Made available in DSpace on 2014-06-12T23:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9000_1.pdf: 2714668 bytes, checksum: 14f0908becb753cf06bcf186d3cd5cb5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do percentual de marcação do radiofármaco 99mTc-MIBI nos procedimentos adotados em serviços de medicina nuclear em Recife e a sua possível interferência na qualidade da imagem produzida durante o exame de perfusão de miocárdio. Este trabalho foi realizado em dois serviços de medicina nuclear do Recife que utilizam o fármaco MIBI provenientes de dois diferentes fabricantes: o Cardiolite, fabricado pela DUPONT e o Cardiosyd, fabricado pela SYDMA. O pH, percentual de marcação e estabilidade de amostras do 99mTc-MIBI e o percentual de captação no coração de um número de pacientes foram avaliados. Os resultados mostraram que os valores de pH em todas as amostras do 99mTc-MIBI analisadas, de ambos os radiofármacos, apresentaram valores dentro dos limites recomendados. Em 48% das amostras do radiofármaco preparado com o Cardiolite, o percentual de marcação foi inferior a 90% que é o limite mínimo recomendado. Por outro lado, 87,5% das amostras do radiofármaco preparadas com Cardiosyd apresentaram percentuais acima de 98%. Quanto à estabilidade da marcação, as amostras de ambos os fármacos apresentaram boa estabilidade, mesmo para amostras com baixo percentual de marcação. Apesar do alto percentual de marcação do fármaco Cardiosyd, a sua captação pelo coração é comparável à observada nos exames realizados com o radiofármaco preparado com o Cardiolite quando este apresentou percentual de marcação menor que 90%. Por outro lado, a qualidade da imagem, segundo o parecer médico, foi menor nas imagens realizadas com o Cardiosyd devido ao alto ruído e baixa nitidez que apresentaram

Einleitung/ Zielstellung Zusätzlich zur Gammastrahlung emittiert 99mTc ca. 5 niederenergetische Auger-Elektronen mit Reichweiten von wenigen Nanometern im Gewebe. Diese haben für die nuklear-medizinische Diagnostik keine Bedeutung. Es wird jedoch über eine therapeutische Nutzung diskutiert, wofür eine Anreicherung der Auger-Elektronen-Emitter in einem strahlensensitiven Zellkompartiment erforderlich ist. Ziel der Arbeit war es, verschiedene [99mTc]Tc-Radiopharmaka hinsichtlich ihres Uptakeverhaltens, der subzellulärer Verteilung und des Retentionsverhaltens in vitro zu untersuchen, sowie die mutmaßlich durch den Auger-Effekt hervorgerufene Radiotoxizität der [99mTc]Tc-markierten Radiopharmaka zu vergleichen und die gewonnenen Ergebnisse in Hinblick auf potentielle extranukleäre strahlensensitive Targets zu interpretieren. Material und Methode Durchgeführt wurden die Versuche im ersten Abschnitt der Arbeit an Natrium-Iodid-Symporter (NIS)-positiven FRTL-5-Schilddrüsenzellen. Von [99mTc] Pertechnetat ([99mTc]TcO4-), [99mTc]TcO4- nach Vorinkubation von Perchlorat ([99mTc]TcO4-/ ClO4-), [99mTc]Tc-Hexakis-2-Methoxyisobutylisonitril ([99mTc]Tc-MIBI), [99mTc]Tc-Hexamethyl-Propylenaminoxim ([99mTc]Tc-HMPAO) und [99mTc]TcO4- nach Vorinkubation von Zinn-Pyrophosphat (Sn- PYP/ [99mTc]TcO4-) wurden die intrazelluläre Radio¬nuklid¬aufnahme und die subzelluläre Verteilung untersucht. Basierend auf den Ergebnissen dieser Versuche wurde die mittlere absorbierte Zellkerndosis kalkuliert. Zur Beurteilung der strahlenbiologischen Wirkung wurde das klonogene Zellüberleben mit der Anzahl residualer gH2AX-Foci (DNA-Schaden) verglichen und die Wirkung der [99mTc]Tc Tracer auf den Zellzyklus von FRTL-5-Zellen untersucht. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde an EGFR-positiven A431-Zellen die radiotoxische Wirkung in Abhängigkeit von der intra¬zellulären Lokalisation von [99mTc]Alexa(488)-C225-Cyclooctin-Dpa-Tc(CO)3 ([99mTc]Tc-C225), [99mTc]Tc-HMPAO und [99mTc]TcO4- auf das klonogene Zellüberleben untersucht. Ergebnisse und Diskussion Aufgrund verschiedener Uptakemechanismen zeigte jedes der untersuchten [99mTc]Tc-Radiopharmaka Unterschiede im zeitlichen Verlauf der Uptakekinetik. Durch Blockierung des NIS durch ClO4- konnte eine intrazelluläre Aufnahme von [99mTc]TcO4- verhindert werden, wogegen durch Vorinkubation mit Sn-PYP die zelluläre Aufnahme von [99mTc]TcO4- um das 22-fache gesteigert wurde. [99mTc]Tc-MIBI und [99mTc]Tc-HMPAO wurden aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften unabhängig vom NIS passiv in die Zelle transportiert. Die Untersuchung der intrazellulären Verteilung ergab für [99mTc]Tc-HMPAO