No / Purpose: The hollow fiber assay is used successfully as a routine in vivo screening model to quantitatively define anticancer activity by the National Cancer Institute. This study investigates whether the hollow fiber assay can be used as a short-term in vivo model to demonstrate specific pharmacodynamic end points, namely microtubule and cell cycle disruption. Experimental Design: The growth of A549 cells was characterized within hollow fibers over 5 days in vivo at both subcutaneous (s.c.) and intraperitoneal (i.p.) sites. Drugs were administered on day 4 (i.p.). Results: At 24 hours, cells were retrieved from fibers at both i.p. and s.c. sites of paclitaxel-treated (20 mg/kg) and combretastatin A1 phosphate¿treated (150 mg/kg) mice. Cell cycle analysis after paclitaxel treatment revealed a mean G2-M phase population of 48.04% (i.p.) and 25.76% (s.c.) compared with vehicle group mice (6.78 and 5.56%, respectively; P = <0.001 and 0.005, respectively). Tumor cells retrieved from combretastatin A1 phosphate¿treated mice had a mean G2-M phase population of 36.3% (i.p.) and 29.36% (s.c.) compared with cells retrieved from vehicle group mice (5.58 and 5.49%, respectively; P = <0.001). Using fluorescence and laser-confocal microscopy, paclitaxel was revealed to induce the formation of spindle asters and tubulin polymerization. Combretastatin A1 phosphate was shown to hold cells in mitosis. Changes in nuclear morphology were also observed. Conclusion: These data demonstrate that the hollow fiber assay can be used as a short-term in vivo model for studying the pharmacodynamic effects of both standard and novel compounds on microtubules. Evidence has also been provided to support the routine use of the in vivo hollow fiber assay for demonstrating the mechanism of action of a drug.

Thesis advisor: David R. Burgess / Microtubule (MT) asters are radial arrays of MTs nucleated from a microtubule organizingcenter (MTOC) such as the centrosome. Within many cell types, which display highly diverse size and shape, MT asters orchestrate spatial positioning of organelles to ensure proper cellular function throughout the cell cycle and development. Therefore, asters have adopted a wide variety of sizes and morphologies, which are directly affects how they migrate and position within the cell. In large cells, for example during embryonic development, asters growth to sizes on the scales of hundreds of microns to millimeters. Due to this relatively enormous size scale, it is widely accepted that MT asters migrate primarily through pulling mechanisms driven by dynein located in the cytoplasm and/or the cell cortex. Moreover, prior to this dissertation, significant contributions from pushing forces as a result of aster growth and expansion against the cell cortex have not been detected in large cells. Here we have reinvestigated sperm aster growth, morphology, and positioning of MT asters using the large interphase sperm aster of the sea urchin zygote, which is historically a powerful system due to long range migration of the sperm aster to the geometric cell center following fertilization. First, through live-cell quantification of sperm aster growth and geometry, chemical manipulation of aster geometry, inhibition of dynein, and targeted chemical ablation, we show that the sperm aster migrates to the zygote center predominantly through a pushing-based mechanism that appears to largely independent of proposed pulling models. Second, we investigate the fundamental principles for how sperm aster size is determined during growth and centration. By physically manipulating egg size, we obtain samples of eggs displaying a wide range of diameters, all of which are at identical developmental stages. Using live-cell and fluorescence microscopy, we find strong preliminary evidence that aster diameter and migration rates show a direct, linear scaling to cell diameter. Finally, we hypothesize that a collective growth model for aster growth, or centrosome independent MT nucleation, may explain how the sperm aster of large sea urchin zygotes overcomes the proposed physical limitations of a pushing mechanism during large aster positioning. By applying two methods of super resolution microscopy, we find support for this collective growth model in the form of MT branching. Together, we present a model in which growth of astral MTs, potentially through a collective growth model, pushes the sperm aster to the zygote center. / Thesis (PhD) — Boston College, 2020. / Submitted to: Boston College. Graduate School of Arts and Sciences. / Discipline: Biology.

