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Submitted by FERNANDA Passarini Lopes (mzyanke@yahoo.com.br) on 2016-03-29T20:44:57Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado de Fernanda Passarini Lopes.pdf: 1817673 bytes, checksum: 5dd8cae0d1d9745c6aabbf6a9b989abc (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-30T12:05:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lopes_fp_me_rcla.pdf: 1817673 bytes, checksum: 5dd8cae0d1d9745c6aabbf6a9b989abc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T12:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lopes_fp_me_rcla.pdf: 1817673 bytes, checksum: 5dd8cae0d1d9745c6aabbf6a9b989abc (MD5) Previous issue date: 2016-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Pseudomônade é o pólen predominante de Cyperaceae, resultante da microsporogênese simultânea tipo-Cyperaceae, onde a tétrade de micrósporos se torna secundariamente reduzida a uma mônade funcional devido à degeneração de três de seus quatro núcleos. Este pólen, morfologicamente, tem formato cuneiforme com uma ou mais aberturas. Porém, em alguns gêneros de Hypolytreae (Mapanioideae), ocorre um outro tipo de pólen, de natureza ainda dúbia, chamado de pólen tipo-Mapania. Este pólen é esférico e monoporado e já foi considerado uma mônade. No presente estudo, três espécies de Mapania (Hypolytreae, Mapanioideae) foram estudadas, a fim de descrever o desenvolvimento de suas anteras e de seus grãos de pólen, em microscopias de luz e eletrônicas de varredura e de transmissão, e comparar os resultados aqui obtidos com aqueles já existentes na literatura para Cyperaceae. Nas três espécies estudadas, constatou-se a formação da pseudomônade, como resultado da microsporogênese simultânea tipo-Cyperaceae, assim como já descrita para as demais espécies da família. Durante a microgametogênese, observou-se o englobamento dos três núcleos não-funcionais, em degeneração, pela intina. A morfologia da pseudomônade está relacionada ao arranjo central nos microsporângios ao longo da microgametogênese. A formação da exina ocorre durante a microsporogênese, a partir da esporopolenina secretada pelo tapete secretor. Esses resultados da formação da pseudomônade em Mapania reforçam o caráter sinapomórfico de Cyperaceae dentre as Poales. / Pseudomonad is the predominant pollen in Cyperaceae resulting from simultaneous microsporogenesis of the Cyperaceae-type in which the microspore tetrad becomes secondarily reduced to a functional monad due to degeneration of three of its four nuclei. Morphologically, this pollen presents wedge-shape with one or more apertures. However, in some genera of Hypolytreae (Mapanioideae), there is another pollen type, of unknown nature, termed Mapania-type pollen. This pollen is spherical and monoporate and already was considered a monad. In the present study, three species of Mapania (Hypolytreae, Mapanioideae) were studied in order to describe their anther and pollen grain development in light and both scanning and transmission electron microscopies, and compare the results obtained here with those already described in the literature for Cyperaceae. In all species studied, the pollen is a true pseudomonad as a result of simultaneous microsporogenesis of the Cyperaceae-type, as well as already described for other family taxa. During microgametogenesis, three non-functional nuclei, in degeneration, were involved by intine. Pseudomonad morphology was related to the central arrangement in the microsporangia through microgametogenesis. Exine formation occurred through microsporogenesis, from sporopollenin secreted by secretory tapetum. These results in Mapania reinforce the Cyperaceae sinapomorphic character in Poales.

