Molecular-targeting therapeutics directed towards growth factor receptors have become promising interventions in cancer. They include the family of mammalian receptor tyrosine kinases such as epidermal growth factor, TrkA and insulin. In particular, the insulin receptor (IR) is one of the most well-known members of the RTK family of receptors playing a role in cancer. IRs are covalently-linked heterodimers of αβ subunits on the cell membrane in the absence of insulin. The IR signaling pathways are initially triggered by insulin binding to the α subunits followed by the interaction of β subunits and ATP. The parameter(s) controlling IR activation remains unknown. Here, we report a membrane receptor signaling platform initiated by insulin binding to its receptor to induce Neu1 in live HTC-IR and MiaPaCa-2 cell lines. Microscopy colocalization and co-immunoprecipitation analyses reveal that Neu1 and MMP9 form a complex with naïve and insulin-treated receptors. Tamiflu (neuraminidase inhibitor), galardin and piperazine (broad range MMP inhibitors), MMP9 specific inhibitor and anti-Neu1 antibody blocked Neu1 activity associated with insulin stimulated live cells. Moreover, Tamiflu, anti-Neu1 antibody, and MMP9 specific inhibitor blocked insulin induced insulin receptor substrate-1 phosphorylation (p-IRS1). The previous findings reveal a molecular organizational signaling platform of Neu1 and MMP-9 crosstalk in alliance with insulin receptors. It proposes that insulin binding to the receptor induces MMP9 to activate Neu1, which hydrolyzes α-2,3 sialic acid in removing steric hindrance to generate a functional receptor. The results predict a prerequisite desialylation process by activated Neu1. A complete understanding of IR activation and the role of sialic acids in the iii signaling pathways may provide a therapeutic strategy in the prevention of different diseases such as diabetes mellitus and cancer. / Thesis (Master, Microbiology & Immunology) -- Queen's University, 2013-02-20 11:27:44.861

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A degradação da matriz extracelular e de proteínas da parede aórtica associada à inflamação é uma das principais características dos aneurismas da aorta abdominal (AAA). O objetivo deste trabalho foi investigar a participação das metaloproteinases 2 e 9 na formação de AAAs, através de um modelo experimental inédito de indução de AAA em ratos Wistar, desencadeado por duas potenciais causas de secreção e ativação de MMP-2 e 9: alteração do fluxo sanguíneo e lesão vascular externa na aorta. A formação de aneurismas foi observada em 60%-70% dos animais, apresentando diâmetro de 7 a 8 vezes maior que o diâmetro normal da aorta. Histologicamente observou-se remodelamento, intensa resposta inflamatória, destruição maciça de fibras elásticas e aumento da síntese de colágeno na parede aórtica. A expressão de ambas as formas de MMP-2 foram observadas tanto nos AAAs como nos grupos controles, neste com menor atividade, entretanto a expressão da pró e da MMP-9 ativa foram encontradas apenas nos AAAs. Conclusão: Nossos resultados sugerem que tanto as MMP-2 quanto as MMP-9 apresentam importante papel no desenvolvimento de AAA e este novo modelo de indução de AAA, pode ajudar a elucidar os mecanismos que desencadeiam a secreção e ativação das MMP-2 e MMP-9 na formação de aneurismas. / Degradation of extracellular matrix and proteins associated with inflammation of the aortic wall is the main characteristics of the abdominal aortic aneurysms (AAA). The aim of this study was investigate the participation of Metalloproteinase 2 and 9 in AAA formation in Wistar rats. A novel experimental model of AAA was developed, providing two potential causes of MMPs secretion and activation, turbulent flow (caused by surgically induced extrinsic stenosis) and outside vascular injury is detailed described. The days analyzed were the 3rd and the 7th post surgery. Aneurysms were observed to occur in 60-70% of the Group AAA, exhibiting a major transversal diameter to 7 from 8 times larger than controls and sham groups. Histologically, the aneurysms wall showed extensive structural remodeling, intense inflammatory response, massive elastic fibers destruction and abundant collagen deposition. Increased pro- and active MMP-2 was demonstrated in the AAA and controls groups, whereas pro- and active MMP-9 were found to be expressed only in the AAA group. Conclusions: MMP-2 and MMP-9 may have a pivotal role in the development of experimental AAA. This model can help to elucidate the mechanisms which trigger off MMP-2 and MMP-9 secretion and activation causing aneurysms.

