: Les grains de kéfir sont des ferments lactiques constitués d'une microflore complexe et diversifiée. Celle d'un grain de kéfir (KJ) a été caractérisée par une approche méthodologique classique d'isolements microbiens sur des milieux de culture sélectifs et, pour les bactéries lactiques, par une approche indépendante d'isolements bactériens par culture. Cette dernière consistait en l'analyse de la séquence des régions V1 et V2 de l'ADNr 16S, amplifiées à partir de l'ADN extrait du grain. La sensibilité de la méthode a été augmentée à cette occasion en dissociant les amplifications géniques des populations lactiques minoritaires et majoritaires du grain. La flore identifiée dans le grain KJ comprenait Acetobacter sp., Kazachstania exigua, Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lb. kefiri, Lb. parakefiri, Lactococcus lactis subsp. lactis et Leuconostoc mesenteroides, et était dépourvue de microcoques, de pédiocoques, de Weissella viridescens, de bactéries indicatrices de défauts d'hygiène, de Salmonella sp. et de Listeria monocytogenes. Dans le but de vérifier le caractère complet des espèces mises à jour, une reconstitution du grain à partir des micro-organismes qui en ont été isolés a été envisagée. Des conditions expérimentales favorables à la formation de grains dans un substrat lacté ont été recherchées à partir d'extraits du grain KJ renfermant un consortium microbien a priori complet. Ces essais de reconstitution n'ont pas conduit à la formation de grains de kéfir mais l'un d'eux a conduit à la formation de biofilms. Cet évènement a été reproduit dans du lait de façon répétable avec des consortiums reconstitués à partir des micro-organismes individuels isolés du grain KJ.

Lors des deux dernières décennies, Enterococcus faecalis a émergé comme une cause majeure d'infections nosocomiales. E. faecalis est une des rares bactéries presque complètement résistante à l'un des composés les plus importants et les plus répandus du système immunitaire inné : le lysozyme. C'est donc l'étude des causes de cette résistance qui nous a intéressé au cours de ce travail de thèse. Nous avons identifié deux gènes nommés EF0783 et EF1843, potentiellement impliqués dans la résistance au lysozyme. Les protéines codées par ces gènes partagent respectivement des homologies avec une O-acétyltransférase du peptidoglycane (OatA) de Staphylococcus aureus et une N-acétylglucosamine déacétylase (PgdA) de Streptococcus pneumoniae. Nous avons construit les mutants correspondants (DEF0783 et DEF1843) et le double mutant DEF0783-DEF1843. Nous avons montré que la mutation de EF0783 entraînait la perte des groupements O-acétyles du peptidoglycane ainsi qu'une diminution de la résistance au lysozyme. Par contre, aucun effet sur la résistance au lysozyme n'a été associé au gène EF1843. De plus, la délétion de EF0783 et/ou de EF1843 affecte significativement la capacité d'E. faecalis à survivre dans des macrophages murins. Bien que EF0783 soit effectivement impliqué dans la résistance au lysozyme, la Oacétylation et la dé-N-acétylation ne sont pas les principaux mécanismes conférant les hauts niveaux de résistance au lysozyme à E. faecalis. Des expériences pour identifier d'autres facteurs expliquant cette résistance au lysozyme sont à envisager.

