Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a esquizofrenia é reconhecida como um transtorno neuropsiquiátrico grave que afeta mais de 21 milhões de pessoas em todo o mundo. Para diminuir os sintomas associados a esta doença, a maioria dos pacientes esquizofrênicos fazem uso concomitantemente de antipsicóticos, antidepressivos, ansiolíticos e anticonvulsivantes. O desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação desses fármacos em fluidos biológicos é importante para ajustar as doses administradas, minimizar os efeitos adversos e verificar a anuência do paciente à terapia. A química analítica moderna tem se direcionado para a simplificação, através da miniaturização dos sistemas analíticos. Neste contexto, pode-se destacar a técnica de microextração em sorvente empacotado (MEPS). O desenvolvimento de novas fases extratoras para MEPS, como, os monolitos de sílica híbrida permitem pré-concentração seletiva dos analitos. Neste projeto monolitos de sílica híbrida funcionalizados com grupos aminopropil ou cianopropil foram sintetizados pelo processo sol-gel. Estes monolitos apresentaram estrutura contínua, uniforme e porosa, como evidenciado pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV). As análises de espectroscopia vibracional na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) dos monolitos de sílica híbrida exibiram picos facilmente identificáveis, característicos dos grupos cianopropil e aminopropil. Estes monolitos foram avaliados como fase estacionária para a MEPS para a determinação de fármacos em amostras de plasma por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em Tandem (LC-MS/MS). As variáveis MEPS (influência do pH na sorção dos analitos, número de ciclos aspirar/dispensar, etapa de limpeza do sorvente e solvente de eluição) foram otimizadas para aumentar a eficiência da extração. Em comparação com a fase de sílica híbrida aminopropil, a fase de sílica híbrida cianopropil apresentou maior capacidade de sorção para os fármacos em estudo. O método desenvolvido, MEPS/LC-MS/MS, empregando a fase extratora de sílica híbrida cianopropil, apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram desde o limite inferior de quantificação (0,05-1,00 ng.mL-1) até o limite superior de quantificação (40-10.500 ng.mL-1) com coeficientes de determinação (R2) maiores do que 0,9955. Este método apresentou precisão com coeficientes de variação (CV) inferiores a 14% e exatidão com erro padrão relativo (EPR) de -12 a 14%. O método MEPS/LC-MS/MS foi aplicado com êxito para análise simultânea de cinco antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), em combinação com sete antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), dois anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina) e dois ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. / According to World Health Organization (WHO), schizophrenia is recognizably a devastating neuropsychiatric disorder that affects more than 21 million people worldwide. To lessen the symptoms associated with the disease, most schizophrenic patients use other classes of drugs such as antidepressants, anxiolytics, and anticonvulsants concomitantly with antipsychotics. Developing analytical methods to quantify these drugs in biological fluids is important in therapeutic drug monitoring (TDM) to adjust doses, minimize adverse effects, and check patient adherence to the therapy. Regarding miniaturization and automation, microextraction by packed sorbent (MEPS) is a promising sample preparation technique. Sample preparation of biological matrixes is an important step in analytical processes: it removes endogenous components from the sample and pre-concentrates trace-level analytes. The development of new phases for MEPS such as the hybrid silica monoliths allows selective pre-concentration of the analytes. The present study reports on the synthesis of two hybrid silica monoliths functionalized with aminopropyl or cyanopropyl groups by the solgel process; evaluates these monoliths as selective stationary phase for MEPS to determine drugs in plasma samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); and discusses important factors (influence of pH on the sorption of analytes, number of draw/eject cycles, washing step, and elution solvent) related to the optimization of MEPS efficiency. The prepared hybrid silica monoliths consisted of a uniform, porous, and continuous silica monolithic network, as shown by scanning electron microscopy (MEV) images. The Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra of the hybrid silica monoliths displayed readily identifiable peaks, characteristic of the cyanopropyl and aminopropyl groups. Compared with the aminopropyl hybrid silica phase, the cyanopropyl hybrid silica phase exhibited higher binding capacity for most of the target drugs. The developed method, MEPS/LC-MS/MS, afforded adequate linearity at concentrations ranging from the lower limit of quantification (0.05 to 1.00 ng.mL-1) to the upper limit of quantification (40 to 10500 ng.mL-1); the coefficients of determination (R2) were higher than 0.9955. The precision of the method presented coefficients of variation (CV) lower than 14%; the relative standard error (RSE) of the accuracy ranged from -12 to 14%. The developed MEPS/LC-MS/MS method allowed for simultaneous analysis of five antipsychotics (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine) in combination with seven antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, fluoxetine), two anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and two anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples from schizophrenic patients, which should be valuable for TDM purposes.