und Sn-PYP/ [99mTc]TcO4- eine vergleichbar hohe Anreicherung in der Membran/Organellen-Fraktion sowie in der Zellkernfraktion. Von [99mTc]TcO4- und [99mTc]Tc-MIBI wurde die Hauptaktivität in der Zytosol-Fraktion und nur geringe Anteile in der Membran/Organellen-Fraktion sowie in der Zellkernfraktion nachgewiesen. In guter Übereinstimmung zur subzellulären Verteilung zeigten Sn-PYP/ [99mTc]TcO4- und [99mTc]Tc-HMPAO eine fast vollständige, hingegen [99mTc]Tc-MIBI und [99mTc]TcO4- nur eine geringe Retention. Aufgrund der genannten Unterschiede wurde bei gleicher inkubierter Aktivitätskonzentration folgende Reihenfolge der resultierenden Zellkerndosis ermittelt: [99mTc]TcO4- < [99mTc]Tc-MIBI < [99mTc]Tc-HMPAO < Sn-PYP/ [99mTc]TcO4-. [99mTc]TcO4- und [99mTc]Tc-HMPAO zeigten eine ähnliche Wirkung auf das klonogene Zellüberleben und auf den Zellzyklus. Jedoch bewirken sie eine wesentlich stärkere Reduzierung des Überlebens und einen stärkeren G2-Arrest als [99mTc]Tc-MIBI und Sn-PYP/ [99mTc]TcO4-, wobei [99mTc]Tc-MIBI bei allen drei untersuchten biologischen Endpunkten die geringste Wirkung zeigte. Bei einer vergleichbaren Reduktion des Zellüberlebens von [99mTc]TcO4- und [99mTc]Tc-HMPAO induzierte [99mTc]Tc-HMPAO lediglich die Hälfte der gH2AX-Foci im Vergleich zu [99mTc]TcO4-. Die trotz geringerem DNA-Schaden vergleichbare radiotoxische Wirkung zeigte, dass das klonogene Zellüberleben nicht allein vom DNA-Schaden abhängt. Daraus folgt, dass es außer der Kern-DNA noch weitere strahlensensitive Kompartimente gibt, die durch [99mTc]Tc-HMPAO stärker geschädigt wurden als von den anderen untersuchten [99mTc]Tc Tracern. Ein mögliches extranukleäres strahlensensitives Target ist die Zellmembran, so dass im zweiten Teil der Arbeit zur Überprüfung der Radiosensitivität der Zellmembran die radiotoxische Wirkung von [99mTc]Tc-C225 an EGFR-positiven A431-Zellen untersucht wurde. [99mTc]Tc-C225 wurde über den EGFR und [99mTc]Tc-HMPAO aufgrund seiner Lipophilie durch Diffusion intrazellulär aufgenommen. [99mTc]TcO4- dagegen zeigte keine intrazelluläre Aufnahme in die NIS-negativen Zellen und wurde als Referenz für eine extrazelluläre Bestrahlung verwendet. [99mTc]Tc-C225 wies nach einstündiger Inkubation eine Membranbindung von lediglich 10 % auf, die im Laufe von 24 h auf 1,9 % absank. Dies zeigte, dass [99mTc]Tc-C225 rasch in den A431-Zellen internalisiert wurde und dass nur bei sehr kurzen Inkubationszeiten von einer spezifischen Zellmembranmarkierung gesprochen werden kann. [99mTc]Tc-HMPAO ging keine Bindung an die Zellmembran ein. Weiterhin wurde bei der Inkubation steigender Aktivitäts- und Antikörperkonzentrationen von [99mTc]Tc C225 eine Sättigung des EGFR beobachtet, woraus eine wesentlich geringere Zellkerndosis als bei Inkubation von [99mTc]Tc-HMPAO resultierte. Im Vergleich des klonogenen Zellüberlebens zeigten [99mTc]Tc-C225 und [99mTc]Tc-HMPAO bei gleicher Zellkerndosis keine Unterschiede in der radiobiologischen Wirkung. Somit konnte lediglich eine Verstärkung der radiotoxischen Effekte von [99mTc]Tc-C225 an A431-Zellen im Vergleich zur ausschließlich extrazellulären Verteilung von [99mTc]TcO4- gezeigt werden. Schlussfolgerung Die Untersuchung der radiotoxischen Wirkung von [99mTc]Tc-C225 ermöglichte bei den angewendeten Versuchsbedingungen keine Rückschlüsse auf die Strahlensensitivität der Zellmembran. Weiterführende Arbeiten zur Entwicklung eines 99mTc-markierbaren spezifischen Membranmarkers wären notwendig, um klären zu können, ob die Zellmembran ein ähnlich strahlensensitives Target wie die nukleäre DNA ist. Dosimetrische Betrachtungen an den als Modellsystemen dienenden FRTL-5- und A431-Zellen deuten darauf hin, dass aufgrund ungenügender Anreicherung eine therapeutische Wirkung der Auger-Elektronen im Tumorgewebe eher unrealistisch ist. Damit sollte aus gegenwärtiger Sicht die klinische Anwendung von 99mTc auf den diagnostischen Einsatz beschränkt bleiben. Jedoch könnte 99mTc als Auger-Elektronen-Emitter bei spezifischer Anreicherung in definierten Zellkompartimenten als Nano-Tool zur Erforschung der Strahlensensitivität einzelner Zellbestandteile eingesetzt werden. / Introduction In addition to gamma radiation, 99mTc emits approximately 5 low energy Auger and internal conversion electrons per decay, resulting in high ionization density proximal to the radionuclide’s decay position. Low-energy Auger electrons with path lengths of only nanometers cannot be utilized for diagnostic