Introdução: O câncer de próstata (CaP) é o tumor mais freqüente do homem no Brasil tendo sido estimados mais de 52.350 novos casos em 2010, sendo a segunda causa de óbito por câncer em homens. O prognóstico depende fundamentalmente dos níveis séricos de Prostatic Specific Antigen (PSA) estádio tumoral (TNM) e grau de diferenciação histológica (Gleason). Porém esses têm sido insuficientes na definição do prognóstico da neoplasia. Por isso pesquisas têm sido direcionadas para a identificação de alterações moleculares que possam prever o potencial de agressividade do câncer de próstata. Metaloproteinases da matriz (MMP) são proteínas pertencentes a uma família de aproximadamente 30 enzimas proteolíticas ou endoproteinases que degradam vários componentes da matriz extracelular. A detecção de sua expressão tem sido estudada como marcador sensível e específico de vários tumores, principalmente as MMP pertencentes ao grupo das gelatinases MMP-2 e MMP-9. Objetivo: o objetivo deste nosso trabalho foi avaliarmos pela técnica de qRT-PCR e imuno-histoquímica os níveis de expressão dos genes das MMP pertencentes ao grupo das gelatinases, MMP-2 e MMP-9, bem como outros sabidamente envolvidos em suas vias de ativação (MMP-14, IL-8) e inibição (TIMP-1, TIMP-2, RECK e TGF-) no câncer localizado de próstata. Material e Métodos: O estudo consistiu na análise de espécimes de 79 pacientes com câncer da próstata submetidos a prostatectomia radical entre setembro de 1997 e fevereiro de 2000. Esses oito genes foram então testados quanto a seu valor prognóstico no câncer da próstata através da técnica de reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcriptase reversa (qRT-PCR). Análise proteica foi feita a partir de 40 pacientes deste pool. O grupo controle foi composto de tecido de 11 pacientes com hiperplasia benigna da próstata (HPB) tratados cirurgicamente com prostatectomia retropúbica. Resultados: MMP-9 esteve superexpressa e MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP 14, IL-8, TGF- e RECK se mostraram subexpressos em tecido representativo de CaP quando comparado com HPB. A análise dos níveis de expressão dos genes com o escore de Gleason, mostrou que MMP-2 e TIMP-2 mesmo mantendo-se subexpressos, tiveram uma expressão maior entre os pacientes que apresentavam Gleason 7 (p=0,04 e p=0,02 respectivamente). De acordo com o valor de PSA préoperatório, encontramos diferenças na expressão de MMP-9. Pacientes que apresentavam um PSA pré-operatório 10 ng/mL possuíam uma mediana de expressão maior que aqueles cujo PSA pré-operatório <10 ng/mL com medianas de expressão de 5,62 e 2,76 respectivamente (p=0,033). Não encontramos diferenças estatísticas entre pacientes que apresentavam ou não recidiva bioquímica quanto a expressão dos 8 genes estudados. Porém o gene da MMP-9 apresentou uma diferença estatística marginal apresentando uma mediana de expressão de 6,29x nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica e de 3,25 nos pacientes que não apresentaram recidiva bioquímica (p=0,090). De acordo com a expressão proteica, encontramos uma maior positividade em MMP-9, MMP-2, TGF-, IL-8 e MMP-14. De acordo com os fatores prognósticos encontramos associação de TIMP-1 com recidiva bioquímica. Conclusão: Encontramos uma superexpressão de MMP-9 e uma subexpressão de MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, IL-8 e TGF- no CaP. Considerando os fatores prognósticos encontramos que aumentados níveis de expressão do gene da MMP-9 associou-se a aumentados níveis de PSA, e mostrou uma tendência de associação com recidiva bioquímica. De acordo com a expressão proteica encontramos que a ausência de TIMP-1 pode ser um indicativo de recidiva bioquímica / Introduction: Currently, Prostate cancer (PCa) is the most common tumor in men in Brazil. It was estimated that more than 52,350 new cases were diagnosed in 2010, being the second cause of death by cancer in man. The prognosis depends mainly on Prostate Specific Antigen (PSA) serum levels, tumor stage (TNM) and histological grade (Gleason), but these parameters, even combined, are insufficient to define the correct prognosis of PCa. Therefore research has been directed towards the identification of molecular alterations that may predict potential aggressiveness of PCa. Matrix metalloproteinases (MMPs) are proteins that belong to a family of about 30 proteolytic enzymes that degrade various components of the extracellular matrix. The analysis of MMPs expression has been studied as a sensitive and specific marker of prognosis of several tumors, and special attention was focused in the group of gelatinases, MMP-2 and MMP-9.Objective: The aim of this study was to evaluate the expression levels of MMP-2 and MMP-9 genes and proteins by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and immunohistochemistry in localized PCa. We also evaluated the expression of genes that are involved in the control of MMP-2 and MMP as activators (MMP- 14, IL-8) or inhibitors (TIMP-1, TIMP-2, RECK and TGF-).Materials and Methods: The casuistic consisted of 79 surgical specimens from patients with localized PCa who underwent radical prostatectomy between September 1997 and February 2000. The control group was composed of specimens from 11 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) treated surgically with retropubic prostatectomy. The results of the 8 genes expression, through qRTPCR and immunohistochemistry, were correlated to the diagnosis and prognosis of PCa. The protein expression analysis was carried out in 40 patients of the casuistic. Results: The MMP-9 was overexpressed, while MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, IL-8, and TGF- were underexpressed in malignant prostate tissue compared to BPH. Patients with Gleason7 had higher expression of MMP-2 and TIMP-2 (p=0.04, p=0.02 