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a esquizofrenia é reconhecida como um transtorno neuropsiquiátrico grave que afeta mais de 21 milhões de pessoas em todo o mundo. Para diminuir os sintomas associados a esta doença, a maioria dos pacientes esquizofrênicos fazem uso concomitantemente de antipsicóticos, antidepressivos, ansiolíticos e anticonvulsivantes. O desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação desses fármacos em fluidos biológicos é importante para ajustar as doses administradas, minimizar os efeitos adversos e verificar a anuência do paciente à terapia. A química analítica moderna tem se direcionado para a simplificação, através da miniaturização dos sistemas analíticos. Neste contexto, pode-se destacar a técnica de microextração em sorvente empacotado (MEPS). O desenvolvimento de novas fases extratoras para MEPS, como, os monolitos de sílica híbrida permitem pré-concentração seletiva dos analitos. Neste projeto monolitos de sílica híbrida funcionalizados com grupos aminopropil ou cianopropil foram sintetizados pelo processo sol-gel. Estes monolitos apresentaram estrutura contínua, uniforme e porosa, como evidenciado pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV). As análises de espectroscopia vibracional na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) dos monolitos de sílica híbrida exibiram picos facilmente identificáveis, característicos dos grupos cianopropil e aminopropil. Estes monolitos foram avaliados como fase estacionária para a MEPS para a determinação de fármacos em amostras de plasma por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em Tandem (LC-MS/MS). As variáveis MEPS (influência do pH na sorção dos analitos, número de ciclos aspirar/dispensar, etapa de limpeza do sorvente e solvente de eluição) foram otimizadas para aumentar a eficiência da extração. Em comparação com a fase de sílica híbrida aminopropil, a fase de sílica híbrida cianopropil apresentou maior capacidade de sorção para os fármacos em estudo. O método desenvolvido, MEPS/LC-MS/MS, empregando a fase extratora de sílica híbrida cianopropil, apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram desde o limite inferior de quantificação (0,05-1,00 ng.mL-1) até o limite superior de quantificação (40-10.500 ng.mL-1) com coeficientes de determinação (R2) maiores do que 0,9955. Este método apresentou precisão com coeficientes de variação (CV) inferiores a 14% e exatidão com erro padrão relativo (EPR) de -12 a 14%. O método MEPS/LC-MS/MS foi aplicado com êxito para análise simultânea de cinco antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), em combinação com sete antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), dois anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina) e dois ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. / According to World Health Organization (WHO), schizophrenia is recognizably a devastating neuropsychiatric disorder that affects more than 21 million people worldwide. To lessen the symptoms associated with the disease, most schizophrenic patients use other classes of drugs such as antidepressants, anxiolytics, and anticonvulsants concomitantly with antipsychotics. Developing analytical methods to quantify these drugs in biological fluids is important in therapeutic drug monitoring (TDM) to adjust doses, minimize adverse effects, and check patient adherence to the therapy. Regarding miniaturization and automation, microextraction by packed sorbent (MEPS) is a promising sample preparation technique. Sample preparation of biological matrixes is an important step in analytical processes: it removes endogenous components from the sample and pre-concentrates trace-level analytes. The development of new phases for MEPS such as the hybrid silica monoliths allows selective pre-concentration of the analytes. The present study reports on the synthesis of two hybrid silica monoliths functionalized with aminopropyl or cyanopropyl groups by the solgel process; evaluates these monoliths as selective stationary phase for MEPS to determine drugs in plasma samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); and discusses