone development, its role as an oncogene and its potential as a therapeutic target in this tumor type deserves further studies.

O Osteossarcoma (OS) é o tumor ósseo pediátrico mais comum. O tratamento atual consiste em remoção cirúrgica e quimioterapia multimodal neo- e adjuvante. No entanto, um terço dos pacientes são acometidos por recorrência pós-cirúrgica e metástases distantes sendo que apenas 20% daqueles com metástase sobrevivem após 5 anos. Diversos miRNAs vêm sendo apontados como metastamiRs, dentre eles o miR-10b. Este microRNA encontra-se hiperexpresso em uma série de tumores e associado a pior prognóstico. Estudos prévios têm demostrado que o miR-10b atua nos processos invasivos principalmente pareando-se de forma incompleta com o RNA mensageiro do gene HOXD10 e assim inibindo a sua tradução. Este fator de transcrição, assim como todos os membros da família dos genes HOX, exerce sua função ativando e reprimindo genes vitais para os processos de crescimento e diferenciação celular (inclusive durante o desenvolvimento do tecido ósseo), sendo também descrito como desregulado em diversos tumores. Em vista disso, o presente trabalho teve como objetivo estudar a influência do miR-10b no OS e sua associação com o gene HOXD10 em relação aos processos de proliferação, invasão e migração celular. Para tanto, foi avaliada a expressão de ambos em amostras tumorais, bem como os efeitos da modulação da expressão de miR-10b na capacidade proliferativa e invasiva de linhagens celulares de OS. Nossos resultados mostraram uma associação inversa entre os níveis de expressão do miR-10b e o grau de malignidade. O aumento de miR-10b in vitro levou a supressão da capacidade clonogênica e à redução dos processos de adesão, migração e invasão, sugerindo um papel de supressor tumoral em OS. Não foi encontrada correlação entre a expressão gênica do miR-10b e a do HOXD10, e ainda o aumento deste microRNA não alterou a expressão proteica do fator de transcrição. Sendo assim, o mecanismo pelo qual miR-10b contribui para a agressividade do OS permanece indefinido, mas parece ser independente de HOXD10. Paralelamente, a expressão do gene KLF4 (recentemente descrito como alvo direto de miR-10b) e de genes sabidamente associados à invasão (MMP2 e ROCK1) e proliferação (TP53 e BCL2) tampouco foi afetada após transfecção. Por outro lado, apesar de não ter sido confirmado como alvo de miR-10b no nosso estudo, HOXD10 foi encontrado significativamente hiperexpresso nas amostras de OS. Assim, considerando a importância da desregulação de vias de desenvolvimento no surgimento de tumores pediátricos e a participação do HOXD10 no desenvolvimento ósseo, o seu papel como oncogene e seu potencial como alvo terapêutico neste tipo tumoral merecem estudos posteriores. / Osteosarcoma (OS) is the most common pediatric bone tumor. The current treatment consists of surgical removal and neo- and adjuvant multimodal chemotherapy. Nonetheless, one-third of patients are affected by post-surgical recurrence and distant metastases, with only 20% of metastatic cases surviving after 5 years. Several miRNAs have been designated as metastamiRs, among them miR-10b. This microRNA is overexpressed in a series of tumors and associated with poor prognosis. Previous studies have shown that miR-10b acts on invasive processes mainly by pairing with the messenger RNA of the HOXD10 and thereby inhibiting its translation. This transcription factor, like all members of the HOX family, exerts its function by activating and/or repressing vital genes for cell growth and differentiation (even during the development of bone tissue) and is also described as deregulated in several tumors. In view of this, the aim of this work was to study the influence of miR-10b on OS and its association with the HOXD10 in relation to proliferation, invasion and cell migration. For this, the expression of both genes in tumor samples, as well as the effects of miR-10b expression modulation on the proliferative and invasive capacity of OS cell lines, were evaluated. Our results showed an inverse association between miR-10b expression levels and the degree of malignancy. The increase of miR-10b in vitro led to the suppression of clonogenic capacity and reduction of adhesion, migration and invasion, suggesting a role as a tumor suppressor in OS. No correlation was found between the gene expression of miR-10b and HOXD10, while the increase of the microRNA did not alter the protein levels of the transcription factor. Thus, the mechanism by which miR- 10b could contribute to OS aggressiveness remains undefined, though it appears to be independent of HOXD10. In parallel, the expression of KLF4 (recently described as a direct miR-10b target) and of genes known to be associated with invasion (MMP2 and ROCK1) and proliferation (TP53 and BCL2) was not affected after transfection. On the other hand, although HOXD10 was not confirmed as a miR-10b target in our study, this gene was found to be significantly overexpressed in the OS samples. Thus, considering the importance of the deregulation of developmental pathways on pediatric tumors and HOXD10 contribution on bone development, its role as an oncogene and its potential as a therapeutic target in this tumor type deserves further studies.