procedures; however, they have frequently been discussed for therapeutic applications. To achieve a radiobiological effect, an intracellular accumulation and distribution in relevant cell compartments of the Auger electron emitter is required. Aim The aim of the thesis was the comparison of different [99mTc]Tc-labeled compounds concerning their intracellular uptake, subcellular distribution and retention in vitro. Furthermore the radiotoxicity caused by the Auger effect has to be investigated. Material and Methods The intracellular radionuclide uptake, subcellular distribution (ProteoExtract®-Kit) and retention of [99mTc] pertechnetate ([99mTc]TcO4-), [99mTc]TcO4- after pre-incubation of perchlorate ([99mTc]TcO4-/ClO4-), [99mTc]TcO4- after pre-incubation of stannous pyrophosphate ([99mTc]TcO4-/Sn-PYP), [99mTc]Tc-hexamethyl-propylene-aminoxime ([99mTc]Tc-HMPAO) and [99mTc]Tc-hexakis-2-methoxyisobutylisonitrile ([99mTc]Tc-MIBI) were quantified in sodium-iodide symporter (NIS)-positive rat thyroid FRTL-5 cells. Basing on these results the mean absorbed nucleus dose was calculated. Radiotoxicity was investigated using phosphorylated histone H2AX (gH2AX foci), clonogenic cell survival and cell cycle analyzes. Additionally the radiotoxicity of [99mTc]Alexa(488)-C225-Cyclooctin-Dpa-Tc(CO)3 ([99mTc]Tc-C225) was compared with the one of [99mTc]TcO4- and [99mTc]Tc -HMPAO depending on the subcellular distribution in EGFR-positive A431 cells. Results and Discussion For the analyzed [99mTc]Tc-labeled compounds we detected differences in the time courses of the uptake kinetics caused by different uptake mechanisms into the FRTL-5 cells. The radionuclide uptake of [99mTc]TcO4- was blocked in the presence of perchlorate and increased by a factor of approximately 22 after pre-incubation of Sn-PYP. The lipophilic complexes [99mTc]Tc-MIBI and [99mTc]Tc-HMPAO crossed the cell membrane through passive transport via diffusion. The compartmental analysis indicated that [99mTc]Tc-HMPAO and [99mTc]TcO4-/Sn-PYP revealed a comparable high uptake in the nucleus and in the membrane/organelle fraction. [99mTc]TcO4- and [99mTc]Tc-MIBI were preferentially distributed in the cytosol, with lower amounts of the accumulated activity in both the membranes/organelles and the nucleus compared with the other compounds. In good agreement with the subcellular distribution [99mTc]Tc-HMPAO, [99mTc]TcO4-/Sn-PYP showed a nearly complete retention and [99mTc]TcO4-, [99mTc]Tc-MIBI a low retention. Due to the differences mentioned above the following sequence of the calculated mean nucleus dose for identical activity concentrations was determined: [99mTc]TcO4- < [99mTc]Tc-MIBI < [99mTc]Tc-HMPAO < Sn PYP/ [99mTc]TcO4-. [99mTc]TcO4- and [99mTc]Tc-HMPAO caused a similar reduction of the cell survival and a dose dependent G2-arrest. [99mTc]Tc-MIBI and Sn-PYP/ [99mTc]TcO4- are both less radiotoxic in terms of the estimated nucleus dose compared with [99mTc]TcO4- and [99mTc]Tc-HMPAO. Despite the similar effect on the cell survival [99mTc]Tc-HMPAO induced only half of the residual gH2AX foci than [99mTc]TcO4-. These findings reveal that clonogenic cellular survival is not solely determined by the DNA-DSB response, which may suggest the involvement of extra-nuclear radiosensitive targets in cell inactivation. A possible extra-nuclear radiosensitive target is the cell membrane. That’s why the aim of the second part of the thesis is the investigation of the radiosensitivity of the cell membrane. Therefore the radiotoxic influence of [99mTc]Tc-C225 was analyzed at EGFR-positive A431 cells. [99mTc]Tc-C225 was taken up over the EGFR and the lipophilic [99mTc]Tc-HMPAO was transported via diffusion over the cell membrane. In contrast, [99mTc]TcO4- did not show any intracellular uptake into the NIS-negative cells and therefore was used as extracellular reference. An incubation of [99mTc]Tc-C225 for one hour resulted to a membrane binding of only 10 %, which was reduced to 1.9 % after 24 hours. This demonstrated a fast internalization into A431-cell. Therefore only in the case of a very short incubation time [99mTc]Tc-C225 leads to a specific targeting of the cell membrane. [99mTc]Tc-HMPAO did not bind to the cell membrane. Furthermore the incubation of increasing concentrations of activity and antibody resulted in a saturation of the EGFR, leading to a significant lower nucleus dose in comparison to the incubation of [99mTc]Tc-HMPAO. Concerning the