important factors (influence of pH on the sorption of analytes, number of draw/eject cycles, washing step, and elution solvent) related to the optimization of MEPS efficiency. The prepared hybrid silica monoliths consisted of a uniform, porous, and continuous silica monolithic network, as shown by scanning electron microscopy (MEV) images. The Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra of the hybrid silica monoliths displayed readily identifiable peaks, characteristic of the cyanopropyl and aminopropyl groups. Compared with the aminopropyl hybrid silica phase, the cyanopropyl hybrid silica phase exhibited higher binding capacity for most of the target drugs. The developed method, MEPS/LC-MS/MS, afforded adequate linearity at concentrations ranging from the lower limit of quantification (0.05 to 1.00 ng.mL-1) to the upper limit of quantification (40 to 10500 ng.mL-1); the coefficients of determination (R2) were higher than 0.9955. The precision of the method presented coefficients of variation (CV) lower than 14%; the relative standard error (RSE) of the accuracy ranged from -12 to 14%. The developed MEPS/LC-MS/MS method allowed for simultaneous analysis of five antipsychotics (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine) in combination with seven antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, fluoxetine), two anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and two anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples from schizophrenic patients, which should be valuable for TDM purposes.

Neste trabalho, os anticorpos policlonais e monoclonais anti-fluoxetina foram produzidos em coelhos e camundongos, respectivamente, por imunização com o conjugado fluoxetina-soroalbumina bovina. Os anticorpos obtidos foram caracterizados em função da especificidade contra o fármaco por ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) e posteriormente, purificados por afinidade em coluna fluoxetina-agarose labmade. Os anticorpos purificados foram imobilizados covalentemente na superfície vítrea das barras SBSE (extração sortiva em barra de agitação) labmade. Após a derivatização das barras com 3-aminopropiltrietoxisilano, dois métodos distintos de acoplamento dos anticorpos às barras SBSE foram avaliados: ativação com glutaraldeído e succinilação seguida de ativação via éster N-hidroxisuccinimida (NHS). A funcionalização das barras SBSE foi comprovada através da imobilização de enzima peroxidase (HRP) em lugar do anticorpo e posterior ensaio enzimático com as barras. Várias barras SBSE com diferentes áreas (1,2; 2,4; e 4,0 cm2) foram preparadas, dentre as quais, as com maior área imunosorvente apresentaram maiores taxas de recuperação do fármaco. A avaliação da morfologia da superfície da barra SBSE imunosorvente foi realizada através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). As variáveis do processo SBSE de imunoafinidade foram otimizadas para estabelecer o equilíbrio de sorção antígeno-anticorpo em um menor tempo de análise e obtenção de limite de quantificação compatível com o intervalo terapêutico do fármaco. As capacidades adsortivas das barras imunosorventes foram de 1,2 e 8 microgramas por cm2 para anticorpos policlonais e monoclonais, respectivamente. Os imunosorventes desenvolvidos apresentaram reatividade-cruzada apenas com norfluoxetina (metabólito ativo de fluoxetina). As barras imunosorventes foram reutilizadas aproximadamente 30 vezes, sem perda significativa da eficiência das extrações. Baseados nos parâmetros de validação analítica avaliados, os métodos de SBSE/LC-FD de imunoafinidade desenvolvidos são adequados para a determinação de fluoxetina em amostras de plasma de pacientes em terapia com o fármaco, para fins de monitorização terapêutica. Por conseguinte, esses métodos foram aplicados com êxito para análises de amostras de plasma de pacientes idosos em terapia com Prozac®. Neste trabalho, o método MEPS (microextração em sorvente empacotado)/LC-UV também foi desenvolvido e validado para análise simultânea de sertralina, paroxetina, citalopram, fluoxetina e mirtazapina em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. As