Yes / Background Buruli ulcer (BU) is an infectious disease caused by Mycobacterium ulcerans and considered the third most prevalent mycobacterial disease in humans. Secondary bacterial infections in open BU lesions are the main cause of pain, delayed healing and systemic illness, resulting in prolonged hospital stay. Thus, understanding the diversity of bacteria, termed the microbiome, in these open lesions is important for proper treatment. However, adequately studying the human microbiome in a clinical setting can prove difficult when investigating a neglected tropical skin disease due to its rarity and the setting. Methodology/Principal findings Using 16S rRNA sequencing, we determined the microbial composition of 5 BU lesions, 3 non-BU lesions and 3 healthy skin samples. Although no significant differences in diversity were found between BU and non-BU lesions, the former were characterized by an increase of Bacteroidetes compared to the non-BU wounds and the BU lesions also contained significantly more obligate anaerobes. With this molecular-based study, we were also able to detect bacteria that were missed by culture-based methods in previous BU studies. Conclusions/Significance Our study suggests that BU may lead to changes in the skin bacterial community within the lesions. However, in order to determine if such changes hold true across all BU cases and are either a cause or consequence of a specific wound environment, further microbiome studies are necessary. Such skin microbiome analysis requires large sample sizes and lesions from the same body site in many patients, both of which can be difficult for a rare disease. Our study proposes a pipeline for such studies and highlights several drawbacks that must be considered if microbiome analysis is to be utilized for neglected tropical diseases.

In this project, an outgrowth and optical density (OD) measurement step was developed and validated for an established protocol for antibiotic treatment of Anopheles stephensi mosquitoes. This step allows the elimination of uncleared mosquitoes from experimental pools. Our findings suggest that, as previously demonstrated, antibiotic treatment reduced the mosquito microbiome to an extent, as evidenced by decreased bacterial growth observed through OD readings of our experimental samples. Additionally, qPCR analysis of 16S abundance provided quantitative data on bacterial abundance, which further supported the effectiveness of antibiotic treatment. Finally, a comparison of mosquito samples pooled randomly or with high OD individuals removed showed a significant improvement in bacterial clearance in samples with our refinement step included. The method established here can generate experimental samples for third-generation sequencing with minimal bacterial contamination for robust hypothesis testing. The addition of OD measurement is a rapid, cost-effective step that can potentially improve hypothesis testing on large pools of samples. This study contributes to our understanding of the impact of antibiotic treatment on mosquito microbiomes. Improvements in molecular and bench-level techniques can greatly contribute to our ability to gain insights into the role of microbes in mosquito biology.

付記する学位プログラム名: 社会を駆動するプラットフォーム学卓越大学院プログラム / 京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第25317号 / 農博第2583号 / 新制||農||1104(附属図書館) / 京都大学大学院農学研究科森林科学専攻 / (主査)教授 北島 薫, 教授 小野田 雄介, 教授 井鷺 裕司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

The oral microbiome is a key component of the human body and has been associated with several habits and diseases. Despite its important role in health, it remains relatively understudied, compared to the gut microbiome. To deepen our understanding of the oral microbiome and its links to host conditions, the main aim of my PhD thesis was to characterize the lifestyle, environmental and genetic determinants of the salivary microbiome using data from CHRISMB, a convenience sample within the Cooperative Health Research in South Tyrol (CHRIS) study. With more than 1,900 samples, CHRISMB is one of the largest salivary microbiome data resources in the world. First, I studied the association between the salivary microbiome and smoking status and degree of exposure both from the compositional and predicted metabolism perspective. I found associations with 44 genera, 11 of which were also proportionally affected by the degree of exposure to tobacco. Intriguingly, these associations highlight a novel role of salivary microbiome metabolism in cardiovascular diseases through periodontium degeneration via the nitrate reduction and extracellular matrix degradation pathways. My second contribution focused on the role of geography, family relatedness, and genetics in shaping CHRISMB diversity. I investigated the associations between household, municipality and altitude of residence, heritability, and genetic marker associations (mbGWAS). I confirmed that cohabitation is a strong driver of microbiome similarity, while municipality and altitude of residence did not show strong associations. Siblings living apart had a more similar microbiota than unrelated and non-cohabiting individuals. Sixteen out of 142 taxa had a significant heritability component, while 34 had a significant household component. A mbGWAS Gene-level analysis resulted in one association between rare variants in the SRFBP1 and LOX genes locus and Selenomonas noxia. This work confirmed that host genetics and familial relationships has a modest but significant association with the salivary microbiome composition and that the environment and lifestyle are strongly associated. In summary, this thesis deepens our understanding of population-level factors associated with salivary microbiome variability, which can help design future hypothesis driven studies.