Le grain de pollen, gamétophyte mâle, est le produit de la méiose mâle. Il présente une structure extrêmement diversifiée chez les Angiospermes. Afin d’étudier cette diversité, nous avons centré notre étude sur le type apertural. Défini par le nombre, la forme, et la disposition des apertures (zone amincie de la paroi), le type apertural joue un rôle majeur dans les processus de germination et de survie du pollen. L’étude de la méiose mâle a montré que les variations dans le type apertural peuvent être corrélées avec : le type de cytocinèse, la forme des tétrades, la formation des parois entre les futurs grains de pollens, et la position polaire ou groupée des apertures au sein de la tétrade. Récemment, chez un certain nombre d’espèces, il a été mis en évidence une corrélation entre la localisation des derniers dépôts additionnels de callose après la formation des parois intersporales et la position des futures apertures. Nous avons étudié la diversité et l’évolution des composants de la microsporogenèse ainsi que des dépôts de callose additionnels au sein des Angiospermes basales et des Monocotylédones. L’étude du développement de nombreuses morphologies polliniques variées chez ces groupes révèle la présence de dépôts additionnels de callose dans la grande majorité des cas. Nous avons montré qu’il existait un lien entre ces derniers dépôts et la position de la future aperture quelque soit la morphologie du grain de pollen. De plus, pour une même morphologie pollinique, nous avons mis en évidence des dépôts additionnels de callose différents. 7 types de microsporogenèse différents ont été observés pour les pollens monosulqués. Ils présentent les différences dans le type de cytocinèse, la forme des tétrades, la présence et la forme de dépôts de callose additionnels. Nous avons également étudié des espèces sélectionnées présentant différentes configurations d’apertures appartenant à la famille des Bromeliaceae, produits par divers types de dépôts de callose additionnels. On a reconstruit, par la méthode du maximum de parcimonie, l’évolution de différents caractères de la microsporogenèse et la présence ou l’absence des dépôts additionnels de callose intervenant dans la détermination du type apertural. Nos résultats confirment que la forme des tétrades tétragonales, en association avec le type de cytocinèse successive, le mode de formation des parois de façon centrifuge, et la présence des dépôts additionnels de callose, sont les états ancestraux chez les Monocotylédones. De plus, la forme des tétrades tétraédriques, en association avec le type de cytocinèse simultané, le mode de formation des parois de façon centripète, et la présence des dépôts additionnels de callose, sont les états ancestraux chez les Angiospermes basales. Les transitions observées des composants de la microsporogenèse ainsi que le type de dépôts additionnels de callose montrent la variabilité de ces caractères du développement chez les espèces étudiées. Les transitions observées des formes de la tétrade sont associées à des transitions au niveau du type de cytocinèse. Cela confirme un lien étroit entre ces deux caractères. Les transitions dans le mode de formation des parois, associées aux transitions dans tous les autres caractères, indiquent une corrélation entre les différents composants de la microsporogenèse chez les Angiospermes. En présence de dépôts de callose additionnels, la détermination du type apertural est déconnectée des composantes de la microsporogenèse. Des variations des dépôts additionnels conduisant à des pollens monosulqués montrent que le développement (les dépôts additionnels) n’est pas soumis à des contraintes et que la stase sur le type apertural monosulqué résulte de pressions de sélection. / The pollen grain, the male gametophyte of seed plants, is the product of microsporogenesis (male meiosis). It has a considerable structural diversity in flowering plants. To investigate this diversity, we have focused our study on the aperture pattern. The aperture pattern of pollen grains is defined by the shape and number of apertures, and their position when pollen grains are still assembled in tetrads at the end of meiosis. The outer pollen wall is punctuated with apertures, areas where the exine is thinner or even absent. The apertures are the places where the pollen tube emerges at germination. They also have an essential functional role for the survival of pollen grains. The study of microsporogenesis has shown that variations in the aperture pattern can be correlated with features of this developmental process: the type of cytokinesis, the tetrad shape, the way in which callose walls are formed among the four microspores and the position of the apertures within the tetrad (polar or grouped at the last point of contact among the microspores). Recently, in a certain number of species, a correlation has been evidenced between the location of the last points of additional callose deposition and aperture location after wall formation among the future microspores. We studied the diversity and evolution of the above-mentioned features of microsporogenesis and additional callose deposition at the late tetrad stage in a selection of species from basal angiosperms and monocots (with a particular sampling effort in Bromeliaceae) with various aperture patterns. The study of microsporogenesis in these groups revealed the presence of additional callose deposits in most cases. We show that there is a link between the last points of callose deposition and aperture location for several aperture types. In addition, for the same pollen morphology, we have observed different patterns of callose deposition. We described seven different microsporogenesis pathways associated to monosulcate pollen grain. They differ in the type of cytokinesis, tetrad shape, and presence and shape of additional callose deposition. Using Maximum Parsimony, we reconstructed the evolution of the features of microsporogenesis and the presence or absence of additional callose deposits likely to play a key role in aperture pattern determination. Our results confirm that the shape of tetragonal tetrads, in association with the successive cytokinesis, centrifugal cell wall formation, and the presence of additional callose deposits, is the ancestral states in monocots. Using our results on basal angiosperms, we confirm that tetrahedral tetrad, in association with simultaneous cytokinesis, centripetal cell wall formation, and the presence of additional callose deposits, are ancestral at the level of angiosperms. Our results highlight the large variability of the features of microsporogenesis in our study species. The transitions observed in the tetrad form character associated in the most cases with transitions in the cytokinesis character, confirm the relationship between these two characters. The transitions in intersporal wall formation are associated with transitions in all other characters. This suggests a correlation among the different components of microsporogenesis in angiosperms. On the opposite, the presence of additional callose deposits, which seems to be the key element in aperture pattern determination (contrary to previous hypotheses) is disconnected from the other features of microsporogenesis. The variations additional callose deposits leading to monosulcate pollen show that the development (additional callose deposits) is not due to developmental constraints and stasis on monosulcate apertural pattern is resulting from selective pressures.

La phosphorylation des protéines constitue la modification post-traductionnelle la plus importante chez les eucaryotes. Réalisée par des protéines kinases, elle intervient dans plusieurs processus cellulaires et en particulier dans la signalisation. La grande famille des kinases est subdivisée en plusieurs groupes dont les MAPKs qui sont caractérisées par un relais de phosphorylation comprenant trois niveaux (MAPKKK-MAPKK-MAPK). Le rôle des MAPKs a été démontré chez un grand nombre d’organismes et est lié fonctionnellement à plusieurs processus biologiques. Dans ce projet, nous avons essayé de mettre en évidence la fonction de trois MAPKKK (MKKK19, MKKK20 et MKKK21) chez Arabidopsis thaliana, une plante modèle dont le génome a été entièrement séquencé en 2000. Ces trois kinases sont similaires aux kinases FRK1 et FRK2 qui sont impliquées dans le développement des gamètes mâles et femelles chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Les MKKK19-21 sont fortement exprimées au niveau de la fleur et plus précisément dans le pollen. L’analyse des lignées de plantes simples mutants pour ces trois kinases ne montre aucun défaut développemental évident en conditions normales suggérant fortement une redondance fonctionnelle entre ces gènes. Par contre, les plantes sous-exprimant les MKKK19-21 produisent un grand nombre de grains de pollen déformé et non viable. La croissance des tubes polliniques est aussi affectée dans ces mutants. Les observations microscopiques ont montré que c’est au stade tricellulaire de la microsporogenèse que ces lignées mutantes sont affectées. Ainsi, ces trois kinases joueraient