clonogenic cell survival no differences in the radiotoxicity of [99mTc]Tc-C225 and [99mTc]Tc-HMPAO were observed for equal nucleus dose. Thus only an amplification of the radiotoxic effects of [99mTc]Tc-C225 in comparison to the extracellular distribution in A431 cells of 99mTc-pertechnetate was observed. Conclusion The investigation of the radiotoxic effect of [99mTc]Tc-C225 did not allow any conclusions about the radiosensitivity of the cell membrane under the given experimental conditions. For clarifying if the radiosensitivity of the cell membrane is comparable to the one of the nucleus DNA further experiments for the development of a [99mTc]Tc-labeled specific target for the cell membrane are necessary. On the basis of the dosimetric considerations of the FRTL-5 cells and A431 cells used as model systems it can be concluded that because of an insufficient accumulation a therapeutic radiotoxic effect of the Auger electrons is not realistic. Therefore the clinical use of 99mTc should be limited to the diagnostics. Nevertheless specific accumulated Auger electrons of 99mTc could be applied in the field of investigation as nano-tools for the subcellular analysis of radiotoxicity.

Radiofármacos são compostos radioativos que podem ser usados tanto para diagnóstico como para terapia. O radiofármaco 99m-Tc-MIBI é a formação de um complexo contendo o radionúclideo Tecnécium-99m e seis moléculas de Sestamibi, usado principalmente para cintilografias do miocárdio, sendo o procedimento mais realizado dentro da medicina nuclear, por consequência, o radiofármaco mais comercializado. Já o radiofármaco 99m-Tc-DTPA é composto também pelo mesmo radioisótopo e por uma molécula de ácido pentético, a qual tem característica de um quelante com afinidade pelos rins, por isso, é possível fazer avaliação do sistema renal. Como os radiofármacos são considerados medicamentos, estão sujeitos às mesmas normativas, logo o objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologia de doseamento destes insumos ativos antes da complexação com o radionuclídeo através da metodologia de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Dois métodos simples e eficientes foram desenvolvidos e validados para o MIBI em produto acabado e para a matéria-prima ácido pentético (DTPA), utilizando-se misturas de solvente orgânico e tampão. Os parâmetros de validação foram avaliados, obtendo resultados satisfatórios. Um teste de estabilidade para o radiofármaco MIBI em solução foi realizado e o resultado indicou uma preservação das características de aproximadamente 60 dias, e quando liofilizado de mais de 12 meses. Sendo assim, os métodos propostos foram considerados adequados para utilização na rotina da indústria farmacêutica. Como perspectivas, novas condições serão testadas para obter método de quantificação para o radiofármaco 99m-Tc-DTPA em produto acabado. / Radiopharmaceuticals are radioactive compounds that can be used for diagnostic and therapeutic purposes. Technetium (99mTc) sestamibi is a radiopharmaceutical including a coordination complex consisting of the radioisotope technetium-99m bound to six Sestamibi ligands, which is mainly used to image the myocardium via scintigraphy. This is the most common nuclear medicine procedure, making Technetium (99mTc) sestamibi the most commercialized radiopharmaceutical. Technetium (99mTC)-DTPA in turn is composed by the same radioisotope plus a molecule of Pentetic Acid, which, by its chelating properties, is used to scan renal system. As radiopharmaceuticals are regarded as drugs, they are subject to the same regulations; therefore, the objective of this study is to develop quantification methodology for these both active pharmaceutical ingredients before their complexation with the radioisotope by employing high-performance liquid chromatography (HPLC) methodology. Two simple, efficient methods were developed and validated for Sestamibi at its final form as well as for DTPA's raw material by using buffer and organic solvent mixtures. The validation parameters were evaluated with satisfactory results. A stability test was carried out for Sestamibi, indicating the preservation of characteristics for nearly 60 days, and for over 12 months when at its freezedryed form. The proposed methods were thus considered adequate for pharmaceutical industries. As perspectives, new conditions shall be tested to obtain a quantification method for Technetium (99mTC)-DTPA at its final form.