Le microbiome intestinal humain est une importante communauté de microorganismes, spécifique aux individus et aux populations, dont la composition est influencée par de nombreux facteurs, tels que la génétique et les habitudes de vie de son hôte. La diète est cependant un élément majeur façonnant sa structure. Les influences de plusieurs diètes humaines sur le microbiome ont été largement investiguées. Toutefois, l’impact des variations saisonnières inhérentes à certaines diètes est peu connu. La diète traditionnelle inuite est un exemple de régime alimentaire riche en graisses et protéines animales qui varie temporellement en fonction de la disponibilité saisonnière des ressources. Afin d’étudier les dynamiques temporelles du microbiome intestinal inuit en réponse à la diète traditionnelle, des échantillons de papier hygiénique contenant des selles ont été récoltés auprès d’un groupe de volontaire Inuits du Nunavut (Canada) durant huit mois. Un groupe contrôle de Montréalais (Québec, Canada) de descendance européenne, consommant une diète typiquement occidentale, a également été sollicité. La diversité et la composition du microbiome ont été caractérisées par le séquençage de la région V4 de l’ARNr 16s. Les microbiomes obtenus par un échantillonnage de papier hygiénique et de selles ont été comparés. Ces deux méthodes offrent des représentations similaires mais non-identiques du microbiome intestinal. À partir du séquençage d’échantillons de papier hygiénique, nous avons trouvé que les variations inter-individuelles du microbiome sont plus importantes que les variations intra-individuelles au sein de Montréal et du Nunavut. Des différences significatives de la composition du microbiome s’expliqueraient par la consommation différentielle de certains groupes alimentaires. Bien qu’aucune différence saisonnière marquée n’ait été observée, en termes de composition, le microbiome fluctue davantage à travers le temps chez les individus inuits. Ces résultats suggèrent que le microbiome inuit pourrait être façonné par une diète plus variable. Ensemble, nos résultats suggèrent que la diète traditionnelle a encore un impact important sur la composition, la diversité et la stabilité de microbiome inuit, malgré les transitions alimentaires vécues au Nunavut. / The human gut microbiome represents a diverse microbial community specific to individuals and populations, which is heavily influenced by factors such as genetics and lifestyle. Diet is a major force shaping the gut microbiome, and the effects of dietary choices on microbiome composition have been thoroughly investigated. It has been shown that a change in diet also changes the gut microbiome, but the effects of seasonal diets are poorly known. The traditional Inuit diet is primarily based on animal products, which vary seasonally based on prey availability. To investigate the dynamics of the Inuit diet over time, we collected gut microbiome samples from Inuit volunteers living in Resolute Bay (Nunavut, Canada), and compared them to samples collected from individuals of European descent living in Montréal (Québec, Canada) and consuming a typical Western diet. We sequenced the V4 region of the 16S rRNA gene to characterize the diversity and composition of the Inuit microbiome, and surveyed differences among samples collected with toilet paper or from stool. Our results show that these sampling methods provide similar, but non-identical portraits of the microbiome. Based on sequencing from toilet paper samples alone, we found that inter-individual variations of the microbiome community composition were greater than within-individual variations, both in Nunavut and Montreal, with significant differences in microbiome explained by dietary preferences. No defined seasonal shift of microbiome composition was detected in samples collected over time. However, within-individual microbial diversity fluctuated more with time in Nunavut than in Montreal. Together, these results underline that the traditional Inuit diet still has an important impact on the composition, diversity and stability of the Inuit gut microbiome, even if the traditional seasonality of the diet is less pronounced than expected, due to an increasingly westernized diet in Nunavut.