un rôle important dans la phase tardive du développement pollinique chez Arabidopsis. De façon à déterminer les protéines pouvant agir tant en amont qu’en aval des MKKK19-21, un criblage par la méthode de double hybride chez la levure a été réalisé à partir d’une banque d’ADNc des transcrits d’A.thaliana. Ceci nous a permis d’identifier un grand nombre d’interactants, dont plusieurs protéines kinases pouvant former des voies de signalisation avec les trois MKKK19-21. C’est le cas de la MPK18 qui interagit spécifiquement avec la MKKK20 et pour laquelle un rôle dans la régulation des microtubules corticaux (MTC) avait été démontré. Les résultats de l’analyse des mutants MKKK20 ainsi que les essais kinases nous ont permis de placer la MKKK20 en amont de la MPK18 dans la régulation des MTC. De plus, nous avons pu montrer que la MKK3 interagit spécifiquement avec la MKKK20 parmi les dix MKKs d’Arabidopsis et que ces deux kinases peuvent former un module MAPK aussi lié fonctionnellement aux MTC. L’analyse des doubles mutants (mkkk20/mpk18 et mkk3/mpk18) ainsi que les essais kinases et les observations microscopiques des polymères microtubulaires nous ont permis de caractériser deux voies impliquées dans la régulation des MTC. La première voie, celle de la MKKK20 et de la MPK18 est non canonique, ne nécessitant pas la présence d’une MKK entre les deux, alors que la deuxième voie serait canonique et comprend la MKKK20, MKK3 et possiblement d’autre(s) MPK(s) en aval. Nos résultats suggèrent que ces deux voies sont indépendantes et non synergiques jouant un rôle dans l’instabilité dynamique des MT chez Arabidopsis. / Protein phosphorylation is the major post-translational molecular mechanism through which many eukaryotic proteins are regulated. Phosphorylation is involved in several biological processes and is carried out by kinase enzymes. The very large family of kinases is divided into many subgroups including MAPKs which function as a canonical module of three stepwise phosphorylation events (MAPKKK-MAPKK-MAPK). In this project, we aimed to study the function of three MAPKKK, MKKK19, 20 and 21 in Arabidopsis thaliana, as it has been shown that two of their potential orthologues, FRK1 and 2 in Solanum chacoense are involved in male (pollen) and female (embryo sac) gametophyte development. We found that the MKKK19-21 were highly expressed in reproductive organs, more specifically inside pollen grains. MKKK19-21 single mutants showed WT phenotype under normal conditions, suggesting a possible functional redundancy from these genes. To overcome this, down-regulation of endogenous MKKK19-21 expression via transformation of WT A. thaliana with an artificial microRNA (amiRNA) construct was made. This led to the production of plants exhibiting a high number of dead pollen grains, as well as with defects in pollen tube growth for the viable ones. Microscopic observations of microsporogenesis showed that pollen developmental defects occurred at the tricellular stage. Consequently, the three MKKK19-21 are functionally important for the late stage of pollen development in A. thaliana. In order to find proteins acting both upstream and downstream of MKKK20, a yeast two-hybrid screen was performed against an Arabidopsis cDNA library. This led to the identification of a large number of interacting proteins. These proteins belong to several functional categories with some that could act in signaling pathways with MKKK19-21. Among them, MAPK18 that was demonstrated to regulate cortical microtubules (CMT) and that was found to interact specifically with MKKK20. The results of MKKK20 mutant plants analyses and kinase assays indicate that MKKK20 would act upstream of MPK18 in regulating CMT. The MKK3 was also found from a directed Y2H screen, and was shown to specifically interact with MKKK20 among the 10 Arabidopsis MKKs. MKK3 mutant analysis showed that both kinases could form a MAPK signaling pathway functionally linked to CMT. Furthermore, double mutants (mkkk20/mpk18 and mkk3/mpk18) analysis and kinase assays as well as microscopic observations of microtubule polymers allowed us to postulate that two different signaling pathways are involved in the regulation of CMT. The first one, considered as non-canonical MAPK pathway consists of MKK20 and MPK18, bypassing the need of an MKK, while the second one is a canonical pathway that comprises MKKK20, MKK3 and possibly other MPK(s). We concluded from these results that the two pathways are independent and do not work synergistically in MT dynamic instability in Arabidopsis cells.

