L’exposition prénatale à différents agents toxiques est généralement étudiée en considérant le placenta comme une barrière entre la mère et le fœtus ; nous le considérons en tant qu’organe cible des agents toxiques. Pour ce faire, nous avons sélectionné un modèle cellulaire de trophoblastes adapté aux études toxicologiques. En clinique, des pathologies de la grossesse sont associées à des modifications de la sécrétion de l’hormone placentaire lactogène hPL et de l’hormone gonadotrope chorionique hCG. Nos travaux in vitro ont permis de faire le lien entre une exposition à des micropolluants (le mono(2-ethylhexyl) phtalate, un perturbateur endocrinien, et le benzo(a)pyrene, un carcinogène) et ces observations cliniques. Les biomarqueurs de sécrétion hormonale (hPL et hCG hyperglycosylée) et de dégénérescence (activation du purinorécepteur P2X7) que nous avons identifiés permettent de détecter l’exposition et le risque suite à une exposition à des polluants. / Prenatal exposure to pollutants is commonly evaluated using placenta as a barrier between mother and fetus. Here, we consider placenta as a target organ for toxic agents. To achieve this, we selected a trophoblastic cell model, which is adapted to toxicological studies. In clinical studies, pregnancy pathologies are associated to changes in human placental lactogen (hPL) and human chorionic gonadotropin (hCG) secretions. Our in vitro work links exposure to micropollutants (mono(2-ethylhexyl)phthalate, an endocrine disruptor, and benzo(a)pyrene, a carcinogen) and clinical observations. We identified biomarkers of hormonal secretion (hPL and hyperglycosylated hCG) and degeneration (P2X7 receptor activation), which enable the evaluation of exposure and risk attached to exposure to pollutants.

La sénescence est un important mécanisme cellulaire qui prévient la tumorigenèse et se caractérise par un arrêt permanent du cycle cellulaire orchestré principalement par les inhibiteurs des cycline-kinases dépendantes (i.e p16INK4a). La sénescence est une caractéristique importante du vieillissement, mais un déséquilibre dans son induction peut être délétère pour la régénération tissulaire et paradoxalement pour la progression tumorale. L'irradiation (IR) est couramment utilisée comme approche thérapeutique dans le cancer. Chez les enfants survivants du cancer, l’exposition à l’irradiation et à la chimiothérapie entrainent le développement d’importants effets secondaires, lesquels sont associés à une forme de vieillissement prématuré. La formation de cellules sénescentes, en inhibant la prolifération tissulaire et en sécrétant des cytokines proinflammatoires, pourrait être en être responsable. Notre groupe a précédemment démontré que le gène p16INK4a est augmenté de manière tardive (environ 8 semaines) suite à une exposition à l’irradiation. Il n'a pas encore été étudié si cette expression retardée survient en réponse aux dommages causés par l'irradiation sur l’homéostasie tissulaire ou à titre de mécanismes de suppression tumorale. Un objectif de cette thèse visait donc à déterminer s’il était possible de moduler/inhiber l’expression de p16INK4a dans le but d’accroitre la régénération tissulaire sans nécessairement accroitre les risques d’incidence du cancer. En effet, ceci pourrait être possible dans la mesure ou la sénescence induite par p16INK4a est également irréversible in vivo. Nos résultats ont démontré que l’inhibition de l’expression de p16INKa (suite à l’administration de tamoxifen chez les souris p16L/LCre), induit à la fois une augmentation de la régénération tissulaire mais malheureusement également une augmentation de l’incidence du cancer. Nous voulions également connaitre l’impact de l’accumulation de ces cellules sénescentes sur les tissus, plus spécifiquement sur la fonction des cellules immunitaires de la rate. Nous avons démontré que des altérations (dépendantes de p16INK4a) au sein du microenvironnement splénique pouvaient altérer les fonctions intrinsèques des macrophages, des cellules dendritiques et des lymphocytes T. En outre, l'élimination systémique des cellules p16INK4a positives (modèle de sourie p16-3MR) a conduit à une restauration partielle de la fonction de ces cellules immunitaires. La combinaison de ces données nous permet de mieux comprendre le rôle et la fonction du gène p16INK4a dans le processus de sénescence induite par l’irradiation. Nos résultats suggèrent qu’il est envisageable d’utiliser des agents pharmacologiques tels que des composés sénolytiques, capables d’induire l’apoptose chez les cellules sénescentes spécifiquement, afin de potentiellement diminuer les effets du vieillissement prématuré induit par la sénescence cellulaire chez les survivants du cancer. / Senescence is an important cellular mechanism that prevents tumorigenesis and is characterized by a permanent cell cycle arrest orchestrated by cyclin-dependent kinases inhibitors (i.e p16INK4a). Senescence is an important hallmark of