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La maladie d’Alzheimer, de nombreux syndromes parkinsoniens, certaines démences fronto-temporales telle que la maladie de Pick sont des exemples de maladies neurodégénératives appelées « tauopathies » qui sont caractérisées par la présence d’agrégats intracellulaires de protéines Tau dans le cerveau des sujets atteints. La formation de tels agrégats résulterait de l’altération des propriétés et fonctions normales des protéines Tau à réguler et structurer les réseaux de microtubules au sein des axones ; ce qui se traduit par une perte progressive de la masse des microtubules dans les axones, la désorganisation du transport axonal et au final la mort cellulaire. La compréhension des tauopathies passe donc par celle :- de la dynamique des microtubules qui est régie par les mécanismes de l’instabilité dynamique au cours desquels les microtubules alternent en permanence entre une phase de croissance (polymérisation des GTP-tubulines) et de rétrécissement (dissociation des GDP-tubulines);- et des interactions entre protéines Tau – microtubule qui jouent un rôle important dans la polymérisation, la stabilisation des microtubules et l’organisation spatiale du réseau de microtubules dans l’axone.L'objectif de ce travail de thèse est de construire et de consolider les bases qui permettront d'aller vers une modélisation fine de l'interaction des microtubules dynamiques avec une population de protéines Tau. Pour y parvenir, deux problèmes ont été abordés : (i) la dynamique intrinsèque des microtubules, c'est-à-dire en l'absence de protéines Tau et (ii) l'interaction Tau-Microtubule pour des microtubules stabilisés, c'est-à-dire non-dynamiques.Afin d’aborder ces problèmes, le travail de cette thèse a été mené selon deux approches :-Théorique : développements de modèles mathématiques décrivant les différents processus-Simulations numériques : développement de programmes Monte-Carlo (sous Matlab)Les résultats principaux ont été organisés et structurés en deux grandes parties :Développement d’un modèle mésoscopique décrivant l’instabilité dynamique des microtubules à l’échelle de la tubuline (unité fondamentale du microtubule). Ce modèle décrit une instabilité dynamique des microtubules non-Markoviènne dont les caractéristiques sont comparables aux observations expérimentales.2) Développement d’un modèle décrivant la dynamique de décoration d’un microtubule stabilisé (absence d’instabilité dynamique) par une population de protéines Tau. Les caractéristiques de ce modèle sont basées, pour la construction, et comparables aux expériences de cosedimentation et de microscopie électronique. / Alzheimer’s disease, some frontotemporal dementias such as the Pick’s disease are examples of neurodegenerative diseases called "Tauopathies" which are characterized by the presence of intracellular aggregates of Tau-proteins in the brain of patients. The formation of such aggregates would result from the loss of the normal functions of the Tau-proteins to properly organize the microtubule network within the axon ; which leads to a progressive loss of microtubule’s mass within the axons, the disorganization of the axonal transport and at the end, the cell death. To understand the Tauopathies, we have to understand :- the dynamic of microtubules which is controlled by the mechanisms of the dynamic instability in which microtubules switch between a phase of growth (polymerization of GTP) and a phase of shrinkage (dissociation of GDP)- the interaction between Tau-proteins and microtubules which play an important role in the polymerization, stabilization and spatial organization of microtubules within the axonal network.The objective of this work is to build and consolidate the blocks in order to go to precise modeling of the interaction of microtubules with a dynamic population of Tau-proteins. To this purpose, two problems were considered : (i) the intrinsic dynamic of microtubules (i.e., in absence of Tau-proteins) and (ii) the interaction between Tau-proteins and a stabilized-microtubules (i.e., in absence of dynamic instability)In order to this, the work has been done according to two approaches :- Theoretical : development of mathematical models describing the different process.- Simulation : development of Monte-Carlo programs (under Matlab)The main results have been organized in two main parts :1) Development of a mesoscopic model describing the dynamic instability of microtubules at the scale of the tubulin. This model describes the non-Markovian dynamic of microtubules and the characteristics are compatible with the experimental observations.2) Development of a model describing the dynamical decoration of a microtubule by a population of Tau-proteins. The characteristics of the model are based, for the construction, and compatible with the experimental observations.