Dans l’histoire évolutive des végétaux, la polyploïdisation a été un phénomène récurrent qui a façonné les génomes, aurait contribué à l’avènement de grandes étapes évolutives et aurait favorisé la survie de nombreuses lignées lors de crises écologiques majeures. Le principal mécanisme d’apparition d’espèces polyploïdes est la polyploïdisation sexuelle, qui implique la formation de gamètes 2n résultant de modifications de la division méiotique. Récemment plusieurs mutants produisant des taux élevés de gamètes 2n ont été identifiés chez A. thaliana. Chez cette espèce, la perte de fonction du gène AtPS1 conduit à la mise en place de fuseaux parallèles en méiose II et celle du gène AtCYCA1;2/TAM à l’omission de la seconde division méiotique. L’objectif de cette thèse a été de déterminer des facteurs et mécanismes responsables de la formation de gamètes 2n, en utilisant le rosier comme modèle végétal. Ces travaux ont permis : (i) d’identifier un facteur abiotique, la température élevée, comme inducteur de production de forts taux de gamètes 2n, (ii) de montrer que la fenêtre de sensibilité à ce facteur est restreinte à la méiose et (iii) de révéler que ces gamètes 2n produits sont principalement issus de la mise en place de fuseaux parallèles en méiose II. Afin de déterminer les mécanismes moléculaires à l’origine de leur formation, deux gènes candidats, RhPS1 et RhCYCA1 ont été identifiés chez Rosa. L’analyse de leur expression a révélé : (i) en condition non inductible, leur forte expression dans les étamines au stade méiose et (ii) la répression rapide de leurs niveaux de transcrits en condition d’induction de gamètes 2n. La fonction méiotique du gène RhPS1 a été validée par complémentation du mutant atps1-1 d’A. thaliana et par l’obtention d’une lignée rosier transgénique p35S::ARNi-RhPS1. Compte tenu de ces résultats, l’étude de la polyploïdisation et de ses mécanismes peut désormais être replacée dans le contexte actuel de changement climatique. / In the evolutionary history of plants, polyploidization has been a recurring phenomenon that has shaped the genomes, might have contributed to the occurrence of major evolutionary step and might have facilitated the survival of many plant families during major ecological crises. The main mechanism of polyploidization is sexual polyploidization, which involves the formation of 2n gametes resulting from meiotic division changes. Recently, mutants highly producing 2n gametes have been isolated in A. thaliana. Loss of AtPS1 gene function leads to parallel spindles orientation in meiosis II and loss of AtCYCA1;2/TAM gene function leads to the omission of the second meiotic division. The aim of this PhD project was to identify factors and mechanisms responsible for the 2n gametes formation, using Rosa as a model. This work permitted to: (i) discover an abiotic factor, high temperature, that can induce a high production of 2n gametes, (ii) show that the sensitivity window to this factor is narrow and restricted to meiosis and (iii) reveal that 2n gamete production in inductive condition, results from parallel spindle orientation in meiosis II. To determine molecular mechanisms responsible for their formation, two candidate genes, RhPS1 and RhCYCA1 were identified in Rosa. Analysis of their expression revealed: (i) their high expression level in stamens at meiosis stage in non-inductive condition and (ii) the rapid repression of their transcript levels under inductive condition. Meiotic gene function of RhPS1 was validated by complementation of atps1-1 mutant and by generating a rose transgenic line p35S:: RNAi-RhPS1. According to these results, polyploidization and its mechanisms can now be replaced in the context of the current climate.