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2018-06-19T18:25:16Z No. of bitstreams: 1 DANIEL RODRIGUES DE BASTOS.pdf: 1922893 bytes, checksum: 51e3aa82ceb630f944c3c65627dcffaa (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-19T18:25:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DANIEL RODRIGUES DE BASTOS.pdf: 1922893 bytes, checksum: 51e3aa82ceb630f944c3c65627dcffaa (MD5) Previous issue date: 2017-05-04 / Introduction: Breast cancer is the most frequent neoplasm among women worldwide and represents the leading cause of death in this population. Important biomarkers have been studied in order to better define the prognosis of patients affected by this cancer. MicroRNAs are small molecules of non-coding RNAs composed of 21 to 25 nucleotides that play an important role in the post-transcriptional regulation of several genes. Objective: The objective of this study was to evaluate the expression of microRNAs (miRNAs: hsa-miR-7 and hsa-miR-10b) and BRCA1 protein in breast cancer samples, as well as the possible associations between expression of these markers with clinicopathological and prognostic aspects. Method: The study included 92 cases of breast carcinoma from Hospital Araújo Jorge, Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Formalin fixed paraphin embedded samples were used for the analisis. MicroRNA was extracted from the samples and used for cDNA synthesis. The cDNA samples were adjusted to the same concentration and submitted to quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Samples were further evaluated by immunohistochemistry for BRCA1 expression. Results: From a group of 234 immunohistochemical records, 56 cases of non-triple-negative and 36 triple-negative breast carcinomas were selected. Five-year overall survival was significantly associated to triple negative phenotype (p = 0.044), advanced stages (p = 0.005), lymph node involvement (p = 0.038), presence of distant metastasis (p = 0, 0008) and absence of BRCA1 expression (p = 0.039). Significant associations were demonstrated between the absence of BRCA1 and the triple-negative phenotype (p = 0.0346), as well as the absence of estrogen receptor expression (p = 0.006) and absence of progesterone receptor expression (p = 0.0163). The analysis by qRTPCR demonstrated different levels of miR-10b and miR-7 expression in the tumors, with significant associations with triple-negative phenotype (p = 0.021, p = 0.042) and the absence of BRCA1 (p = 0.039, p = 0.006). The comparison between absence and presence of human epidermal growth factor receptor expression showed a significant difference for miR-7 (p = 0.031), and the expression of miR-10b in these cases was not statistically different (p = 0.926). Conclusion: Significant associations were demonstrated between the absence of BRCA1 and the triple-negative phenotype. Five-year overall survival was reduced for the triple-negative phenotype patients, clinical stages III and IV, the presence of lymph node metastasis, the presence of distant metastasis and the absence of BRCA1 expression. This study also demonstrated that hsa-miR-7 and hsa-miR-10b are significantly associated with the absence of BRCA1 expression and triple-negative phenotype, with poorer survival in these patient profiles. Studies with more cases and with cell lines should be performed in order to confirm the role of hsa-miR-7 and hsa-miR-10b in the modulation of BRCA1 expression. / Introdução: O câncer de mama é a neoplasia mais frequente entre as mulheres de todo o mundo e representa a principal causa de morte nesta população. Importantes biomarcadores têm sido estudados, a fim de definir melhor o prognóstico de pacientes acometidas por esta doença. Os microRNAs são pequenas moléculas de RNAs não codificantes, compostos por 21 a 25 nucleotídeos e desempenham importante papel na regulação pós-transcricional de diversos genes. Objetivo: O objetivo do estudo foi avaliar a expressão de microRNAs (miRNAs: hsa-miR-7 e hsamiR- 10b) e da proteína BRCA1 em amostras de câncer de mama, bem como as possíveis associações entre a expressão desses marcadores e os aspectos clinicopatológicos e prognósticos. Método: O estudo foi composto por 92 casos de carcinoma de mama, provenientes do Hospital Araújo Jorge, da Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Foram utilizados fragmentos de tumores incluídos em parafina. A extração de microRNA das amostras foi realizada e o produto gerado foi utilizado para a síntese de cDNA. As amostras de cDNA foram ajustadas para igual concentração e submetidas à PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). As amostras foram avaliadas ainda por meio de imuno-histoquímica para expressão de BRCA1. Resultados: Um total de 234 registros de imuno-histoquímica foi avaliado, resultando em 56 casos de carcinomas de mama apresentando fenótipo não triplonegativo e 36 com fenótipo triplo-negativo. A sobrevida das pacientes em função das características clinicopatológicas demonstrou associações com os casos triplonegativos (p=0,044), estádios mais avançados (p=0,005), acometimento linfonodal (p=0,038), presença de metástase à distância (p=0,0008) e ausência da expressão de BRCA1 (p=0,039). Associações significativas foram demonstradas entre a ausência de BRCA1 e o fenótipo triplo-negativo (p=0,0346), entre a ausência da expressão do receptor de estrógeno e ausência da expressão de BRCA1 (p=0,006), e entre o receptor de progesterona e a ausência da expressão de BRCA1 (p=0,0163). A análise por qRT-PCR demonstrou diferentes níveis de expressão de miR-10b e de miR-7, com associações significativas ao fenótipo triplo-negativo (p=0,021; p=0,042) e à ausência de BRCA1 (p=0,039; p=0,006). A comparação entre ausência e presença da expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico humano demonstrou diferença significativa para miR-7 (p=0,031), sendo que a expressão de miR-10b nestes casos não foi estatisticamente diferente (p=0,926). Conclusão: Associações significativas foram demonstradas entre a ausência de BRCA1 e o fenótipo triplo-negativo. A sobrevida em cinco anos foi inversamente associada ao fenótipo triplo-negativo, aos estádios clínicos III e IV, à presença de metástase linfonodal, à presença de metástase à distância e à ausência da expressão de BRCA1. Este estudo demonstrou ainda que hsa-miR-7 e hsa-miR- 10b estão significativamente associados à ausência da expressão de BRCA1 e ao fenótipo triplo-negativo, sendo observada pior sobrevida nestes perfis de pacientes. Estudos com maior número de casos e com linhagens celulares devem ser realizados para constatar o papel de hsa-miR-7 e hsa-miR-10b na modulação da expressão de BRCA1.