L’objectif de la thérapie génique est de guérir des déficiences génétiques et de nombreuses maladies acquises par l'introduction d'acides nucléiques dans les cellules mammifères. Les vecteurs chimiques sont une alternative aux vecteurs viraux pour le transfert de gène, leur immunogénicité est réduite, en plus de leur faible coût et de la facilité de leur production. Jusqu'à présent, les liposomes et les polymères cationiques sont les vecteurs chimiques les plus étudiés et utilisés pour le transfert d'ADN plasmidique (ADNp) thérapeutique. Parmi les multiples barrières biologiques, la diffusion cytosolique limitée de l’ADNp est critique pour le niveau d'expression du transgène. Le but de ce travail de thèse était d'identifier un peptide de liaison à la dynéine, qui serait capable de recruter la protéine motrice dynéine et de faciliter le transport d’ADNp vers le noyau le long des microtubules. Nous avons donc étudié le réseau d'interaction de la protéine adénovirale E3-14.7K. E3-14.7K est indirectement en interaction avec la chaîne légère de la dynéine TCTEL1 par l’intermédiaire de FIP-1. Différentes techniques ont été utilisées pour analyser les interactions de ces différentes protéines telles que Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), Förster Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), immunoprécipitation et Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM). La technique de BRET nous a permis d'identifier un peptide de 20 acides aminés d'E3-14.7K (P79-98) responsable de son interaction avec FIP-1. Associé à des Quantum Dots P79-98 (P79-98-Qdot) colocalise avec les microtubules isolés et dans les cellules HeLa. Nous avons mis au point une méthode de greffage du peptide directement sur l’ADNp. Une fois greffé avec P79-98 l’ADNp est capable d'interagir avec les microtubules dans les cellules HeLa et de migrer activement jusqu’au noyau. P79-98 améliore l'efficacité de la transfection des HeLa jusqu’à 77%. / Gene therapy aims to cure genetic deficiencies and a large variety of acquired diseases by the introduction of nucleic acids into mammalian cells. As an alternative to viral gene delivery vectors, chemical vectors have been developed with reduced immunogenicity, in addition to low cost and ease of production. So far, cationic liposomes and cationic polymers are the most studied and used chemical vectors to transfer therapeutic plasmid DNA (pDNA). Among multiple biological barriers, the limited cytosolic diffusion of pDNA is critical for level of transgene expression. The goal of this work was to identify a dynein-binding peptide which would facilitate the transport of pDNA to the nucleus along microtubules. To this end, we have investigated interaction network of adenoviral protein E3 14.7K. E314.7K is indirectly interacting with Dynein Light Chain TCTEL1 through FIP-1. Different techniques have been used to analyze the protein interactions such as Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), Förster Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), immunoprecipitation and Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM). BRET technique allow us to identify a 20 amino acids peptide of E3 14.7K (P79-98) responsible for its interaction with FIP-1. Associated with Quantum Dots P79-98 (P79-98-Qdot) gave colocalizations with isolated microtubules and microtubules in HeLa cells. We have developed the grafting of the peptide directly on the pDNA. Once grafted with P79-98 pDNA is able to interact with microtubules in HeLa cells and traffick along them toward nucleus. Remarkably transfection efficiency of polyplexes is increased up to 77% in HeLa cells.

Kinesin superfamily motors have a well-characterized ability to move along microtubules and transport cargo. However, some members of the kinesin superfamily can also remodel microtubule networks by controlling tubulin polymerization dynamics and by organizing microtubule structures. The kinesin-8 family of motors play a central role in cellular microtubule length control and in the regulation of spindle size. These motors move in a highly processive manner along the microtubule lattice towards plus ends. Once at the microtubule plus end, these motors have complex effects on polymerization dynamics: kinesin-8s can either destabilize or stabilize microtubules, depending upon the context. My thesis work identified a tethering mechanism that facilitates the processivity and plus end-binding activity of Kip3 (kinesin-8 in budding yeast), which is essential for the destabilizing activity of kinesin-8 in cells. A concentration-dependent model was proposed to explain the divergent effects of Kip3 on microtubule dynamics. Moreover, a novel activity of Kip3 in organizing microtubules was discovered: Kip3 can slide anti-parallel microtubules apart. The sliding activity of Kip3 counteracts the depolymerizing activity of Kip3 in controlling spindle length and stability. A lack of sliding activity causes fragile spindles during the process of chromosome segregation in anaphase. The tail domain of Kip3, which binds both microtubules and tubulin dimers, plays a critical role in all these activities. Together, my work defined multiple mechanisms by which Kip3 remodels the microtubule cytoskeleton. The physiological importance of these regulatory mechanisms will be discussed.