Tesis por compendio / [EN] Cannabis sativa L. (Cannabaceae) is an angiosperm, allogamous and dicotyledonous species that includes short and neutral-day varieties with dioecious specimens (males and females), and monoecious plants. Among its many applications, its industrial and medicinal uses stand out. Despite the fact that cannabis has been used by humans since ancient times and the growing interest that the C. sativa therapeutic properties have aroused in researchers around the world, the psychoactivity of some of its varieties, derived from its ¿9-tetrahydrocannabinol (THC) content, has motivated the prohibition of its cultivation for almost sixty years. The strict control to which cannabis has been subjected has prevented professionals from all over the world from carrying out genetic breeding programs for this species, which has resulted in the absence of uniform varieties. In this Doctoral Thesis, different biotechnological tools for cannabis genetic improvement have been developed. In the first place, given the lack of reproducibility of some cannabis plant in vitro regeneration protocols and the great influence that the genotype exerts on their effectiveness, plant in vitro regeneration competence of different explants was evaluated. As a result, an hormone-free protocol from C. sativa hypocotyls that presents high regeneration rates (ranging from 32.26% to 71.15%) in all the genotypes evaluated, also presenting a 17.94% of spontaneous rooting rate of regenerants has been developed. At the same time, the polysomatic pattern of different cannabis explants has been studied, and it has been possible to regenerate, from them, a significant percentage of mixoploid specimens (17.65% from cotyledons and 13.33% from hypocotyls) that, as described in the existing literature, could show a greater capacity for cannabinoid synthesis. On the other hand, given the absence of scientific publications in this regard, and the potential that this technique presents to alleviate the intrinsic variability of this species, the most in-depth study to date on the male floral biology of C. sativa has been developed. Up to 476,903 microspores and pollen grains per male flower, with in vivo microspore viability rates from 53.71 to 70.88% have been found. Furthermore, all stages of development of the microgametophyte have been correlated with an easily measurable floral morphological marker such as the bud length, identifying bud length intervals containing mostly vacuolate microspores and young bi-cellular pollen grains in all the phenotypes evaluated. In this way, and although the starch presence in C. sativa microspores and pollen grains follows a similar pattern to that observed in species recalcitrant to androgenesis, it has been possible to address the induction of microspore embryogenesis in this species, obtaining for the first time microspore-derived multicellular structures after one week long cold-shock bud pretreatment. Finally, as a prerequisite for the genetic editing of C. sativa by using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas systems, and taking advantage of the in vitro plant regeneration protocol which resulted from this Doctoral Thesis, it has been possible to develop for the first time a protocol for the production of stably transformed cannabis plants, which represents a historical milestone in the genetic improvement of the species. After co-culture with A. tumefaciens and subsequent culture in antibiotic-containing selective regeneration medium, hypocotyls achieved 23.1% and 5.0% of regeneration and transformation rates respectively. As a whole, the present Doctoral Thesis provides a range of biotechnological tools that will allow the development of a new generation of high-yield cannabis varieties with uniform traits, resistant to multiple biotic and abiotic stresses, and therefore being suitable for both industrial and medicinal use. / [ES] Cannabis sativa L. (Cannabaceae) es una especie angiosperma, alógama y dicotiledónea compuesta por variedades de día corto y día neutro que presentan ejemplares dioicos (machos y hembras), y plantas monoicas. Entre sus múltiples aplicaciones destacan tanto su uso industrial como su uso medicinal. A pesar de que el cannabis ha sido empleado por el ser humano desde tiempos ancestrales, la psicoactividad que presentan algunas de sus variedades, derivada de su contenido en ¿ 9 -tetrahidrocannabinol (THC), ha motivado la prohibición de su cultivo durante casi sesenta años. La estricta fiscalización a la que ha sido sometido el cannabis, ha