aging and unbalanced levels of senescence is considered deleterious for tissue regeneration, and paradoxically for tumor progression. Irradiation (IR) is commonly used therapeutic approach in cancer treatment. Together with surgery and chemotherapy, it has helped to increase the life expectancy of patients and, in some cases, leads to complete remission. However, long-after therapy, children who survive cancer encounter alterations in the integrity of tissues/organs associated with premature aging. The accumulation of senescent cells may be responsible for this accelerated aging by limiting tissue proliferation and secreting pro-inflammatory cytokines. Our group has previously demonstrated that the p16INK4a gene is increased in a delayed manner (approximately 8 weeks) following exposure to IR. It has not yet been investigated whether this delayed expression occurs in response to IR-induce damage of tissue homeostasis or as tumor suppression mechanisms. One objective of this thesis was to determine whether it was possible to modulate / inhibit the expression of p16INK4a in order to increase tissue regeneration without necessarily increasing the risk of cancer incidence. Indeed, this may be possible since p16INK4a-induced senescence is also irreversible in vivo. Our results demonstrated that the inhibition of p16INK4a expression in conditional-p16INK4a null mice , induces both an increase in tissue regeneration but unfortunately also an increase in the incidence of cancer. We also wanted to know the impact of the accumulation of these senescent cells on the tissues, more specifically on the function of the immune cells in the spleen. We have demonstrated that alterations (p16INK4a-dependent) within the splenic microenvironment can alter the intrinsic functions of macrophages, dendritic cells and T cells. In addition, the systemic elimination of p16INK4a positive cells (mouse model p16-3MR) has led to a partial restoration of the function of these immune cells. The combination of these data allows us to better understand the role and function of the p16INK4a gene in the irradiation-induced senescence process. Our results suggest that it is conceivable to use pharmacological agents such as senolytic compounds, capable of inducing apoptosis in senescent cells specifically, in order to potentially reduce the effects of premature aging induced by cellular senescence in cancer survivors.

La réponse immunitaire est régulée spatialement et temporellement. Les cellules immunitaires font partie d’une plus grande communauté de populations cellulaires interconnectées qui coordonnent leurs actions par la signalisation intercellulaire. Suivant une blessure hépatique, la distribution et la composition du compartiment immunitaire évoluent rapidement au fil du temps. Par conséquent, l’information sur la position des cellules immunitaires dans le tissu hépatique est essentielle à la bonne compréhension de leurs fonctions dans la santé et la maladie. Cependant, l’organisation spatiale des cellules immunitaires en réponse à une atteinte hépatique aiguë, ainsi que les conséquences fonctionnelles de leur distribution topographique spécifique, restent mal comprises. Les macrophages hépatiques sont des cellules effectrices clés pendant l’homéostasie et en réponse à des blessures, et sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies du foie. L’hétérogénéité et plasticité des macrophages dans le foie a été exposée avec l’émergence du séquençage de l’ARN, la cytométrie en flux et la cytométrie de masse. Ces techniques ont sensiblement contribué à la compréhension de l’origine, et fonctions des macrophages dans le foie. Cependant, ces technologies impliquent la destruction du tissu pour la préparation de suspension cellulaires ce qui entraîne une perte d’information spatiale et de contexte tissulaire. Par conséquent, la caractérisation spatiale et temporelle des macrophages dans le tissu hépatique pendant l’homéostasie tissulaire, et en réponse à une blessure, fournit une nouvelle information sur la façon dont les macrophages se rapportent aux cellules voisines et leur comportement pendant les réponses immunitaires. Dans la première partie de cette étude, nous avons conçu une stratégie pour le phénotypage spatial des cellules immunitaires hépatiques dans des échantillons de tissus. Cette stratégie combine techniques d'imagerie et l’alignement numérique des images pour surmonter les limitations actuelles du nombre de marqueurs pouvant être visualisés simultanément. En outre, nous avons généré des protocoles pour la quantification automatisée des cellules d’intérêt dans des sections de tissus pour réduire la subjectivité associée à la quantification par inspection visuelle, et pour augmenter la surface et la vitesse de l’analyse. Par conséquent, un plus grand nombre de populations de cellules immunitaires ont été visualisées, quantifiées et cartographiées, et leurs relations spatiales ont été déterminées. Dans