La contraction musculaire est provoquée par un relâchement massif de calcium à partir du reticulum sarcoplasmique (RS) des cellules musculaires. Ce relâchement de calcium réalisé par le récepteur de la ryanodine (RyR1), s'effectue dans des structures membranaires spécialisées et très organisées : les triades. Cette architecture spécifique est essentielle à l'activité correcte de RyR1. Cependant, les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la formation et le maintien des triades ne sont pas connus. La triadine, qui est une protéine localisée dans la membrane du RS et qui est associée à RyR1, pourrait jouer un rôle dans la structure du reticulum sarcoplasmique pour permettre un relâchement de calcium efficace. L'équipe a montré que l'ablation du gène de la triadine chez la souris induisait une altération des relâchements de calcium et une modification de la forme des triades.Nous avons montré que la triadine pouvait indirectement interagir avec les microtubules et qu'elle pourrait ancrer le RS aux microtubules (Fourest-Lieuvin, J Cell Science, 2012). Par analyse en spectrométrie de masse des protéines co-immunoprécipitées avec la triadine, nous avons identifiéun nouveau partenaire de la triadine, CLIMP-63 qui pourrait être impliqué dans cette fonction. CLIMP-63 est décrite comme une protéine capable d'ancrer le reticulum aux microtubules et de maintenir la forme du reticulum endoplasmique. Nous avons ensuite confirmé son interaction avec la triadine par différentes approches dans différents modèles cellulaires. L'étude et la caractérisation de CLIMP-63 dans le muscle sont tout à fait innovantes et nous avons étudié les conséquences de l'association triadine/CLIMP-63 pour la fonction du muscle et dans la formation ou la maintenance des triades. / Muscle contraction is achieved when an efficient excitation signal at the plasma membrane triggers intracellular calcium release. This process called “excitation-contraction (E-C) coupling” relies on a macromolecular protein complex, spanning the plasma membrane and the sarcoplasmic reticulum (SR), containing the calcium channel of the SR, the ryanodine receptor (RyR1). This calcium release complex is present exclusively in highly organized membrane structures called triads. A triad is composed of two SR terminal cisternae surrounding a plasma membrane transverse-tubule.This architecture is essential to sustain the activity of the calcium channel RyR1, which is located in the membrane of SR terminal cisternae. However, little is known about the molecular mechanisms allowing the formation and maintenance of SR terminal cisternae. Triadin is a member of this complex, present in the SR membrane and interacting with RyR1. Deletion of the triadin gene leads to partial disorganisation of SR membranes in skeletal muscles, with abnormal orientation of part of the triads. Triadin could play a role in the structure of sarcoplasmic reticulum to allow efficient E-C coupling. We have shown that triadin could indirectly interact with the microtubules, and therefore anchor the sarcoplasmic reticulum to the microtubule network (Fourest-Lieuvin, J Cell Science, 2012). Using mass spectrometry analysis of proteins co-immunoprecipitated with triadin, we have identified a new partner of triadin, CLIMP-63 which could be involved in this function. CLIMP-63 is a shaping protein able to mediate the anchoring of the reticulum to microtubules and to maintain the shape of endoplasmic reticulum. We have dissected the interacting domains between CLIMP-63 and triadin, and study the consequences of this association for muscle function, and triad formation or maintenance.