Les bactéries jouent un rôle important dans le fonctionnement d'un écosystème aquatique et sont les joueurs clés de la boucle microbienne et du cycle du carbone. Le bactérioplancton est très abondant dans les lacs et les rivières et les récentes découvertes en biologie moléculaire ont démontré que ces communautés sont très diverses. Une question primordiale dans le domaine de l'écologie microbienne est comment la diversité de ces microorganismes est connectée à leur capacité métabolique et à leur activité dans l'environnement. Dans une communauté bactérienne, ce ne sont pas toutes les bactéries qui sont actives également et il y a une gamme continue d'activités des cellules mortes aux cellules hautement actives. Il est encore imprécis de dire que les différents états physiologiques sont associés à des taxa spécifiques ou si l'activité est distribuée de façon homogène à travers tous les taxa. Cette étude explore la connexion entre les états physiologiques et la composition taxonomique dans les communautés bactériennes de lacs. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur les cellules avec un contenu élevé et bas d'acides nucléiques et les cellules avec une membrane intacte ou endommagée. Dans le premier cas, le colorant nucléique Syto 13 permettra de différencier les cellules à haut et bas taux d'acides nucléiques. Pour l'intégrité des membranes cellulaires, celles-ci seront étudiées avec Baclight, un produit composé de deux colorants. Nous avons analysé les fractions en utilisant la cytométrie en flux et le triage cellulaire pour séparer physiquement les fractions bactériennes. Les échantillons ont été ensuite concentrés et l'ADN résultant a été extrait, amplifié et analysé en utilisant la DGGE. Les résultats montrent qu'il y a une différence entre la composition taxonomique et les différents états physiologiques, i.e. ce ne sont pas les mêmes espèces que l'on retrouve entre les cellules avec une membrane intacte et endommagée et entre les bactéries à haut taux ou bas taux d'acides nucléiques. Ces différences sont observées par la présence ou l'absence de bandes (DGGE) et plus souvent dans l'intensité des bandes. Ces résultats tentent de montrer qu'une connexion existe entre les états physiologiques et la composition taxonomique des communautés bactériennes, ce qui pourrait avoir des implications au niveau du fonctionnement et de la régulation de ces communautés. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Triage cellulaire, composition bactérienne, lacs, état physiologique, DGGE, bactérioplancton

Les communautés bactériennes aquatiques sont extrêmement sensibles et réactives aux gradients environnementaux. Il a été proposé que leur réponse résultent de changements dans leur structure, tels que la composition, la fonction ct la structure physiologique. L'objectif de cette thèse est de décrire les processus qui déterminent la réponse métabolique des communautés bactériennes face à des gradients dans les principales ressources, avec un intérêt particulier pour le rôle de la composition dans cette réponse. Les chapitres de cette thèse explorent dans un contexte de métacommunauté: Dans quelle mesure les ressources déterminent le métabolisme bactérien et leur structure, comment les composantes de la structure sont liées les unes aux autres, avec les ressources et la performance de la communauté, comment la composition des communautés est liée à la fonction, comment la plasticité métabolique et la redondance fonctionnelle influencent le rôle de la composition dans la réponse de la communauté. Ces différents aspects ont été explorés in situ dans divers écotones dans un bassin versant et par des expériences de transplantations en laboratoire. Spécifiquement, les objectifs sont (1) d'examiner si les patrons en termes du métabolisme et des composantes de la structure de la communauté présentent une certaine spécificité écosystémique (2) d'étudier le lien entre la composition et la fonction des communautés, (3) de décrire la séquence des relations entre les composantes de la structure des communautés qui médient la réponse de la communauté aux changements des ressources, (4) d'évaluer l'influence de la plasticité métabolique et redondance fonctionnelle sur le métabolisme en réponse aux changements environnementaux. Les résultats indiquent que la régulation du métabolisme bactérien par les ressources est médiée par des changements dans les composantes de la structure qui peuvent être soit directionnels, spécifiques aux écosystèmes, ou aléatoire. En fait, les résultats montrent que la réponse peut être médiée d'une part, par des ajustements physiologiques des phylotypes dominants ou par le remplacement même des phylotypes dominants. Le type de réponse n'apparaît pas être déterminé par le type, ni l'intensité des gradients, mais par la plasticité métabolique de la communauté, qui à son tour semble être déterminée par des facteurs indépendants des gradients eux-mêmes. Les résultats montrent que la composition et la fonction des communautés sont liées l'une à l'autre d'une manière très dynamique, tel que leurs patrons absolus ne sont pas corrélés. La force et la forme de la relation varient en fonction du type et de l'intensité des gradients, suggérant un haut niveau de redondance fonctionnelle tant au sein de la communauté, qu'au sein de la métacommunauté, à partir de laquelle les phylotypes sont sélectionnés pour occuper les nouvelles niches créées le long des écotones. Les résultats des expériences de transplantations indiquent: L'existence d'un seuil environnemental qui détermine le niveau de redondance fonctionnelle, et une spécificité écosystémique dans la plasticité métabolique. Collectivement, les résultats de cette thèse montrent que les conditions environnementales locales ont une plus grande influence sur la structure de la communauté que la dispersion, et que la composition des communautés bactériennes joue toujours un rôle dans cette réponse en déterminant le niveau de plasticité de la communauté, mais que ce rôle n'est qu'apparent lorsque la réponse implique un remplacement des phylotypes dans les communautés qui sont intrinsèquement moins plastiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : bactérioplancton, gradients environnementaux, métabolisme du carbone, structure des communautés, métacommunauté.

