Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-03-02T21:06:32Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas da Costa Duarte - 2016.pdf: 3454791 bytes, checksum: 29ace536ee1c0aefc19dfbcdcec01bbe (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-03T11:42:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas da Costa Duarte - 2016.pdf: 3454791 bytes, checksum: 29ace536ee1c0aefc19dfbcdcec01bbe (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-03T11:42:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas da Costa Duarte - 2016.pdf: 3454791 bytes, checksum: 29ace536ee1c0aefc19dfbcdcec01bbe (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-08-05 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / This study describes the assembly and use of a RepRap 3D printer with a modeling technology fused deposition modeling (FDM) for manufacturing microfluidic devices for direct spray ionization mass spectrometry (DS-MS) assisted by paper tip as well as for generation of droplets of water/oil with integrated electrochemical detection. The low-cost 3D printer has been properly assembled and calibrated by means of pieces of kit purchased commercially. The smaller channel width obtained which allowed the uniformity 3D printing without any obstruction was 400 μm. For studies of DS-MS were used microfluidic devices consisting of a single channel (the dimensions 30 mm × 0.5 mm × 0.5 mm) connected to a sample reservoir with 3 mm diameter with low cost (R$ 0.20) and time printing (20 min). A tip paper (5 mm × 0.5 mm) was cut out and inserted at the end of the printed channel to facilitate the formation of the spray. The spraying was promoted by the application of 4 kV in the sample reservoir containing 0.1% formic acid in methanol prepared. This organic medium showed high compatibility with the polymeric material used for the printing of microfluidic chips. Using a glucose solution as a template, the spray formed by the proposed microfluidic device was extremely stable compared to the spray generated by conventional paper devices for at least 10 min. The analytical devices for viability of the printed DS-MS was successfully demonstrated by qualitative analysis of ball pens inks, caffeine, xylose and lysozyme. The DS-MS devices exhibited significant repeatability and reproducibility, making it possible to reuse. For the generation of droplets of oil/water it was built with a device channel in the T-junction configuration with 0.75 mm × 50.0 mm × 0.7 mm and containing two integrated electrodes (1.5 mm × 2.0 mm and spacing 0.5 mm) in antiparallel arrangement. These electrodes consisting of a mixture of ABS and carbon nanotubes were used for conductivity detection capacitively coupled contact (C4D). The droplets were generated by varying the flow rate of continuous phase comprised of oil + Span80/water + Triton between 10 to 60 μL/min. Through the printed electrodes it was possible to employ the system C4D system to detect the droplets generated with a satisfactory response. The intensity and width of peaks obtained exponentially decrease the extent that it increases the flow of the continuous phase. Moreover, it was possible to correlate the length of the droplet generated from the signals obtained with C4D, indicating potential as a new technique for droplet measures. Finally, the 3D printer made possible the manufacture of parts contributed to other works in cooperation to include the construction of an electrochemical cell for by batch injection analysis, a support for Snitrosothiols decomposition, a cover for conductivity detection cell, micromixers, devices for ELISA assays and mold for manufacturing zones for colorimetric analysis. / modelagem por fusão e deposição (fused deposition modeling, FDM) para fabricar dispositivos microfluídicos para ionização direta por spray em espectrometria de massas (DS-MS) assistida por ponta de papel, bem como para geração de gotículas de água/óleo com detecção eletroquímica integrada. A impressora 3D de baixo custo foi devidamente montada e calibrada por meio do kit de peças adquirido comercialmente. A menor largura de canal obtida que permitiu a uniformidade de impressão 3D sem qualquer obstrução foi de 400 μm. Para os estudos de DS-MS, foram utilizados dispositivos microfluídicos constituídos de um único canal (nas dimensões 30 mm × 0,5 mm × 0,5 mm) conectado a um reservatório de amostra com 3 mm de diâmetro com baixo custo (R$ 0,20) e tempo de impressão (20 min). Uma ponta de papel (5 mm × 0,5 mm) foi cortada e inserida na extremidade do canal impresso para facilitar a formação do spray. A pulverização foi promovida através da aplicação de 4 kV no reservatório de amostra contendo 0,1% de ácido fórmico preparada em metanol. Este meio orgânico demonstrou grande compatibilidade com o material polimérico utilizado para a impressão dos chips microfluídicos. Usando-se uma solução de glicose como modelo, o spray formado pelo dispositivo microfluídico proposto foi extremamente estável quando comparado com o spray gerado pelos dispositivos convencionais de papel por pelo menos 10 min. A viabilidade analítica dos dispositivos impressos para DS-MS foi demonstrado com sucesso por meio de análise qualitativa de tintas de canetas esferográficas, cafeína, xilose e lisozima. Os dispositivos de DS-MS exibiram repetitividade e reprodutibilidade significativa, tornando possível a sua reutilização. Para a geração de gotículas de óleo/água foi construído um dispositivo com canais na configuração junção em T com 50,0 mm × 0,75 mm × 0,7 mm contendo dois eletrodos integrados (1,5mm × 2,0 mm e espaçamento de 0,5 mm) na disposição antiparalela. Estes eletrodos, constituídos de uma mistura de ABS e nanotubos de carbono, foram utilizados para detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada (C4D). As gotículas