Radiofármacos são compostos radioativos que podem ser usados tanto para diagnóstico como para terapia. O radiofármaco 99m-Tc-MIBI é a formação de um complexo contendo o radionúclideo Tecnécium-99m e seis moléculas de Sestamibi, usado principalmente para cintilografias do miocárdio, sendo o procedimento mais realizado dentro da medicina nuclear, por consequência, o radiofármaco mais comercializado. Já o radiofármaco 99m-Tc-DTPA é composto também pelo mesmo radioisótopo e por uma molécula de ácido pentético, a qual tem característica de um quelante com afinidade pelos rins, por isso, é possível fazer avaliação do sistema renal. Como os radiofármacos são considerados medicamentos, estão sujeitos às mesmas normativas, logo o objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologia de doseamento destes insumos ativos antes da complexação com o radionuclídeo através da metodologia de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Dois métodos simples e eficientes foram desenvolvidos e validados para o MIBI em produto acabado e para a matéria-prima ácido pentético (DTPA), utilizando-se misturas de solvente orgânico e tampão. Os parâmetros de validação foram avaliados, obtendo resultados satisfatórios. Um teste de estabilidade para o radiofármaco MIBI em solução foi realizado e o resultado indicou uma preservação das características de aproximadamente 60 dias, e quando liofilizado de mais de 12 meses. Sendo assim, os métodos propostos foram considerados adequados para utilização na rotina da indústria farmacêutica. Como perspectivas, novas condições serão testadas para obter método de quantificação para o radiofármaco 99m-Tc-DTPA em produto acabado. / Radiopharmaceuticals are radioactive compounds that can be used for diagnostic and therapeutic purposes. Technetium (99mTc) sestamibi is a radiopharmaceutical including a coordination complex consisting of the radioisotope technetium-99m bound to six Sestamibi ligands, which is mainly used to image the myocardium via scintigraphy. This is the most common nuclear medicine procedure, making Technetium (99mTc) sestamibi the most commercialized radiopharmaceutical. Technetium (99mTC)-DTPA in turn is composed by the same radioisotope plus a molecule of Pentetic Acid, which, by its chelating properties, is used to scan renal system. As radiopharmaceuticals are regarded as drugs, they are subject to the same regulations; therefore, the objective of this study is to develop quantification methodology for these both active pharmaceutical ingredients before their complexation with the radioisotope by employing high-performance liquid chromatography (HPLC) methodology. Two simple, efficient methods were developed and validated for Sestamibi at its final form as well as for DTPA's raw material by using buffer and organic solvent mixtures. The validation parameters were evaluated with satisfactory results. A stability test was carried out for Sestamibi, indicating the preservation of characteristics for nearly 60 days, and for over 12 months when at its freezedryed form. The proposed methods were thus considered adequate for pharmaceutical industries. As perspectives, new conditions shall be tested to obtain a quantification method for Technetium (99mTC)-DTPA at its final form.

Radiofármacos são compostos radioativos que podem ser usados tanto para diagnóstico como para terapia. O radiofármaco 99m-Tc-MIBI é a formação de um complexo contendo o radionúclideo Tecnécium-99m e seis moléculas de Sestamibi, usado principalmente para cintilografias do miocárdio, sendo o procedimento mais realizado dentro da medicina nuclear, por consequência, o radiofármaco mais comercializado. Já o radiofármaco 99m-Tc-DTPA é composto também pelo mesmo radioisótopo e por uma molécula de ácido pentético, a qual tem característica de um quelante com afinidade pelos rins, por isso, é possível fazer avaliação do sistema renal. Como os radiofármacos são considerados medicamentos, estão sujeitos às mesmas normativas, logo o objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologia de doseamento destes insumos ativos antes da complexação com o radionuclídeo através da metodologia de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Dois métodos simples e eficientes foram desenvolvidos e validados para o MIBI em produto acabado e para a matéria-prima ácido pentético (DTPA), utilizando-se misturas de solvente orgânico e tampão. Os parâmetros de validação foram avaliados, obtendo resultados satisfatórios. Um teste de estabilidade para o radiofármaco MIBI em solução foi realizado e o resultado indicou uma preservação das características de aproximadamente 60 dias, e quando liofilizado de mais de 12 meses. Sendo assim, os métodos propostos foram considerados adequados para utilização na rotina da indústria farmacêutica. Como perspectivas, novas condições serão testadas para obter método de