Les écosystèmes dunaires remplissent plusieurs fonctions écologiques essentielles comme celle de protéger le littoral grâce à leur capacité d’amortissement face aux vents et vagues des tempêtes. Les dunes jouent aussi un rôle dans la filtration de l’eau, la recharge de la nappe phréatique, le maintien de la biodiversité, en plus de présenter un attrait culturel, récréatif et touristique. Les milieux dunaires sont très dynamiques et incluent plusieurs stades de succession végétale, passant de la plage de sable nu à la dune bordière stabilisée par l’ammophile à ligule courte, laquelle permet aussi l’établissement d’autres herbacées, d’arbustes et, éventuellement, d’arbres. Or, la survie de ces végétaux est intimement liée aux microorganismes du sol. Les champignons du sol interagissent intimement avec les racines des plantes, modifient la structure des sols, et contribuent à la décomposition de la matière organique et à la disponibilité des nutriments. Ils sont donc des acteurs clés de l’écologie des sols et contribuent à la stabilisation des dunes. Malgré cela, la diversité et la structure des communautés fongiques, ainsi que les mécanismes influençant leur dynamique écologique, demeurent relativement méconnus. Le travail présenté dans cette thèse explore la diversité des communautés fongiques à travers le gradient de succession et de conditions édaphiques d’un écosystème dunaire côtier afin d’améliorer la compréhension de la dynamique des sols en milieux dunaires. Une vaste collecte de données sur le terrain a été réalisée sur une plaine de dunes reliques se trouvant aux Îles de la Madeleine, Qc. J’ai échantillonné plus de 80 sites répartis sur l’ensemble de ce système dunaire et caractérisé les champignons du sol grâce au séquençage à haut débit. Dans un premier temps, j’ai dressé un portait d’ensemble des communautés fongiques du sol à travers les différentes zones des dunes. En plus d’une description taxonomique, les modes de vie fongiques ont été prédits afin de mieux comprendre comment les variations au niveau des communautés de champignons du sol peuvent se traduire en changements fonctionnels. J’ai observé un niveau de diversité fongique élevé (plus de 3400 unités taxonomiques opérationnelles au total) et des communautés taxonomiquement et fonctionnellement distinctes à travers un gradient de succession et de conditions édaphiques. Ces résultats ont aussi indiqué que toutes les zones des dunes, incluant la zone pionière, supportent des communautés fongiques diversifiées. Ensuite, le lien entre les communautés végétales et fongiques a été étudié à travers l’ensemble de la séquence dunaire. Ces résultats ont montré une augmentation claire de la richesse spécifique végétale, ainsi qu’une augmentation de la diversité des stratégies d’acquisition de nutriments (traits souterrains lié à la nutrition des plantes, soit mycorhizien à arbuscule, ectomycorhizien, mycorhizien éricoide, fixateur d’azote ou non spécialisé). J’ai aussi pu établir une forte corrélation entre les champignons du sol et la végétation, qui semblent tous deux réagir de façon similaire aux conditions physicochimiques du sol. Le pH du sol influençait fortement les communautés végétales et fongiques. Le lien observé entre les communautés végétales et fongiques met l’emphase sur l’importance des interactions biotiques positives au fil de la succession dans les environnements pauvres en nutriments. Finalement, j’ai comparé les communautés de champignons ectomycorhiziens associées aux principales espèces arborescentes dans les forêts dunaires. J’ai observé une richesse importante, avec un total de 200 unités taxonomiques opérationnelles ectomycorhiziennes, appartenant principalement aux Agaricomycètes. Une analyse de réseaux n’a pas permis de détecter de modules (c'est-à-dire des sous-groupes d’espèces en interaction), ce qui indique un faible niveau de spécificité des associations ectomycorhiziennes. De plus, je n’ai pas observé de différences en termes de richesse ou de structure des communautés entre les quatre espèces hôtes. En conclusion, j’ai pu observer à travers la succession dunaire des communautés diversifiées et des structures distinctes selon la zone de la dune, tant chez les champignons que chez les plantes. La succession semble toutefois moins marquée au niveau des communautés fongiques, par rapport aux patrons observés chez