impedido llevar a cabo programas de mejora genética de esta especie, lo que se ha traducido en la ausencia de variedades uniformes. En esta Tesis Doctoral se han desarrollado diferentes herramientas biotecnológicas para la mejora genética del cannabis. En primer lugar, dada la falta de reproducibilidad de algunos protocolos de cultivo in vitro de cannabis y la gran influencia que el genotipo ejerce en la efectividad de los mismos, se evaluó la capacidad de regeneración in vitro de diferentes explantes. Como resultado, se ha desarrollado un protocolo libre de hormonas a partir de hipocótilos de C. sativa que presenta altas tasas de regeneración (las cuales oscilan del 32,26% al 71,15%) en todos los genotipos evaluados, presentando además un 17,94% de tasa de enraizado espontáneo de los regenerantes. A su vez, se ha estudiado el patrón polisomático de diferentes explantes de cannabis y se ha conseguido regenerar, a partir de los mismos, un porcentaje significativo de ejemplares mixoploides (17,65% procedentes de cotiledones y 13,33% de hipocotilos) que, tal y como describe la bibliografía existente, podrían mostrar una mayor capacidad de síntesis de cannabinoides. Por otro lado, dada la ausencia de publicaciones científicas al respecto y el potencial que esta técnica presenta para paliar la variabilidad intrínseca de esta especie, se ha desarrollado el estudio más profundo hasta la fecha relativo a la biología floral masculina de C. sativa. Se han descrito hasta 476.903 microsporas y granos de polen por flor masculina, con tasas de viabilidad in vivo de las microsporas del 53,71 al 70,88%. Además, se han correlacionado todas las etapas de desarrollo del microgametofito con la longitud de la yema, identificando intervalos de longitud de yema que contienen mayoritariamente microsporas vacuoladas y granos de polen joven bicelular en todos los fenotipos evaluados. De este modo, y aunque la presencia de almidón en las microsporas y granos de polen de C. sativa sigue un patrón similar al observado en especies recalcitrantes a la androgénesis, ha sido posible abordar la inducción de la embriogénesis de microsporas en esta especie, consiguiendo producir por primera vez estructuras multicelulares derivadas de las microsporas tras aplicar sobre las yemas un pretratamiento de frío de una semana de duración. Finalmente, como requisito previo para la edición genética de C. sativa mediante los sistemas CRISPR/Cas, y haciendo uso del protocolo de regeneración in vitro de plantas surgido de la presente Tesis Doctoral, se ha conseguido desarrollar por primera vez un protocolo para producir plantas de cannabis transformadas genéticamente de forma estable, lo que supone un hito histórico en la mejora genética de la especie. Después del cocultivo con A. tumefaciens y el posterior cultivo en medio de regeneración selectiva con antibióticos, los hipocótilos lograron respectivamente un 23,1% y un 5,0% de tasas de regeneración y transformación. En su conjunto, la presente Tesis Doctoral proporciona un abanico de herramientas biotecnológicas que permitirán el desarrollo de una nueva generación de variedades de cannabis de alto rendimiento, que presenten caracteres homogéneos, resistentes a múltiples estreses tanto bióticos como abióticos, y siendo así aptas tanto para un uso industrial como medicinal. / [CAT] Cannabis sativa L. (Cannabaceae) és una espècie angiosperma, alógama i dicotiledònia composta per varietats de dia curt i dia neutre que presenten exemplars dioics (mascles i femelles), i plantes monoiques. Entre les seues múltiples aplicacions destaquen tant el seu ús industrial com el seu ús medicinal. Tot i que el cànnabis ha sigut emprat per l'ésser humà des de temps ancestrals, la psicoactivitat que presenten algunes de les seues varietats, derivada del seu contingut en ¿9-tetrahidrocannabinol (THC), ha motivat la prohibició del seu cultiu durant gairebé seixanta anys. L'estricta fiscalització a la qual ha sigut sotmés el cànnabis, ha impedit que professionals de tot el món puguen dur a terme programes de millora genètica d'aquesta espècie, la qual cosa s'ha traduït en l'absència de varietats uniformes. En aquesta Tesi Doctoral s'han desenvolupat diferents eines biotecnològiques per a la millora genètica del cànnabis. En primer lloc, donada la falta de reproducibilitat d'alguns protocols de cultiu in vitro de cànnabis i la gran influència que el genotip exerceix en l'efectivitat d'aquests, es va avaluar la capacitat de regeneració in vitro de diferents explants. Com a resultat, s'ha desenvolupat un protocol lliure