quantificação para o radiofármaco 99m-Tc-DTPA em produto acabado. / Radiopharmaceuticals are radioactive compounds that can be used for diagnostic and therapeutic purposes. Technetium (99mTc) sestamibi is a radiopharmaceutical including a coordination complex consisting of the radioisotope technetium-99m bound to six Sestamibi ligands, which is mainly used to image the myocardium via scintigraphy. This is the most common nuclear medicine procedure, making Technetium (99mTc) sestamibi the most commercialized radiopharmaceutical. Technetium (99mTC)-DTPA in turn is composed by the same radioisotope plus a molecule of Pentetic Acid, which, by its chelating properties, is used to scan renal system. As radiopharmaceuticals are regarded as drugs, they are subject to the same regulations; therefore, the objective of this study is to develop quantification methodology for these both active pharmaceutical ingredients before their complexation with the radioisotope by employing high-performance liquid chromatography (HPLC) methodology. Two simple, efficient methods were developed and validated for Sestamibi at its final form as well as for DTPA's raw material by using buffer and organic solvent mixtures. The validation parameters were evaluated with satisfactory results. A stability test was carried out for Sestamibi, indicating the preservation of characteristics for nearly 60 days, and for over 12 months when at its freezedryed form. The proposed methods were thus considered adequate for pharmaceutical industries. As perspectives, new conditions shall be tested to obtain a quantification method for Technetium (99mTC)-DTPA at its final form.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19175号 / 医博第4017号 / 新制||医||1010(附属図書館) / 32167 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 渡邊 直樹, 教授 松原 和夫, 教授 横出 正之 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Einleitung/ Zielstellung Zusätzlich zur Gammastrahlung emittiert 99mTc ca. 5 niederenergetische Auger-Elektronen mit Reichweiten von wenigen Nanometern im Gewebe. Diese haben für die nuklear-medizinische Diagnostik keine Bedeutung. Es wird jedoch über eine therapeutische Nutzung diskutiert, wofür eine Anreicherung der Auger-Elektronen-Emitter in einem strahlensensitiven Zellkompartiment erforderlich ist. Ziel der Arbeit war es, verschiedene [99mTc]Tc-Radiopharmaka hinsichtlich ihres Uptakeverhaltens, der subzellulärer Verteilung und des Retentionsverhaltens in vitro zu untersuchen, sowie die mutmaßlich durch den Auger-Effekt hervorgerufene Radiotoxizität der [99mTc]Tc-markierten Radiopharmaka zu vergleichen und die gewonnenen Ergebnisse in Hinblick auf potentielle extranukleäre strahlensensitive Targets zu interpretieren. Material und Methode Durchgeführt wurden die Versuche im ersten Abschnitt der Arbeit an Natrium-Iodid-Symporter (NIS)-positiven FRTL-5-Schilddrüsenzellen. Von [99mTc] Pertechnetat ([99mTc]TcO4-), [99mTc]TcO4- nach Vorinkubation von Perchlorat ([99mTc]TcO4-/ ClO4-), [99mTc]Tc-Hexakis-2-Methoxyisobutylisonitril ([99mTc]Tc-MIBI), [99mTc]Tc-Hexamethyl-Propylenaminoxim ([99mTc]Tc-HMPAO) und [99mTc]TcO4- nach Vorinkubation von Zinn-Pyrophosphat (Sn- PYP/ [99mTc]TcO4-) wurden die intrazelluläre Radio¬nuklid¬aufnahme und die subzelluläre Verteilung untersucht. Basierend auf den Ergebnissen dieser Versuche wurde die mittlere absorbierte Zellkerndosis kalkuliert. Zur Beurteilung der strahlenbiologischen Wirkung wurde das klonogene Zellüberleben mit der Anzahl residualer gH2AX-Foci (DNA-Schaden) verglichen und die Wirkung der [99mTc]Tc Tracer auf den Zellzyklus von FRTL-5-Zellen untersucht. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde an EGFR-positiven A431-Zellen die radiotoxische Wirkung in Abhängigkeit von der intra¬zellulären Lokalisation von [99mTc]Alexa(488)-C225-Cyclooctin-Dpa-Tc(CO)3 ([99mTc]Tc-C225), [99mTc]Tc-HMPAO und [99mTc]TcO4- auf das klonogene Zellüberleben untersucht. Ergebnisse und Diskussion Aufgrund verschiedener Uptakemechanismen zeigte jedes der untersuchten [99mTc]Tc-Radiopharmaka Unterschiede im zeitlichen Verlauf der Uptakekinetik. Durch Blockierung des NIS durch ClO4- konnte eine intrazelluläre Aufnahme von [99mTc]TcO4- verhindert werden, wogegen durch Vorinkubation mit Sn-PYP die zelluläre Aufnahme von [99mTc]TcO4- um das 22-fache gesteigert wurde. [99mTc]Tc-MIBI und [99mTc]Tc-HMPAO wurden aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften unabhängig vom NIS passiv in die Zelle transportiert. Die Untersuchung der intrazellulären Verteilung ergab für [99mTc]Tc-HMPAO und Sn-PYP/ [99mTc]TcO4- eine vergleichbar hohe Anreicherung in der Membran/Organellen-Fraktion sowie in der Zellkernfraktion. Von [99mTc]TcO4- und [99mTc]Tc-MIBI wurde die Hauptaktivität in der Zytosol-Fraktion und nur geringe Anteile in der Membran/Organellen-Fraktion sowie in der Zellkernfraktion nachgewiesen. In guter Übereinstimmung