les plantes. Ces résultats ont alimenté une réflexion sur le potentiel et les perspectives, mais aussi sur les limitations des approches reposant sur le séquençage à haut-débit en écologie microbienne. / Coastal dunes provide several key ecosystem services, such as erosion mitigation and protection of the littoral by forming a barrier against wind and wave action. These ecosystems also importantly contribute to water filtering, groundwater replenishment, maintenance of biodiversity, and have a cultural, aesthetic and recreational importance. Dune ecosystems are highly dynamic and characterized by stark ecological successional gradients. The sequence of plant communities along the gradient extends from upper beach to the foredune stabilized by pioneer species such as beach grass, which facilitates the establishment of other herbs, shrubs and eventually, trees. Plant growth and survival can be limited by environmental factors such as wind, salinity, drought and nutrient deficiency, and is therefore strongly linked to the presence of soil microorganisms. Soil fungi in particular are important plant symbionts and major regulators of organic matter decomposition, nutrient cycling and soil structure. Hence, they are key drivers of soil and vegetation dynamics, as well as important contributors to dune stabilisation. Still, the diversity and structure of soil fungal communities, as well as the mechanisms responsible for their ecological dynamic, remain incompletely understood. In this thesis, I aimed to characterize fungal communities along a successional and edaphic gradient in a coastal dune in order to improve our understanding of soil dynamics in sand dunes ecosystems. I performed a comprehensive sampling of soils and aboveground vegetation at over 80 sites on a relic foredune plain. Soil fungi were characterized using high-throughput sequencing. A general description of soil fungal communities across dune zones was produced and, in addition to a taxonomic description, I assigned putative roles to all fungal genera to determine how variations in fungal community can be translated in functional changes. I recorded high level of fungal diversity (over 3400 operational taxonomic units) and described distinct communities along the successional and edaphic gradient. These results demonstrated the presence of taxonomically and functionally diverse communities across the dune sequence, including in the barren foredunes. I also investigated the links between plant and fungal communities across the edaphic and successional gradient. These results showed a clear increase in plant species richness, as well as in the diversity of nutrient-acquisition strategies (belowground trait related to plant nutrition: arbuscular mycorrhizal, ectomycorrhizal, ericoid mycorrhizal, nitrogen-fixing or unspecialized). I also found a very strong correlation between aboveground vegetation and soil fungal communities, which both responded to soil physicochemical properties. Soil pH importantly shaped plant and fungal communities, and could act as an important environmental filter along this relic foredune plain. The coordinated changes in soil microbial and plant communities highlight the importance of aboveground-belowground linkages and of positive biotic interactions during ecological succession in nutrient-poor environments. Finally, I compared the ectomycorrhizal fungal communities associated with four co-occuring tree species in the forested zone of the relic foredune plain. High ectomycorrhizal fungal richness was observed across the four hosts, with a total of 200 ectomycorrhizal operational taxonomic units, mainly belonging to the Agaricomycetes. Network analysis did not detect modules (i.e. subgroups of interacting species), indicating a low level of specificity in these ectomycorrhizal associations. In addition, there were no differences in ectomycorrhizal diversity or community structure among the four tree species. To conclude, I was able to describe diverse communities and distinct community structures across the dune sequence, for both plants and fungi. Succession however seemed less pronounced in fungal communities compared to patterns observed in plants. These results fueled a reflection on the potential and perspectives, as well as the limitations, of high-throughput sequencing approaches in the field of microbial ecology.