variáveis do processo MEPS foram otimizadas (pH e volume da amostra, força iônica, volume dos ciclos aspirar-dispensar e condições de dessorção) para estabelecer o equilíbrio de sorção em menor tempo de análise e obter sensibilidade analítica adequada para a determinação dos antidepressivos no intervalo terapêutico. O método MEPS/LC-UV desenvolvido permitiu integração da dessorção dos analitos e injeção da amostra no sistema cromatográfico (LC-UV) em uma única etapa, usando a microsseringa de extração MEPS. A fase extratora MEPS, M1 (C8/SCX), foi reutilizada mais de 50 vezes com perda mínima da eficiência da extração, comprovando a robustez do material sorvente. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método MEPS/LC-UV desenvolvido é adequado para a determinação de antidepressivos em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. / In this work, polyclonal and monoclonal anti-fluoxetine antibodies were developed in rabbits and mice by immunization with fluoxetine-bovine albumin conjugate, respectively. The developed antibodies were characterized on the basis of the specificity against the drug by ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) and, subsequently they were purified by labmade fluoxetine-agarose affinity column. The purified antibodies were covalently immobilized onto the glass surface of labmade SBSE (stir bar sorptive extraction) bars. After derivatization of the bars with 3-aminopropyltriethoxysilane, two distinct methods were evaluated for the antibodies coupling to the SBSE bars: activation with glutaraldehyde and succinylation activation via ester N-hydroxysuccinimide (NHS). The functionalization of SBSE bars was confirmed by the immobilization of peroxidase (HRP) instead of the antibody and, subsequent enzymatic assay with the bars. Several SBSE bars with different areas (1.2, 2.4, and 4.0 cm2) were prepared, among of them the largest immunosorbent area showed higher recovery rates of the drug. The evaluation of surface morphology of the SBSE immunosorbent bar was performed using scanning electron microscopy (SEM). The SBSE immunoaffinity variables were optimized to establish sorption equilibrium of antigen-antibody in a short time analysis and to obtain the limit of quantification compatible with the therapeutic range of the drug. The adsorptive capacities of the immunosorbent bars were 1.2 and 8 micrograms per cm2 for polyclonal and monoclonal antibodies, respectively. The developed immunosorbents showed cross-reactivity only with norfluoxetine (active metabolite of fluoxetine). The immunosorbent bars were reused approximately 30 times without significant loss of the extraction efficiency. Based on evaluated analytical validation parameters, the developed immunoaffinity SBSE/LC-FD methods are suitable for the determination of fluoxetine in plasma samples from patients on therapy with the antidepressant for therapeutic drug monitoring. Therefore, these methods were successfully applied for the analysis of plasma samples from elderly patients undergoing therapy with Prozac®. In this work, the method MEPS (microextraction by packed sorbent)/ LC-UV was also developed and validated for the simultaneous analysis of sertraline, paroxetine, citalopram, fluoxetine and mirtazapine in plasma samples for therapeutic drug monitoring. The MEPS process variables were optimized (pH, sample volume, ionic strength, draw-eject cycles volume and desorption conditions) to establish the sorption equilibrium in a short time analysis and to obtain adequate analytical sensitivity for determination of antidepressants within therapeutic range. The developed MEPS/LC-UV method allowed integration of the analytes desorption and sample injection in the chromatographic system (LC-UV) in a single step, using a MEPS extraction microsyringe. The MEPS extraction phase, M1 (C8/SCX) was reused over 50 times with minimum loss of extraction efficiency, proving the robustness of the sorbent material. According to the evaluated analytical validation parameters, the developed MEPS/LC-UV method is suitable for the determination of antidepressants in plasma samples for therapeutic drug monitoring.