foram geradas variando a vazão de fase contínua formadas por óleo+Span80/ água+Triton de 10 a 60 μL/min. Por meio dos eletrodos impressos foi possível empregar o sistema C4D para detecção das gotas geradas com resposta satisfatória. A intensidade e largura dos picos obtidos diminuem exponencialmente a medida em que se aumenta a vazão da fase contínua. Além disso, foi possível correlacionar o comprimento da gota gerada com os sinais obtidos com C4D, indicando potencialidade como uma nova técnica para medidas de gotículas. Por fim, a impressora 3D possibilitou a fabricação de peças que contribuíram para outros trabalhos em colaboração que incluem a construção de uma célula eletroquímica para análise por injeção em batelada, um suporte para decomposição de S-nitrosotióis, uma tampa para cela de detecção condutométrica, micromisturadores, dispositivos para ensaios de ELISA, e molde para fabricação de zonas para análises colorimétrica.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this study was to investigate the role of GnRH on the preimplantation development of mouse embryos in vitro. GnRH-I, GnRH-II, and GnRH agonists: Des-Gly, Des-Trp and histrelin did not improve embryo development. However, treatment with the specific GnRH antagonist SB-75 blocked embryo development at morula stage. The inhibition of embryo development by SB-75 could be rescued by the addition of histrelin. To determine which intracellular signaling cascade is involved following binding of GnRH to the GnRHR, embryos were cultured in the presence of specific PKC (GFX) or PKA (SQ22536) inhibitors. The PKC inhibitor blocked embryo development at a similar stage as SB-75, whereas SQ22536 had an inhibitory effect, diminishing blastocyst formation and hatched rates. There are evidences that GnRH has an essential autocrine effect on mouse embryonic development via GnRHR, probably by activating PKC signaling cascade while the inhibition of the GnRH signaling does not activate apoptotic mechanisms involving caspase-3. In another experiment, development in vitro of embryos from Chinese Meishan (M) and occidental white crossbred (WC) females were investigated after improving the vitrification protocol for pig embryos. Efficient cryopreservation of zona pellucida-intact porcine embryos and studies of the difference among breeds could greatly impact the swine industry. The percentage of embryos surviving 24 h after cryopreservation without lysis or degeneration was higher for M (72%) than WC (44%). However, in vitro development of embryos that survived cryopreservation was not different between M and WC at the expanded (64%) or hatched (22%) blastocyst stages. Developmental rates were significantly higher for control embryos than frozen embryos from both breeds at expanded blastocyst stage, but not at hatched blastocyst stage. Rates of expanded blastocyst formation did not differ between M and WC control embryos (98 and 95%, respectively). With a new procedure to warm vitrified pig embryos, the survival rates may be improved. The optimal stages to vitrify pig embryos using the microdroplet method ranges from late compact morula to early expanded blastocyst. The results suggest that M embryos have a higher capacity to survive the vitrification process than WC embryos. / O objetivo do presente estudo foi investigar a importância do GnRH no desenvolvimento embrionário precoce em camundongos. GnRH-I, GnRH-II e os GnRH agonistas: Des-Gly, Des-Trp e histrelina não incrementaram o desenvolvimento embrionário. Entretanto, o tratamento com SB-75, um antagonista específico do GnRH, bloqueou o desenvolvimento embrionário no estádio de mórula. A inibição do desenvolvimento embrionário pelo SB-75 pôde ser revertida com a adição de histrelina. Para determinar a cascata do sinal intracelular desencadeada pela ligação do GnRH com o seu receptor, embriões foram cultivados na presença de inibidores específicos da PKC (GFX) e da PKA (SQ22536). O inibidor da PKC bloqueou o desenvolvimento embrionário em estádio similar ao bloqueio mediado pelo SB-75, enquanto o SQ22536 teve efeito inibitório diminuindo a formação de blastocisto e taxas de eclosão. Os resultados sugerem que o GnRH tem um efeito autócrino essencial no desenvolvimento embrionário através do GnRHR, provavelmente, ativando a cascata da PKC. Por outro lado, a inibição do sinal do GnRH não ativa mecanismos apoptóticos que involvam caspase-3. Em outro experimento, foi investigado o desenvolvimento in vitro de embriões da raça Meishan (M) e branco cruzado (WC) após vitrificação pelo método microgota. O desenvolvimento de protocolos eficientes para criopreservação de embriões suínos com a zona pelúcida intacta e a avaliação das diferenças entre raças pode ter um significativo impacto na suinocultura. A percentagem de embriões que sobreviveram à criopreservação depois de 24 h foi maior na M (72%) do que na WC (44%). No entanto, o desenvolvimento in vitro dos embriões que sobreviveram à criopreservação não foi diferente entre M e WC nos estádios de blastocisto expandido (64%) ou eclodido (22%). Os índices de desenvolvimento foram significativamente mais altos para os embriões controle do que para os embriões vitrificados nas duas raças no estádio de blastocisto expandido, porém não foram diferentes para o estádio de blastocisto eclodido. A formação de blastocisto expandido não diferiu entre os embriões controle M e WC (98 e 95%, respectivamente). Com o novo procedimento ( hot warm ) para descongelar embriões vitrificados pelo método de microgota, pode-se aumentar dos índices de sobrevivência. Os melhores estádios embrionários para a vitrificação de embriões suínos variam de mórula compacta tardia até blastocisto expandido inicial. Os resultados sugerem que embriões M têm mais capacidade de sobreviver ao processo de vitrificação do que embriões WC.