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Abstract Incidence of esophageal adenocarcinoma is rising rapidly in Western countries. The main risk factor for esophageal adenocarcinoma is Barrett’s esophagus. Barrett’s esophagus results from long-term gastroesophageal reflux disease. The gastrointestinal tract is colonized by bacteria, fungi and viruses forming the alimentary tract microbiome. Microbiome transformation is involved in pathogenesis of alimentary tract cancer and also in the development of Barrett’s metaplasia. Toll-like receptors (TLR) are molecules of the innate immune system and they are involved in bacterial and viral recognition and regulation of immune functions in the host and cancer cells. This thesis examined the effect of alimentary tract microbiome and cancer- on the function of TLRs in normal gastrointestinal epithelial cells. An additional focus of the thesis was also to assess the carcinogenetic effect of TLRs 1–9 in Barrett’s esophagus metaplasia – dysplasia – carcinoma sequence. Study material consisted of: a patient cohort, organ donors, conventional and germ-free mice. TLRs are expressed also in a “microbe-free” gut. There were significant differences in all TLRs between small- and large intestine of conventional mice and in humans. In germ-free mice that difference was not observed. Normal tissue sampled adjacent to the tumors of cancer patients can be used as controls in immunohistochemical TLR studies in gastrointestinal cancer Clinical data indicate that TLRs linearly increase toward dysplasia in Barrett’s esophagus. High cytoplasmic and nuclear TLR4 expression and TLR1 and 8 nuclear immunoreactivity in esophageal adenocarcinoma are associated with metastatic disease and poor prognosis. Based on our results, bacteria seem to downregulate TLR expression of the intestine. TLRs 1–9 apparently have a role in malignant progression of Barrett’s dysplasia. TLR1, TLR4 and TLR8 may represent a novel therapeutic target in esophageal adenocarcinoma. / Tiivistelmä Ruokatorven adenokarsinooma on länsimaissa nopeasti yleistyvä syöpätyyppi. Tämän syöpätyypin tärkein riskitekijä on Barrettin ruokatorvi, joka kehittyy pitkään jatkuneen gastroesofageaalisen refluksitaudin pohjalta. Ruuansulatuskanavassa on suuri määrä bakteereja, sieniä ja viruksia, jotka muodostavat yhdessä ruuansulatuskanavan mikrobiomin. Normaalin mikrobiomin muutokset ovat yhteydessä usean eri ruuansulatuskanavan syövän patogeneesiin ja myös Barrettin ruokatorven muodostumiseen. Tollin kaltaiset reseptorit ovat luontaisen immuniteetin molekyylejä, jotka osallistuvat bakteerien ja virusten tunnistukseen ja sääntelevät immuunivastetta sekä normaalitilanteessa että syövissä. Väitöskirjassa tutkitaan ruuansulatuskanavan mikrobiomin ja syövän vaikutuksia normaalien epiteelisolujen TLR:ien toimintaan. Lisäksi selvitetään TLR:ien karsinogeneettisiä vaikutuksia Barrettin ruokatorven metaplasia- dysplasia -adenokarsinoomasekvenssissä. Tutkimusmateriaalina käytetään potilaskohortista ja elinluovutuksista peräisin olevia potilasnäytteitä sekä normaalien ja bakteerittomien hiirien näytteitä. Tuloksemme osoittavat, että TLR:t ilmentyvät myös bakteerittomassa ruuansulatuskanavassa, ja TLR:en ilmentyminen oli merkittävästi voimakkaampaa ohutsuolessa kuin paksusuolessa normaaleilla hiirillä ja ihmisillä. Tätä eroa ei havaittu bakteerittomilla hiirillä. Ruuansulatuskanavan syöpien viereistä ja sen altistamaa tervettä kudosta voidaan käyttää terveenä kontrollina immunohistokemiallisissa TLR- tutkimuksissa. Kliinisessä aineistossa TLR:ien ilmentyminen kasvaa lineaarisesti kohti dysplasiaa Barrettin ruokatorvessa. TLR4:n korkea ilmentyminen solulimassa ja tumassa sekä TLR8:n ilmentyminen tumassa ovat yhteydessä metastaattiseen tautiin ja huonoon ennusteeseen. Tulosten perusteella bakteerit näyttävät heikentävän TLR:ien toimintaa suolistossa. Lisäksi kaikilla tutkituilla TLR:illä (1–9) näyttää olevan osuutta Barrettin dysplasian etenemisessä kohti syöpää. TLR1, TLR4 ja TLR8 ovat mahdollisia terapeuttisia kohteita ruokatorven adenokarsinoomassa.