A monitorização terapêutica tem sido descrita como um recurso clínico valioso, na individualização do regime de dosagem, de acordo com a concentração do fármaco em amostras de plasma ou soro. O objetivo da monitorização terapêutica é assegurar a eficácia clínica e minimizar os efeitos adversos dos fármacos prescritos na clínica. A química analítica moderna tem sido direcionada para a simplificação dos métodos através da miniaturização dos sistemas analíticos, minimização do consumo de solvente orgânico e do volume da amostra. Neste contexto, metodologias analíticas utilizando as técnicas de microextração, extração sortiva em barra de agitação (SBSE) e microextração em sorvente empacotado (MEPS), juntamente com a eletroforese capilar em solução não-aquosa (NACE) foram desenvolvidas para fins monitorização terapêutica de antidepressivos inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRSs: fluoxetina, sertralina, paroxetina e citalopram) em amostras de plasma de pacientes em terapia com ISRSs. Inicialmente foram padronizadas as condições eletroforéticas com detecção espectrofotométrica (UV) para análise simultânea dos ISRSs em amostras de plasma. Dentre as condições avaliadas (diferentes soluções de eletrólitos em meio aquoso e não aquoso, cromatografia eletrocinética micelar e NACE), a técnica NACE-UV foi a única que apresentou resolução dos fármacos adequada. Em seguida, otimizou-se as variáveis inerentes das técnicas de microextração (SBSE e MEPS), visando minimizar o tempo de análise e aumento da sensibilidade analítica. Para o método SBSE/NACE, as variáveis tempo e temperatura de extração, pH da amostra biológica e processo de dessorção foram otimizadas, já para o método MEPS/NACE, as variáveis, pH da amostra biológica, volume da amostra e número dos ciclos aspirar/dispensar foram otimizadas. A validação analítica foi realizada segundo as normas preconizadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), com adição de padrão de padrão interno às amostras de plasma enriquecidas com os antidepressivos em diferentes concentrações plasmáticas que contemplam o intervalo terapêutico dos ISRSs. Para avaliar a aplicabilidade das metodologias padronizadas, amostras de plasma de pacientes em terapia com os ISRSs foram analisadas. Os métodos padronizados (SBSE/NACE e MEPS/NACE) foram comparados ao método de referência (LLE/NACE), utilizando a extração líquido-líquido. As técnicas de microextração, quando comparadas à LLE, apresentaram as seguintes vantagens: a reutilização das fases extratoras, procedimentos de extração com reduzido número de etapas, menores volumes de amostras biológicas e de solventes orgânicos. Segundo os parâmetros de validação avaliados, os métodos SBSE/NACE e MEPS/NACE padronizados podem ser empregados nas análises dos antidepressivos (ISRSs) em amostras de plasma, para fins de monitorização terapêutica. / Therapeutic monitoring allows individualization of the dose regimen and has been indicated for the monitoring of well-established therapeutic intervals. In psychiatric disorders, most of the patients require that the plasmatic concentrations to be within a fixed range, so the disorders are kept under control and the adverse effects are acceptable. The aim of the therapeutic monitoring is ensure clinical effectiveness and minimization of adverse effects of drugs prescribed at the clinic. New trends in analytical chemistry have been directed towards simplification and miniaturization of analytical systems, and minimization of organic solvents and sample volume. In this work, analytical methodologies using microextraction techniques, such as stir bar sorptive extraction (SBSE) and microextraction by packed sorbent (MEPS), in conjunction with capillary electrophoresis in a nonaqueous background electrolyte (NACE) were developed for therapeutic drug monitoring of selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs: fluoxetine, sertraline, paroxetine and citalopram) in plasma sample of patients in therapy with SSRIs. First, the optimization of electrophoretic separation of the SSRIs was carried out to obtain simultaneous analysis of all antidepressants. Among the conditions evaluated (different background electrolytes in aqueous and nonaqueous medium, micellar electrokinetic capillary chromatography, and NACE), NACE-UV gave the best results. In the sequence, the optimization of the inherent variables of microextraction techniques (SBSE and MEPS)aiming analyses time minimization and increase of analytical sensibilitywas carried out. For SBSE/NACE methodology development the variables such as time of extraction, temperature of extraction, and matrix pH were optimized. For MEPS/NACE methodology the variables matrix pH and the volume of draw-eject cycles were optimized. Analytical validation was carried out in agreement with the norms of National Health Surveillance Agency (ANVISA) for both of the proposed methods, in different plasmatic concentrations, which completed the therapeutic interval. The developed methods (SBSE/NACE e MEPS/NACE) were compared to the reference method, using liquid-liquid extraction (LLE/NACE). Microextraction techniques, compared to LLE, gave the following advantages: reutilization of the extraction phase, fewer numbers of steps for extraction, reduction of sample volume, and less consumption of organic solvents. According to the evaluated validation parameters, the standardized methods SBSE/NACE and MEPS/NACE can be used in the analyses of antidepressants (SSRIs) in plasma sample for therapeutic drug monitoring purposes.