la deuxième partie de l’étude, nous avons déterminé la cinétique et la dynamique spatiale des cellules de Kupffer (KCs) et des macrophages dérivés de monocytes (MoMFs) en réponse à une atteinte hépatique aiguë au CCl4, afin de mieux comprendre leurs rôles fonctionnels, et la répartition du travail entre eux. Nous avons constaté que les KC et les MoMFs présentent des différences au niveau de la distribution tissulaire, la morphologie, et la cinétique. En plus, seulement les KCs ont proliféré pour repeupler la population de macrophages résidents pendant la réparation tissulaire. Finalement, nous avons montré que le degré de colocalization de KCs et des MoMFs avec les cellules stellaires est différent. En plus, cette colocalisation varie avec la progression de la réponse immunitaire. Dans l’ensemble, nous avons montré que les KCs et les MoMFs ont des profils spatiaux et temporels différents en réponse à une atteinte hépatique aiguë. Dans l’ensemble, les observations faites dans cette étude suggèrent que le comportement spatial et temporel d’une sous-population donnée de cellules immunitaires est distinct et sous-tend sa capacité à remplir ses fonctions spécifiques pendant la réponse immunitaire. / The immune response is spatially and temporally regulated. Immune cells are part of a larger community of interconnected immune and non-immune cell populations that coordinate their actions mostly through cell-cell intercellular signaling. In the liver, the distribution pattern, and the composition of the immune compartment evolve during an immune response to injury influencing disease pathology, progression, and response to treatment. Hence, information on the location and interacting partners of immune cells in the hepatic tissue is critical for the proper understanding of their functions in health and disease. However, the spatial organization of hepatic resident and infiltrating immune cells in response to acute injury, and the functional consequences of their specific topographical distribution, remain poorly defined. Hepatic macrophages are key effector cells during homeostasis and in response to injury and are involved in the pathogenesis of several liver diseases. The heterogeneity and plasticity of the macrophage compartment in the liver have only recently started to be appreciated with the emergence of RNA sequencing, flow cytometry, and mass cytometry. Detailed transcriptomic and phenotypic profiling have deeply expanded our understanding of macrophage biology. However, these technologies involve tissue disruption with loss of spatial information and tissue context. Therefore, the spatial and temporal profiling of liver macrophages in tissue samples during the steady state, and in response to injury, provide novel information on how the macrophages relate to neighboring cells and their behavior during immune responses. In the first part of this study, we designed a strategy for the spatial phenotyping of hepatic immune cells in tissue samples. This strategy combined serial and sequential labeling, and digital tissue alignment to overcome current limitations in the number of markers that can be simultaneously visualized. In addition, we generated protocols for automated quantification of cells of interest in whole tissue sections which removed the subjectivity associated with quantification by visual inspection and greatly increased the area and the speed of the analysis. As a result, a larger number of immune cell populations were visualized, quantified, and mapped, and their spatial relations were determined in an unbiased manner. In the second part of this study, we monitored the kinetics, and spatial dynamics of resident Kupffer cells (KCs) and infiltrating monocyte-derived macrophages (MoMFs) in response to acute liver injury with CCl4, to gain insight into their functional roles, and the distribution of labor between them. KCs and MoMFs exhibited different tissue distribution patterns and cell morphology, different kinetics, and occupied neighboring but unique microanatomical tissue locations. KCs and MoMFs displayed a different capacity to replenish the macrophage pool upon acute injury, and were differentially related to hepatic stellate cells. Different kinetics and spatial profiles revealed that KCs and MoMFs have distinct spatial signatures and suggest that they perform distinct functions during the wound-healing response to acute liver injury. In summary, we optimized techniques and put together a strategy for the spatial profiling of hepatic immune cells. Then, we used this methodology to profile resident and infiltrating macrophage subpopulations to gain insight into their biology and distinct contribution to healing in response to acute liver injury. Overall, the observations made in this study suggest that the spatial and temporal behavior of a given subpopulation of immune cells underlie its ability to perform its specific functions during the immune response.