Si l'augmentation du potentiel de corrosion libre des aciers inoxydables est avérée en eau de mer naturelle, l'aspect systématique de ce phénomène n'a pas encore été démontré en eau de rivière naturelle. Cette évolution du comportement électrochimique est due à la colonisation de la surface par des microorganismes induisant des modifications des processus cathodiques. Deux mécanismes enzymatiques différents sont proposés dans la littérature, l'un développé en eau de mer et fondé sur la production enzymatique de peroxyde d'hydrogène et d'acidité au sein du biofilm, et l'autre développé en eau de rivière et basé sur la déposition d'oxydes de manganèse à la surface du matériau. L'objectif de ce travail a été de confirmer le caractère systématique de l'augmentation du potentiel de corrosion libre et de mettre en évidence le (ou les) mécanisme(s) à l'origine de cette évolution, ainsi que de déterminer l'influence de l'adhésion du biofilm. Pour cela, des mesures électrochimiques, ainsi que des observations et des analyses de surface, ont été réalisées à la fois in situ au cours d'expériences dans la Seine à l'aide d'un dispositif original d'immersion, et en laboratoire lors d'expériences d'adhésion sur acier inoxydable à l'aide de souches microbiennes sauvages provenant de prélèvements de flore sessile dans la Seine.<br />Les résultats expérimentaux prouvent que les deux mécanismes évoqués dans la littérature peuvent avoir lieu dans un même cours d'eau et mener à des évolutions du comportement électrochimique comparables. Le modèle de production de peroxyde d'hydrogène par la glucose-oxydase, générant un milieu oxydant et acide, a été adapté au cas de l'eau de rivière artificielle. Il permet de reproduire les variations du potentiel de corrosion libre et des réactions cathodiques mais peut différer de l'eau de rivière naturelle du point de vue de la composition chimique et de la structure électronique du film passif. Enfin, l'étude des phénomènes de bioadhésion a montré la difficulté d'obtenir en laboratoire un biofilm électrochimiquement actif.

La qualité de présentation d'une pomme de terre de consommation, Solanum tuberosum L., commercialisée en produit frais est devenue une exigence et un enjeu économique significatif dans les relations commerciales. Compte tenu du mode de reproduction par voie végétative de cette espèce, ces exigences sont également imposées au tubercule de semence. Organe de réserve et de propagation, le tubercule est produit sous terre, ce qui l'expose aux microorganismes telluriques et le rend potentiellement porteur d'altérations superficielles dont l'origine n'est pas encore clairement identifiée pour certaines d'entre elles. L'objectif de ce travail est de recenser et de caractériser ces altérations superficielles du tubercule et d'en déterminer les causes. Après l'établissement d'une nomenclature et d'une classification consensuelles des défauts observables sur tubercule, deux hypothèses ont été formulées et testées: (1) les défauts sont d'origine pathogène et/ou (2) ils résultent d'une réponse de la plante à des stress environnementaux. L'évaluation de la première hypothèse a mené à l'identification d'une grande diversité de microorganismes vivant à la surface des tubercules altérés. Leur pouvoir pathogène a été testé par une série de tests biologiques. Ceux-ci ont permis de reproduire les défauts sur des tubercules néoformés et de vérifier les postulats de Koch pour le champignon Rhizoctonia solani responsable de la formation de sclérotes. Pour bon nombre d'autres défauts visuels, aucune relation claire entre un microorganisme et une altération n'a pu être établie. Une étude de la structure des communautés microbiennes de la géocaulosphère de tubercules, altérés ou non, a démontré que les communautés fongiques et bactériennes se comportaient selon des dynamiques différentes au cours de la culture et en fonction de l'état sanitaire du tubercule de semence mais aucune relation de causalité n'a pu être mise en évidence. Il a par contre été noté une augmentation de la population de R. solani autour des tubercules altérés. La diversité des isolats d'origine française et européenne associés aux altérations des