A monitorização terapêutica tem sido descrita como um recurso clínico valioso, na individualização do regime de dosagem, de acordo com a concentração do fármaco em amostras de plasma ou soro. O objetivo da monitorização terapêutica é assegurar a eficácia clínica e minimizar os efeitos adversos dos fármacos prescritos na clínica. A química analítica moderna tem sido direcionada para a simplificação dos métodos através da miniaturização dos sistemas analíticos, minimização do consumo de solvente orgânico e do volume da amostra. Neste contexto, metodologias analíticas utilizando as técnicas de microextração, extração sortiva em barra de agitação (SBSE) e microextração em sorvente empacotado (MEPS), juntamente com a eletroforese capilar em solução não-aquosa (NACE) foram desenvolvidas para fins monitorização terapêutica de antidepressivos inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRSs: fluoxetina, sertralina, paroxetina e citalopram) em amostras de plasma de pacientes em terapia com ISRSs. Inicialmente foram padronizadas as condições eletroforéticas com detecção espectrofotométrica (UV) para análise simultânea dos ISRSs em amostras de plasma. Dentre as condições avaliadas (diferentes soluções de eletrólitos em meio aquoso e não aquoso, cromatografia eletrocinética micelar e NACE), a técnica NACE-UV foi a única que apresentou resolução dos fármacos adequada. Em seguida, otimizou-se as variáveis inerentes das técnicas de microextração (SBSE e MEPS), visando minimizar o tempo de análise e aumento da sensibilidade analítica. Para o método SBSE/NACE, as variáveis tempo e temperatura de extração, pH da amostra biológica e processo de dessorção foram otimizadas, já para o método MEPS/NACE, as variáveis, pH da amostra biológica, volume da amostra e número dos ciclos aspirar/dispensar foram otimizadas. A validação analítica foi realizada segundo as normas preconizadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), com adição de padrão de padrão interno às amostras de plasma enriquecidas com os antidepressivos em diferentes concentrações plasmáticas que contemplam o intervalo terapêutico dos ISRSs. Para avaliar a aplicabilidade das metodologias padronizadas, amostras de plasma de pacientes em terapia com os ISRSs foram analisadas. Os métodos padronizados (SBSE/NACE e MEPS/NACE) foram comparados ao método de referência (LLE/NACE), utilizando a extração líquido-líquido. As técnicas de microextração, quando comparadas à LLE, apresentaram as seguintes vantagens: a reutilização das fases extratoras, procedimentos de extração com reduzido número de etapas, menores volumes de amostras biológicas e de solventes orgânicos. Segundo os parâmetros de validação avaliados, os métodos SBSE/NACE e MEPS/NACE padronizados podem ser empregados nas análises dos antidepressivos (ISRSs) em amostras de plasma, para fins de monitorização terapêutica. / Therapeutic monitoring allows individualization of the dose regimen and has been indicated for the monitoring of well-established therapeutic intervals. In psychiatric disorders, most of the patients require that the plasmatic concentrations to be within a fixed range, so the disorders are kept under control and the adverse effects are acceptable. The aim of the therapeutic monitoring is ensure clinical effectiveness and minimization of adverse effects of drugs prescribed at the clinic. New trends in analytical chemistry have been directed towards simplification and miniaturization of analytical systems, and minimization of organic solvents and sample volume. In this work, analytical methodologies using microextraction techniques, such as stir bar sorptive extraction (SBSE) and microextraction by packed sorbent (MEPS), in conjunction with capillary electrophoresis in a nonaqueous background electrolyte (NACE) were developed for therapeutic drug monitoring of selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs: fluoxetine, sertraline, paroxetine and citalopram) in plasma sample of patients in therapy with SSRIs. First, the optimization of electrophoretic separation of the SSRIs was carried out to obtain simultaneous