Cette thèse a été réalisée dans le cadre du projet Futurol, un projet national français qui vise à produire du bioéthanol à partir de biomasses végétales telles que le bois ou la paille de céréale. Pour cela, la biomasse doit être prétraitée puis digérée enzymatiquement pour libérer des sucres fermentescibles. Ma contribution dans ce projet a été de découvrir des enzymes originales pour l’hydrolyse de l’hémicellulose, un hétéropolysaccharide, constituant majeur de la paroi cellulaire des cellules végétales. Afin de rechercher de nouveaux biocatalyseurs, une approche de métagénomique a été adoptée afin de sonder les intestins de deux espèces de termites : N. corniger, un termite xylophage, et T. hispaniolae un termite humivore / xylophage. 30 000 clones métagénomiques ont été criblés sur 10 substrats cellulosiques et hémicellulosique, et 660 hits ont été obtenus. La comparaison phénotypique a montré une différence claire entre ces deux banques, probablement liée au régime alimentaire des deux espèces de termite. Le séquençage de 45 clones N. corniger a révélé 120 séquences codant pour des enzymes originales, de nombreuses étant multimodulaires et / ou organisées en cluster de gènes. Dans un second temps, une approche à haut-débit a été adoptée pour le clonage, l’expression et la caractérisation légère de 104 enzymes entières ou formes tronquées. 45 protéines recombinantes ont été produites de manière soluble, et les activités de 19 enzymes et de 12 modules enzymatiques ont été montrées, permettant la mise au point d’une boite à outil hemicellulolytique. Dans certains cas, l’activité de modules classés « Inconnus » a pu être déterminée. Cette approche a été particulièrement pertinente dans le cas de Pm69, une enzyme multimodulaire GH3-UNK-CBM48-CE1 montrant les 3 activités glucosidase, xylosidase and estérase. Cette étude a permis de poser les bases d’un brevet sur cette enzyme. D’un autre côté, les enzymes ayant montré une activité xylanase ou féruloyle-estérase se sont révélées complémentaires d’un cocktail cellulolytique durant la dégradation de paille de blé prétraitée. Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié un fragment d’ADN provenant la banque P. militaris, codant pour 19 ORFs et appartenant à une espèce du genre Bacteroides. La caractérisation biochimique d’Abn43A, Abn43B, Abf51A et Abf51B-trunc a montré que ces 4 enzymes portent des actions complémentaires sur l’hydrolyse de l’arabinane, et qu’elles peuvent agir de manière synergique pour la dégradation de ce polymère pectique. Enfin, l’étude détaillée des 19 ORFs codées sur ce fragment d’ADN nous a permis de proposer un schéma global de détection, d’hydrolyse et de métabolisation de l’arabinane par cette espèce du genre Bacteroides. / This thesis was performed in the context of the Futurol project, a French national project that aims at producing bioethanol from plant biomass such as wood and cereal straw. To reach that goal, the biomass must be pretreated, and enzymatically degraded to release fermentable simple sugar. My implication in that project was to discover original enzymes that can hydrolyze the hemicellulose, a major heteropolysaccharide found in plant cell wall.To mine for new biocatalysts, the gut microbial communities of two species of termite were investigated by a metagenomic approach : Nasutitermes corniger, a wood-feeder termite, and Termes hispaniolae supposed to be a soil-wood feeder. 30 000 metagenomic clones were screened on an array of 10 cellulosic and hemicellulosic substrates and 660 hits were obtained. Phenotypic comparison showed clear differences between both environments, probably related to the diet of the termite. The sequence of 45 N. corniger metagenomic inserts revealed 120 original sequences encoding for putative enzymes of interest. Original sequences encoding for multimodular enzymes were revealed and many ORFs were organized in clusters, suggesting that these enzymes are encoded on Polysaccharides Utilization Locus. In a second part, a high-throughput approach was used for the cloning, the expression and the slight characterization of 104 full-size and truncated enzymes. Forty five recombinant proteins were produced soluble, and their investigation revealed the activity of 19 enzymes and of 12 enzymatic modules, representing a hemicellulolytic tool-box for endo- and exo-type activities. In some cases, the implication of “Unkown” domains in the activity of multimodular enzymes was demonstrated. This approach was particularly efficient for the study of the GH3-UNKCBM48-CE1 Pm69, and this study triggered the patent process for this multiactive glucosidase, xylosidase and esterase. The xylanases and the feruloyl esterases were shown to be particularly efficient to supplement cellulolytic cocktails on pretreated wheat straw. In a third part, we investigated a DNA fragment belonging to a species of the genus Bacteroides and that encoded 19 ORFs. The biochemical characterization of Abn43A, Abn43B, Abf51A and Abf51B-trunc showed that these four enzymes harbored complementary actions for the hydrolysis of the arabinan, and that they can act synergistically for the hydrolysis of this pectic polymer. We also revealed that Abn43B had an original mode of action that we classified as exo-arabinanase. Finally, the in-depth study of the 19 ORFs allowed us to propose the entire scheme for arabinan detection, hydrolysis and utilization by the Bacteroides species carrying this DNA sequence