Résumé Les protéines XMAP215/ch-TOG appartiennent à une famille de protéines associées aux microtubules (MAPs), bien conservée tout au long de l'évolution, la famille XMAP215/Dis1. Cette famille joue un rôle dans la régulation du cytosquelette des microtubules (MT), en particulier pendant la division cellulaire. Chez l'humain, ch-TOG est la protéine surexprimée dans les tumeurs du colon et du foie, une protéine qui provient de cellules blastiques et de plusieurs formes de cancer. Certaines protéines XMAP215/ch-TOG ont été retrouvées dans différentes localisations cellulaires, toujours reliées aux MTs, donnant origine à une activité spécifique. Cependant, la localisation exacte de XMAP215/ch-TOG ainsi que son activité restait à être déterminées. Dans ce contexte scientifique, nous avons développé une série d'anticorps monoclonaux (mcAB) qui nous ont permis d'identifier deux populations différentes de la famille des protéines XMAP215/Dis1. Les images de microscopie confocale des cellules fixées ont montré une première localisation, la colocalisation bien connue XMAP215-microtubulaire (MT-XMAP215) qui s'observe pendant l'interphase et pendant la mitose (fuseau mitotique). Une deuxième localisation a été identifiée sur le bout plus des MTs, donnant XMAP215/ch-TOG comme faisant parti de la famille des protéines de bout plus (+TIPs). Cette deuxième colocalisation a été identifiée comme +TIP XMAP215/ch-TOG. La +TIP XMAP215 est la protéine la plus distale du bout des MTs. La hiérarchie a été établie en faisant la comparaison de la localisation de XMAP215/ch-TOG avec les protéines les plus connues du bout plus, telles qu'EB1, CLIP170 et p150Glued. Dans l'extrait mitotique de Xenopus laevis, les images obtenues in vivo par la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont permis d'identifier une +TIP XMAP215 présente au bout des MTs qui polymérisent et dépolymérisent. Les images de microscopie cryo-électronique (Cryo-EM) ont montré une activité spécifique de la population +TIP XMAP215. Dans les solutions de tubuline pure, XMAP215 induit la formation de structures au bout des MTs, cette activité est compatible avec les mécanismes de croissance des MTs. Sur la base de nos résultats, nous proposons un modèle où XMAP215 se charge des dimères de tubuline en devenant une structure de type protofilament. Cette structure se lie au bout du MT en utilisant son domaine C-terminal, en rajoutant les dimères de tubuline et aussi certainement en participant à la fermeture de la structure microtubulaire même. La protéine interviendrait donc dans la dépolymérisation et aurait un rôle dans le mécanisme de dépolymérisation contrôlée. Une fois que l'addition de tubuline a eu lieu, la +TIP XMAP215 pourrait évoluer en MT-XMAP215, la forme la plus connue de la protéine qui a été associée au trafic des granules d'ARN. Mots cles : XMAP215, ch-TOG, microtubules, anticorps monoclonaux. / Summary XMAP215/ch-TOG are members of an evolutionary conserved family of microtubule-associated proteins (MAPs), the XMAP215/Dis1 family. This family of proteins plays a key role in the regulation of the microtubule (MT) cytoskeleton, particularly during the cell division. In humans, ch-TOG is the colon-hepatic tumor overexpresed gene, a protein whose sequence was originally reported from blastic cells and from several forms of cancer. A few members of the XMAP215/ch-TOG family have been found to be present in different cell localizations, always MT-related, perhaps providing in this way a selected activity. However, the XMAP215/ch-TOG exact localization and activity has remained as a theory to be probed. In this scientifical context, we developed a series of monoclonal antibodies (mcABs) that allow us to identify two different populations of the XMAP215/ Dis1 family of proteins. Confocal images of fixed cells revealed a first and well known XMAP215/ch-TOG population, a microtubular-XMAP215 (MT-XMAP215), co-localizing with microtubules (MTs) in interphase and mitotic spindle. A second localization was identified at the tips of growing MTs, placing XMAP215/ch-TOG as one more member of the known microtubule plus end tracking proteins (+TIPs). This second population was identified as the +TIP XMAP215/ch-TOG. The + TIP XMAP215 is the most distal +TIP protein at the tip of MTs. The + TIPs hierarchy was established comparing the XMAP215/ch-TOG localization with other well known + TIPs proteins such as EB1, CLIP170 and p150Glued. In the Xenopus laevis mitotic egg extract, the Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) In vivo images, identified a +TIP XMAP215 that is present at the tip of polymerizing and depolymerising MTs. Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) images probed a selective activity for the +TIP XMAP215 population. In pure tubulin solutions XMAP215 shown to promote the formation of outwardly sheet structures at the tip of MTs, compatible with growing mechanisms in MTs. Based in our results we propose a model where free XMAP215 is previously loaded with tubulin dimers to become a protofilament-like structure. This structure joins the MT tip using its C-terminal domain, not only adding the tubulin dimmers but also perhaps participating in the MT sheet closure. The possibility that the protein participates in the MT depolymerization could be associated to a “controlled” depolymerization mechanism. Once the tubulin addition has taken place, the +TIP XMAP215 protein could evolve to a MT-XMAP215, the well know form of the protein that has been related to the RNA granules traffic. Key words: XMAP215, ch-TOG, microtubules, monoclonal antibodies.

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