analysis of all antidepressants. Among the conditions evaluated (different background electrolytes in aqueous and nonaqueous medium, micellar electrokinetic capillary chromatography, and NACE), NACE-UV gave the best results. In the sequence, the optimization of the inherent variables of microextraction techniques (SBSE and MEPS)aiming analyses time minimization and increase of analytical sensibilitywas carried out. For SBSE/NACE methodology development the variables such as time of extraction, temperature of extraction, and matrix pH were optimized. For MEPS/NACE methodology the variables matrix pH and the volume of draw-eject cycles were optimized. Analytical validation was carried out in agreement with the norms of National Health Surveillance Agency (ANVISA) for both of the proposed methods, in different plasmatic concentrations, which completed the therapeutic interval. The developed methods (SBSE/NACE e MEPS/NACE) were compared to the reference method, using liquid-liquid extraction (LLE/NACE). Microextraction techniques, compared to LLE, gave the following advantages: reutilization of the extraction phase, fewer numbers of steps for extraction, reduction of sample volume, and less consumption of organic solvents. According to the evaluated validation parameters, the standardized methods SBSE/NACE and MEPS/NACE can be used in the analyses of antidepressants (SSRIs) in plasma sample for therapeutic drug monitoring purposes.

Neste trabalho, os anticorpos policlonais e monoclonais anti-fluoxetina foram produzidos em coelhos e camundongos, respectivamente, por imunização com o conjugado fluoxetina-soroalbumina bovina. Os anticorpos obtidos foram caracterizados em função da especificidade contra o fármaco por ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) e posteriormente, purificados por afinidade em coluna fluoxetina-agarose labmade. Os anticorpos purificados foram imobilizados covalentemente na superfície vítrea das barras SBSE (extração sortiva em barra de agitação) labmade. Após a derivatização das barras com 3-aminopropiltrietoxisilano, dois métodos distintos de acoplamento dos anticorpos às barras SBSE foram avaliados: ativação com glutaraldeído e succinilação seguida de ativação via éster N-hidroxisuccinimida (NHS). A funcionalização das barras SBSE foi comprovada através da imobilização de enzima peroxidase (HRP) em lugar do anticorpo e posterior ensaio enzimático com as barras. Várias barras SBSE com diferentes áreas (1,2; 2,4; e 4,0 cm2) foram preparadas, dentre as quais, as com maior área imunosorvente apresentaram maiores taxas de recuperação do fármaco. A avaliação da morfologia da superfície da barra SBSE imunosorvente foi realizada através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). As variáveis do processo SBSE de imunoafinidade foram otimizadas para estabelecer o equilíbrio de sorção antígeno-anticorpo em um menor tempo de análise e obtenção de limite de quantificação compatível com o intervalo terapêutico do fármaco. As capacidades adsortivas das barras imunosorventes foram de 1,2 e 8 microgramas por cm2 para anticorpos policlonais e monoclonais, respectivamente. Os imunosorventes desenvolvidos apresentaram reatividade-cruzada apenas com norfluoxetina (metabólito ativo de fluoxetina). As barras imunosorventes foram reutilizadas aproximadamente 30 vezes, sem perda significativa da eficiência das extrações. Baseados nos parâmetros de validação analítica avaliados, os métodos de SBSE/LC-FD de imunoafinidade desenvolvidos são adequados para a determinação de fluoxetina em amostras de plasma de pacientes em terapia com o fármaco, para fins de monitorização terapêutica. Por conseguinte, esses métodos foram aplicados com êxito para análises de amostras de plasma de pacientes idosos em terapia com Prozac®. Neste trabalho, o método MEPS (microextração em sorvente empacotado)/LC-UV também foi desenvolvido e validado para análise simultânea de sertralina, paroxetina, citalopram, fluoxetina e mirtazapina em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. As variáveis do processo MEPS foram otimizadas (pH e volume da amostra, força iônica, volume dos ciclos aspirar-dispensar e condições de dessorção) para estabelecer o equilíbrio de sorção em menor tempo de análise e obter sensibilidade analítica adequada para a determinação dos antidepressivos no intervalo terapêutico. O método MEPS/LC-UV desenvolvido permitiu integração da dessorção dos analitos e injeção da amostra no sistema cromatográfico (LC-UV) em uma única etapa, usando a microsseringa de extração MEPS. A fase extratora MEPS, M1 (C8/SCX), foi reutilizada mais de 50 vezes com perda mínima da eficiência da extração, comprovando a robustez do material sorvente. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método MEPS/LC-UV desenvolvido é adequado para a determinação de antidepressivos em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. / In this work, polyclonal and monoclonal anti-fluoxetine antibodies were developed in rabbits and mice by immunization with fluoxetine-bovine albumin conjugate, respectively. The developed antibodies were characterized on the basis of the specificity against the drug by ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) and, subsequently they were purified by labmade fluoxetine-agarose affinity column. The purified antibodies were covalently immobilized onto the glass surface of labmade SBSE (stir bar sorptive extraction) bars. After derivatization of the bars with 3-aminopropyltriethoxysilane, two distinct methods were evaluated for the antibodies coupling to the SBSE bars: activation with glutaraldehyde and succinylation activation via ester N-hydroxysuccinimide (NHS). The functionalization of SBSE bars was confirmed by the immobilization of peroxidase (HRP) instead of the antibody and, subsequent enzymatic assay with the bars. Several SBSE bars with different areas (1.2, 2.4, and 4.0 cm2) were prepared, among of them the largest immunosorbent area showed higher recovery rates of the drug. The evaluation of surface morphology of the SBSE immunosorbent bar was performed using scanning electron microscopy (SEM). The SBSE immunoaffinity variables were optimized to establish sorption equilibrium of antigen-antibody in a short time analysis and to obtain the limit of quantification compatible with the therapeutic range of the drug. The adsorptive capacities of the immunosorbent bars were 1.2 and 8 micrograms per cm2 for polyclonal and monoclonal antibodies, respectively. The developed immunosorbents showed cross-reactivity only with norfluoxetine (active metabolite of fluoxetine). The immunosorbent bars were reused approximately 30 times without significant loss of the extraction efficiency. Based on evaluated analytical validation parameters, the developed immunoaffinity SBSE/LC-FD methods are suitable for the determination of fluoxetine in plasma samples from patients on therapy with the antidepressant for therapeutic drug monitoring. Therefore, these methods were successfully applied for the analysis of plasma samples from elderly patients undergoing therapy with Prozac®. In this work, the method MEPS (microextraction by packed sorbent)/ LC-UV was also developed and validated for the simultaneous analysis of sertraline, paroxetine, citalopram, fluoxetine and mirtazapine in plasma samples for therapeutic drug monitoring. The MEPS process variables were optimized (pH, sample volume, ionic strength, draw-eject cycles volume and desorption conditions) to establish the sorption equilibrium in a short time analysis and to obtain adequate analytical sensitivity for determination of antidepressants within therapeutic range. The developed MEPS/LC-UV method allowed integration of the analytes desorption and sample injection in the chromatographic system (LC-UV) in a single step, using a MEPS extraction microsyringe. The MEPS extraction phase, M1 (C8/SCX) was reused over 50 times with minimum loss of extraction efficiency, proving the robustness of the sorbent material. According to the evaluated analytical validation parameters, the developed MEPS/LC-UV method is suitable for the determination of antidepressants in plasma samples for therapeutic drug monitoring.