zur subzellulären Verteilung zeigten Sn-PYP/ [99mTc]TcO4- und [99mTc]Tc-HMPAO eine fast vollständige, hingegen [99mTc]Tc-MIBI und [99mTc]TcO4- nur eine geringe Retention. Aufgrund der genannten Unterschiede wurde bei gleicher inkubierter Aktivitätskonzentration folgende Reihenfolge der resultierenden Zellkerndosis ermittelt: [99mTc]TcO4- < [99mTc]Tc-MIBI < [99mTc]Tc-HMPAO < Sn-PYP/ [99mTc]TcO4-. [99mTc]TcO4- und [99mTc]Tc-HMPAO zeigten eine ähnliche Wirkung auf das klonogene Zellüberleben und auf den Zellzyklus. Jedoch bewirken sie eine wesentlich stärkere Reduzierung des Überlebens und einen stärkeren G2-Arrest als [99mTc]Tc-MIBI und Sn-PYP/ [99mTc]TcO4-, wobei [99mTc]Tc-MIBI bei allen drei untersuchten biologischen Endpunkten die geringste Wirkung zeigte. Bei einer vergleichbaren Reduktion des Zellüberlebens von [99mTc]TcO4- und [99mTc]Tc-HMPAO induzierte [99mTc]Tc-HMPAO lediglich die Hälfte der gH2AX-Foci im Vergleich zu [99mTc]TcO4-. Die trotz geringerem DNA-Schaden vergleichbare radiotoxische Wirkung zeigte, dass das klonogene Zellüberleben nicht allein vom DNA-Schaden abhängt. Daraus folgt, dass es außer der Kern-DNA noch weitere strahlensensitive Kompartimente gibt, die durch [99mTc]Tc-HMPAO stärker geschädigt wurden als von den anderen untersuchten [99mTc]Tc Tracern. Ein mögliches extranukleäres strahlensensitives Target ist die Zellmembran, so dass im zweiten Teil der Arbeit zur Überprüfung der Radiosensitivität der Zellmembran die radiotoxische Wirkung von [99mTc]Tc-C225 an EGFR-positiven A431-Zellen untersucht wurde. [99mTc]Tc-C225 wurde über den EGFR und [99mTc]Tc-HMPAO aufgrund seiner Lipophilie durch Diffusion intrazellulär aufgenommen. [99mTc]TcO4- dagegen zeigte keine intrazelluläre Aufnahme in die NIS-negativen Zellen und wurde als Referenz für eine extrazelluläre Bestrahlung verwendet. [99mTc]Tc-C225 wies nach einstündiger Inkubation eine Membranbindung von lediglich 10 % auf, die im Laufe von 24 h auf 1,9 % absank. Dies zeigte, dass [99mTc]Tc-C225 rasch in den A431-Zellen internalisiert wurde und dass nur bei sehr kurzen Inkubationszeiten von einer spezifischen Zellmembranmarkierung gesprochen werden kann. [99mTc]Tc-HMPAO ging keine Bindung an die Zellmembran ein. Weiterhin wurde bei der Inkubation steigender Aktivitäts- und Antikörperkonzentrationen von [99mTc]Tc C225 eine Sättigung des EGFR beobachtet, woraus eine wesentlich geringere Zellkerndosis als bei Inkubation von [99mTc]Tc-HMPAO resultierte. Im Vergleich des klonogenen Zellüberlebens zeigten [99mTc]Tc-C225 und [99mTc]Tc-HMPAO bei gleicher Zellkerndosis keine Unterschiede in der radiobiologischen Wirkung. Somit konnte lediglich eine Verstärkung der radiotoxischen Effekte von [99mTc]Tc-C225 an A431-Zellen im Vergleich zur ausschließlich extrazellulären Verteilung von [99mTc]TcO4- gezeigt werden. Schlussfolgerung Die Untersuchung der radiotoxischen Wirkung von [99mTc]Tc-C225 ermöglichte bei den angewendeten Versuchsbedingungen keine Rückschlüsse auf die Strahlensensitivität der Zellmembran. Weiterführende Arbeiten zur Entwicklung eines 99mTc-markierbaren spezifischen Membranmarkers wären notwendig, um klären zu können, ob die Zellmembran ein ähnlich strahlensensitives Target wie die nukleäre DNA ist. Dosimetrische Betrachtungen an den als Modellsystemen dienenden FRTL-5- und A431-Zellen deuten darauf hin, dass aufgrund ungenügender Anreicherung eine therapeutische Wirkung der Auger-Elektronen im Tumorgewebe eher unrealistisch ist. Damit sollte aus gegenwärtiger Sicht die klinische Anwendung von 99mTc auf den diagnostischen Einsatz beschränkt bleiben. Jedoch könnte 99mTc als Auger-Elektronen-Emitter bei spezifischer Anreicherung in definierten Zellkompartimenten als Nano-Tool zur Erforschung der Strahlensensitivität einzelner Zellbestandteile eingesetzt werden. / Introduction In addition to gamma radiation, 99mTc emits approximately 5 low energy Auger and internal conversion electrons per decay, resulting in high ionization density proximal to the radionuclide’s decay position. Low-energy Auger electrons with path lengths of only nanometers cannot be utilized for diagnostic procedures; however, they have frequently been discussed for therapeutic applications. To achieve a radiobiological effect, an intracellular accumulation and distribution in relevant cell compartments of the Auger electron emitter is required. Aim The aim of the thesis was the comparison of different [99mTc]Tc-labeled compounds concerning their intracellular uptake, subcellular distribution and retention in vitro. Furthermore the radiotoxicity caused by the Auger effect has to be investigated. Material and Methods The intracellular radionuclide uptake, subcellular distribution (ProteoExtract®-Kit) and retention of [99mTc] pertechnetate ([99mTc]TcO4-), [99mTc]TcO4- after pre-incubation of perchlorate ([99mTc]TcO4-/ClO4-), [99mTc]TcO4- after pre-incubation of