tubercules a donc été caractérisée. Elle révèle l'existence de relations phylogénétiques indépendantes de l'origine géographique et du cultivar hôte et suggère l'existence de d'événements génétiques fréquents et d'un brassage génétique entre les populations de R. solani. Le test de la seconde hypothèse a consisté à rechercher une implication potentielle de différents facteurs abiotiques dans la formation des altérations superficielles. L'analyse d'une enquête menée auprès d'agriculteurs a mis en évidence l'implication du pH, de certaines pratiques culturales, de la sensibilité de cultivars et de conditions météorologiques particulières dans l'occurrence de certains défauts. Ce travail a permis de clarifier la nomenclature des altérations, de confirmer l'implication de R. solani dans l'apparition de certaines d'entre elles et d'envisager de nouvelles hypothèses quant à la formation de défauts suite à une réponse de la plante à un stress environnemental. Ainsi, une voie a été ouverte vers la résolution de la problématique posée par toute une filière professionnelle, responsable de la mise en marché d'un produit frais de grande consommation, et répondant aux exigences du marché en matière de présentation, qualité culinaire et, mode de production respectueux de l'environnement.

Les microorganismes jouent un rôle prépondérant dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques, où ils sont à la base de la minéralisation et du recyclage de la matière organique. Les" vrais " champignons, ou Eumycètes, font partie de ces microorganismes hétérotrophes qui permettent le renouvellement de la matière organique dans les écosystèmes. Pourtant, la diversité et l'importance quantitative et fonctionnelle des champignons restent très largement méconnues dans les milieux pélagiques. Récemment, l'utilisation de méthodes moléculaires pour étudier la diversité des picoeucaryotes (de taille < 5 μm) lacustres a mis en évidence l'importance des champignons microscopiques avec, notamment, la présence de chytridiomycètes (chytrides). Cette découverte, en conjonction avec le rôle important connu des Eumycètes dans d'autres écosystèmes naturels, nous a amené à poser l'hypothèse d'une diversité et d'un rôle fonctionnel importants des champignons dans les écosystèmes pélagiques. Ce travail vise à préciser la diversité globale, la structure génétique et l'importance quantitative des différentes divisions du règne des Eumycota dans les écosystèmes pélagiques lacustres, et à proposer des outils méthodologiques pour l'étude écologique de ces peuplements. La diversité phylogénétique et l'importance des champignons de taille comprise entre 0,6 et 150 μm ont été analysées dans trois milieux pélagiques différents. Une étude de clonage-séquençage de l'ADNr 18S et de l'ITS a été réalisée au printemps 2007 dans les lacs Pavin (oligomésotrophe), Aydat (eutrophe) et Vassivière (mésotrophe, humique). L'affiliation phylogénétique des séquences a permis, non seulement de confirmer la présence d'une importante diversité de chytridiomycètes parasites du phytoplancton, mais aussi de mettre en évidence la présence non négligeable d'ascomycètes et de basidiomycètes, potentiellement saprophytes. L'étude de la dynamique saisonnière de la structure des peuplements (par TRFLP) et de l'importance quantitative de différentes divisions (par PCR quantitative) de la communauté fongique ont permis de déceler des différences en fonction des saisons et de l'écosystème. Ces différences ont été reliées à la dynamique des peuplements phytoplanctoniques, avec une influence des apports allochtones, principalement dans le lac eutrophe d'Aydat. De plus, les séquences moléculaires générées au cours de ces dernières années ont permis l'élaboration d'amorces ciblant des clades de champignons microscopiques d'intérêt, pour une étude écologique de la dynamique des peuplements, par des approches PCR à temps réel et FISH (fluorescent in situ hybridization). Enfin, nous considérons que l'acquisition de données complémentaires permettra d'intégrer les champignons saprophytes et parasites dans les flux de matière et d'énergie qui transitent par les écosystèmes pélagiques et les cycles biogéochimiques associés.