d'hormones a partir de hipocòtils de C. sativa que presenta altes taxes de regeneració (les quals oscil·len del 32,26% al 71,15%) en tots els genotips avaluats, presentant a més un 17,94% de taxa d'arrelat espontani dels regenerants. Al mateix temps, s'ha estudiat el patró polisomàtic de diferents explants de cànnabis i s'ha aconseguit regenerar, a partir d'aquests, un percentatge significatiu d'exemplars mixoploids (17,65% procedents de cotilèdons i 13,33% de hipocòtils) que, tal com descriu la bibliografia existent, podrien mostrar una major capacitat de síntesi de cannabinoids. D'altra banda, donada l'absència de publicacions científiques sobre aquest tema i el potencial que aquesta tècnica presenta per a pal·liar la variabilitat intrínseca d'aquesta espècie, s'ha desenvolupat l'estudi més profund fins hui relatiu a la biologia floral masculina de C. sativa. S'han descrit fins a 476.903 microspores i grans de pol·len per flor masculina, amb taxes de viabilitat in vivo de les microspores del 53,71 al 70,88%. A més, s'han correlacionat totes les etapes de desenvolupament del microgametòfit amb la longitud de la gemma, identificant intervals de longitud de gemma que contenen majoritàriament microspores vacuolades i grans de pol·len jove bi-cel·lular en tots els fenotips avaluats. D'aquesta manera, i encara que la presència de midó en les microspores i grans de pol·len de C. sativa segueix un patró similar a l'observat en espècies recalcitrants a la androgènesi, ha sigut possible abordar la inducció de la embriogènesi de microspores en aquesta espècie, aconseguint produir per primera vegada estructures multicel·lulars derivades de les microspores després d'aplicar sobre les gemmes un pretractament de fred d'una setmana de duració. Finalment, com a requisit previ per a l'edició genètica de C. sativa mitjançant els sistemes CRISPR/Cas, i fent ús del protocol de regeneració in vitro de plantes sorgit de la present Tesi Doctoral, s'ha aconseguit desenvolupar per primera vegada un protocol per a produir plantes de cànnabis transformades genèticament de manera estable, la qual cosa suposa una fita històrica en la millora genètica de l'espècie. Després del cocultiu amb A. tumefaciens i el posterior cultiu en medi de regeneració selectiva amb antibiòtics, els hipocòtils van aconseguir respectivament un 23,1% i un 5,0% de taxes de regeneració i transformació. En el seu conjunt, la present Tesi Doctoral proporciona un ventall d'eines biotecnològiques que permetran el desenvolupament d'una nova generació de varietats de cànnabis d'alt rendiment, que presenten caràcters homogenis, resistents a múltiples estressos tant biòtics com abiòtics, i sent així aptes tant per a un ús industrial com medicinal. / Galán Ávila, A. (2021). Development of biotechnological tools for the genetic improvement of Cannabis sativa L [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176013 / TESIS / Compendio

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Die vorliegende Arbeit prüft bei der gärtnerischen Modell-Kultur Cyclamen den Einfluss des Genotyps (interspezifische Hybriden) auf generative Merkmale sowie bei C. persicum `Melody´ den Einfluss von Kultivierungsmaßnahmen wie die Besiedelung der Wurzeln durch einen symbiontischen Pilz (Piriformospora indica) in Kombination mit einem differenzierten Phosphor-Angebot auf vegetative und generative Merkmale: (1) Pflanzendurchmesser, (2) Blühzeitpunkt und Blütenanzahl, (3) Anzahl Samenanlagen pro Fruchtknoten, (4) Vitalität von Pollen und Samenanlagen, (5) Mikrosporogenese, (6) Befruchtungsvorgang (Pollenschlauchwachstum, Anteil Fruchtknoten mit Pollenschläuchen, Anzahl Pollenschläuche im Griffel und Penetration der Pollenschläuche in die Micropyle), (7) abortierte Blüten nach der Bestäubung (8) Samenbildung und (9) Samenanzahl. / The present paper investigates Cyclamen as an horticultural model-culture. A main Focus is on the characteristics of the Cyclamen genotype, notably with interspecific hybrids. Further, Cyclamen persicum cv. served as a model to analyse effects on parameters of pollination, seed development and number of ovules per ovary, which are caused by a root colonization of the seed bearer with the symbiotic fungus Piriformospora indica (Piri) in combination with a differentiated phosphorus supply. In this regard, plant diameter, flowering time and flower number, the viability of pollen and ovules, the microsporogenesis, the growth of pollen tubes, the seed formation and the seed count were considered among important parameters of pollination and seed development.