stannous pyrophosphate ([99mTc]TcO4-/Sn-PYP), [99mTc]Tc-hexamethyl-propylene-aminoxime ([99mTc]Tc-HMPAO) and [99mTc]Tc-hexakis-2-methoxyisobutylisonitrile ([99mTc]Tc-MIBI) were quantified in sodium-iodide symporter (NIS)-positive rat thyroid FRTL-5 cells. Basing on these results the mean absorbed nucleus dose was calculated. Radiotoxicity was investigated using phosphorylated histone H2AX (gH2AX foci), clonogenic cell survival and cell cycle analyzes. Additionally the radiotoxicity of [99mTc]Alexa(488)-C225-Cyclooctin-Dpa-Tc(CO)3 ([99mTc]Tc-C225) was compared with the one of [99mTc]TcO4- and [99mTc]Tc -HMPAO depending on the subcellular distribution in EGFR-positive A431 cells. Results and Discussion For the analyzed [99mTc]Tc-labeled compounds we detected differences in the time courses of the uptake kinetics caused by different uptake mechanisms into the FRTL-5 cells. The radionuclide uptake of [99mTc]TcO4- was blocked in the presence of perchlorate and increased by a factor of approximately 22 after pre-incubation of Sn-PYP. The lipophilic complexes [99mTc]Tc-MIBI and [99mTc]Tc-HMPAO crossed the cell membrane through passive transport via diffusion. The compartmental analysis indicated that [99mTc]Tc-HMPAO and [99mTc]TcO4-/Sn-PYP revealed a comparable high uptake in the nucleus and in the membrane/organelle fraction. [99mTc]TcO4- and [99mTc]Tc-MIBI were preferentially distributed in the cytosol, with lower amounts of the accumulated activity in both the membranes/organelles and the nucleus compared with the other compounds. In good agreement with the subcellular distribution [99mTc]Tc-HMPAO, [99mTc]TcO4-/Sn-PYP showed a nearly complete retention and [99mTc]TcO4-, [99mTc]Tc-MIBI a low retention. Due to the differences mentioned above the following sequence of the calculated mean nucleus dose for identical activity concentrations was determined: [99mTc]TcO4- < [99mTc]Tc-MIBI < [99mTc]Tc-HMPAO < Sn PYP/ [99mTc]TcO4-. [99mTc]TcO4- and [99mTc]Tc-HMPAO caused a similar reduction of the cell survival and a dose dependent G2-arrest. [99mTc]Tc-MIBI and Sn-PYP/ [99mTc]TcO4- are both less radiotoxic in terms of the estimated nucleus dose compared with [99mTc]TcO4- and [99mTc]Tc-HMPAO. Despite the similar effect on the cell survival [99mTc]Tc-HMPAO induced only half of the residual gH2AX foci than [99mTc]TcO4-. These findings reveal that clonogenic cellular survival is not solely determined by the DNA-DSB response, which may suggest the involvement of extra-nuclear radiosensitive targets in cell inactivation. A possible extra-nuclear radiosensitive target is the cell membrane. That’s why the aim of the second part of the thesis is the investigation of the radiosensitivity of the cell membrane. Therefore the radiotoxic influence of [99mTc]Tc-C225 was analyzed at EGFR-positive A431 cells. [99mTc]Tc-C225 was taken up over the EGFR and the lipophilic [99mTc]Tc-HMPAO was transported via diffusion over the cell membrane. In contrast, [99mTc]TcO4- did not show any intracellular uptake into the NIS-negative cells and therefore was used as extracellular reference. An incubation of [99mTc]Tc-C225 for one hour resulted to a membrane binding of only 10 %, which was reduced to 1.9 % after 24 hours. This demonstrated a fast internalization into A431-cell. Therefore only in the case of a very short incubation time [99mTc]Tc-C225 leads to a specific targeting of the cell membrane. [99mTc]Tc-HMPAO did not bind to the cell membrane. Furthermore the incubation of increasing concentrations of activity and antibody resulted in a saturation of the EGFR, leading to a significant lower nucleus dose in comparison to the incubation of [99mTc]Tc-HMPAO. Concerning the clonogenic cell survival no differences in the radiotoxicity of [99mTc]Tc-C225 and [99mTc]Tc-HMPAO were observed for equal nucleus dose. Thus only an amplification of the radiotoxic effects of [99mTc]Tc-C225 in comparison to the extracellular distribution in A431 cells of 99mTc-pertechnetate was observed. Conclusion The investigation of the radiotoxic effect of [99mTc]Tc-C225 did not allow any conclusions about the radiosensitivity of the cell membrane under the given experimental conditions. For clarifying if the radiosensitivity of the cell membrane is comparable to the one of the nucleus DNA further experiments for the development of a [99mTc]Tc-labeled specific target for the cell membrane are necessary. On the basis of the dosimetric considerations of the FRTL-5 cells and A431 cells used as model systems it can be concluded that because of an insufficient accumulation a therapeutic radiotoxic effect of the Auger electrons is not realistic. Therefore the clinical use of 99mTc should be limited to the diagnostics. Nevertheless specific accumulated Auger electrons of 99mTc could be applied in the field of investigation as nano-tools for the subcellular analysis of radiotoxicity.