L‟eutrophisation croissante des écosystèmes aquatiques favorise le développement des cyanobactéries, parmi lesquelles Microcystis est la plus représentée dans les régions tempérées. La capacité de Microcystis à produire une puissante hépatotoxine, la microcystine, est à l‟origine de diverses perturbations écologiques, et de nombreuses nuisances sanitaires. La compréhension des facteurs déterminant la toxicité des efflorescences de Microcystis constitue, de fait, un enjeu majeur des recherches actuelles. Dans ce contexte, l‟objectif premier de ce travail de thèse était d‟étudier la variabilité temporelle et l‟implication potentielle de la toxicité de Microcystis à l‟échelle de son cycle de développement annuel. Pour cela, il était nécessaire de considérer, en particulier, les parties les moins connues du cycle de développement : la phase de survie benthique, et les transitions entre les phases benthique et planctonique, via les processus de recrutement et de sédimentation. Nous avons alors étudié le potentiel toxique des populations de Microcystis grâce à des approches complémentaires menées à différentes échelles spatio-temporelles, en considérant à la fois les gènes impliqués dans la synthèse de microcystines, leur transcription et les concentrations en microcystines. Cette étude s‟est appuyée, en parallèle, sur la caractérisation de la structure génétique des populations de Microcystis dans les compartiments benthique et planctonique. La prise en compte systématique de la phase de vie benthique a tout d‟abord permis d‟améliorer nos connaissances sur cette phase du cycle de développement de Microcystis. Ainsi, Microcystis peut survivre plusieurs années en profondeur dans les sédiments, sans que les populations ne perdent leur potentiel toxique, ou que leur structure génétique soit altérée. En revanche, en surface des sédiments, le potentiel toxique et la structure génétique des populations sont variables, de manière similaire à ce qui peut être observé dans la colonne d‟eau. Enfin, ces travaux ont également mis en évidence l‟influence des phases de transition entre l‟eau et les sédiments dans la variabilité du potentiel toxique et de la structure génétique des populations de Microcystis. Les processus de recrutement benthique et de sédimentation occasionnent, en effet, une sélection génétique, qui, bien que paraissant indépendante du potentiel toxique des génotypes, peut grandement affecter le potentiel toxique des sous-populations benthiques et planctoniques de Microcystis.

Les biofilms constituent un mode de vie microbien extrêmement répandu, aussi bien en milieu naturel que dans les environnements anthropisés. Dans ce dernier cas, les structures morphologique et microbiologique du biofilm vont conditionner son impact sur le système, que cet impact lui soit bénéfique ou préjudiciable. L'objectif de cette thèse est d'approfondir notre connaissance des phénomènes de structuration du biofilm afin, à terme, d'optimiser les performances de procédé. Afin de représenter au mieux les conditions industrielles, des régimes d'écoulement turbulents et des consortia microbiens complexes ont été utilisés. Une première partie se focalise sur l'impact des forces de cisaillement sur l'adhésion microbienne. Les résultats démontrent un changement progressif de la flore bactérienne fixée et de sa distribution spatiale. Dans un second temps, le projet s'est intéressé aux étapes de développement du biofilm et ont permis d'identifier un effet mémoire du biofilm mature. Il s'agit d'une conservation des structures morphologique et microbiologique au cours du temps en dépit d'un changement de régime hydrodynamique. Enfin la dernière partie a consisté en la mise au point d'une méthode de quantification des prédateurs mobiles dans les biofilms. Ces prédateurs participent à la structuration du biofilm et leur quantification peut s'avérer utile dans le contexte de l'épuration des eaux. / Biofilms are a biological mode of life widely spread in both natural and engineered environments. In the last case, whether the biofilm is beneficial or detrimental for the process under consideration, both morphology and microbial community of the biofilm determine its impact. The objective of this thesis is to deepen our knowledge of biofilm structuring and, as a further goal, optimize a given process. Turbulent flows and multi-species consortia were used in order to better mimic industrial conditions. The first part of the project focused on the impact of shear stress on microbial adhesion. Results have demonstrated a gradual shift in bacterial communities with shear and a change in the spatial distribution of adhered microorganisms. Secondly, the work dealt with biofilm development. A memory effect, defined as the conservation of initial morphological and microbiological features despite a change in the environmental conditions, has been observed. Finally, a method for quantification of moving predators in mature biofilms has been developed. These predators actively shape the biofilm and their quantification is valuable, especially for wastewater treatment.

L’électrosynthèse microbienne est une technologie innovante qui permet de convertir le dioxyde de carbone en molécules organiques en utilisant une cathode comme source d’électrons de la réduction microbienne du CO2. Le procédé «Biorare» propose de coupler l’électrosynthèse microbienne avec l’oxydation de déchets à l’anode afin d’augmenter le rendement énergétique du procédé. Il devient ainsi possible de traiter un effluent à l’anode et de valoriser du CO2 à la cathode. La thèse a eu pour objectif d’améliorer les performances de la bioanode et de la biocathode séparément, afin de réaliser in fine un prototype de procédé «Biorare» à l’échelle du laboratoire. Parmi plusieurs types de déchets testés, les boues biologiques se sont avérées bien adaptées pour une utilisation à l’anode en assurant des densités de courant jusqu’à 10 A/m2. Toutefois, ces performances étant peu reproductibles, nous avons choisi d’exploiter des biodéchets, dont le gisement représente plus de 22 millions de tonnes en France et la valorisation est aujourd’hui obligatoire. Leur utilisation brute n’a pas permis de dépasser 1 A/m2 mais une méthode innovante de formation des bioanodes a permis d’augmenter les densités de courant jusqu’à 7 A/m2, de façon reproductible et dans des conditions extrapolables. Les travaux sur les biocathodes ont révélé que l’hydrogène est un intermédiaire réactionnel clé pour le transfert d’électrons de la cathode vers les microorganismes qui réduisent le CO2. Cela a conduit à découpler le procédé initial en deux étapes : l’hydrogène est produit dans une cellule d’électrolyse microbienne qui oxyde les biodéchets et, en aval, un bioréacteur gaz-liquide utilise l’hydrogène pour convertir le CO2 en acétate, éthanol, formiate, ou butyrate, suivant les systèmes microbiens. Cette stratégie permet d’augmenter les performances d’un facteur 24 avec une vitesse de production d’acétate de 376 mg/L/j et des concentrations jusqu’à 11 g/L. / Microbial electrosynthesis is an innovative technology to produce organic molecules from CO2, using a cathode as electron source for the microbial reduction of CO2. The Biorare process intends to associate the microbial electrosynthesis with the oxidation of organic wastes at the anode, in order to increase the energetic yield of the process. The system allows thus both the treatment of polluted effluents at the anode and CO2 valorization to organic molecules at the cathode. The purpose of the PhD work was to improve the bioanode and biocathode performance separately, to finally design a Biorare prototype at laboratory scale. Among the various wastes tested, biological sludge was a good substrate, which led to current densities up to 10 A/m2. However, the performance was not reproducible and it was decided to use food wastes, which constitute an abundant resource of 22 million tons in France that must be valorized. The use of raw food waste did not allow exceeding 1 A/m2, but a new method for bioanode formation improved the current density up to 7 A/m2 in a reproducible and close-to-industrial way. The study on biocathodes revealed hydrogen as a key intermediate in electron transfer from the cathode to the microbial cells that reduce CO2. This led to dissociate the initial process into two steps: hydrogen is produced in a microbial electrolysis cell that oxidizes food wastes and, downstream, a gas-liquid bioreactor uses hydrogen to convert CO2 to acetate, ethanol, formate or butyrate, depending on the microbial system. This strategy allowed increasing the performance by a factor 24 with a maximal acetate production rate of 376 mg/L/j and concentrations up to 11 g/L.