respectively). According to the preoperative PSA value, we found that patients with preoperative PSA10 ng/mL had a median of expression of 5.62 compared to 2.76 when PSA<10 ng/mL (p=0.033). There were no statistical differences between expression of the eight genes and biochemical recurrence during follow up. However, the higher MMP-9 expression was marginally associated with recurrence, the median was of 6.29 in recurrence patients compared to 3.25 in those without recurrence (p=0.090). Regarding the protein expression, we found a higher positivity of MMP-9, MMP-2, TGF-, IL-8 e MMP-14 expression in PCa, and a correlation between the lack of TIMP-1 and tumor recurrence. Conclusion: MMP-9 is overexpressed while MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, MMP-14, RECK, TGF- and IL-8 are underexpressed in CaP. According to the prognostic factors, we observed that increased level of MMP-9 was associated with pre-surgical PSA10 ng/mL. Also there was a tendency of association between higher MMP- 9 expression and biochemical recurrence. Overexpression of MMP-9 can be explained by the underexpression of their major inhibitors TIMP-1 and RECK. According to protein expression we found that absence of TIMP-1 is correlated with biochemical recurrence in the PCa

O osso é um tipo especializado de tecido com alto teor mineral e desempenha variadas funções no organismo, como a reserva de cálcio, proteção de estruturas vitais e alavanca para a movimentação dos musculos. Constantemente o osso passa por processos de remodelação, o que mantém sua estrutura funcional e repara pequenas fraturas que ocorrem normalmente devido ao estresse do uso contínuo. O sistema de reparo funciona em perfeita sincronia mediante células que produzem os componentes ésseos e células que os reabsorvem permitindo a organização do tecido. Esse sistema de manuteção depende da interação entre estas células bem como dos sinais enviados por mediadores e moduladores. Varias proteínas funcionam como indutores de formação óssea, mas também no sentido de facilitar essa reconstrução. Dentre estas proteínas se encontram as BMPs, que possuem grande potencial osteoindutor, e MMPs, que atuam em diversas fases da construção e manutenção deste tecido. Particularmente a BMP-2 tem mostrado um potencial significativo em termos de indução e sua forma recombinante a rhBMP-2, produzida por engenharia recombinante, foi liberada para comercialização e utilizacao clínica. Quanto às MMPs, há importante função das MMP-2 e MMP-9 neste tecido. A primeira estruturando a matriz e modulando o processo de reabsorção nos processos inflamatórios inerentes ao reparo; a segunda atuando desde fases iniciais às tardias, produzida principalmente por osteoclastos e utilizada na remodelação do osso novo. Porém, esta capacidade de reparo do osso é limitada e defeitos ósseos de grande extensão exigem muito do organismo, podendo levar a um reparo que não se estrutura devidamente. Assim, várias técnicas foram propostas para estimular o desenvolvimento ósseo e a utilizacao de enxertos se mostrou eficaz para fornecer um arcabouço de crescimento, facilitando a implantacao do osso neofomado e protegendo o leito do defeito durante todo o extenso período de recuperação. O presente estudo enfocou três diferentes tipos de enxerto ósseo (autólogo, homólogo e heterólogo) e suas associações com a proteína rhBMP-2, verificando sob o aspecto bioquímico a relação de cada um com a quantidade de MMP-2 e MMP-9 em dois tempos de reparo diferentes. De maneira geral, verificou-se que no primeiro momento há maior produção de MMP-2 e os níveis de MMP-9 se mantém de forma relativamente constante nos dois tempos cirúrgicos. O enxerto autólogo apresenta melhores resultados, seguido dos obtidos no enxerto homólogo e heterólogo respectivamente, entretanto a adição de rhBMP-2 a estes enxertos não parece influenciar nos níveis de MMP-2 e MMP-9 nos dois períodos. A dosagem de cálcio revelou que se apresentavam mais mineralizados os grupos de enxerto autólogo e homólogo, os demais grupos além de apresentar menores niveis de cálcio, ainda decresceram nestes níveis no segundo período do experimento. / Bone is a special tissue with a high mineral content and performs various functions in the body, such as calcium reserves, protection of vital structures and muscles lever during the movement. Bone constantly undergoes remodeling processes, which keeps its functional structure and repair small fractures that commonly occur due to the stress of continuous use. The repair system works perfectly synchronized by the cells that produce bone components and resorbing cells, allowing the perfect tissue organization. This maintenance system depends on the interaction between these cells and the signals sent by mediators and modulators. Several proteins operate to induce bone formation, but also to facilitate the reconstruction. Among these proteins are the BMPs, which have great osteoinductive potential, and MMPs that act at different stages of construction and maintenance of this tissue. Particularly BMP-2 has shown significant potential in terms of induction and its recombinant form, rhBMP-2, produced by recombinant engineering, has been released for clinical use and commercialization. In relation to MMPs, there are important functions of MMP-2 and MMP-9 in this tissue. First, structuring the matrix and modulating the resorption during inflammatory processes inherent to repair; second, acting at early to later stages, produced mainly by osteoclasts and used during bone remodeling. However, this repair capacity is limited and large bone defects require a lot of strength of the body, may leading to a bone repair not well structured. Thus, several proposed techniques to stimulate the development and use of bone grafts were effective to provide a framework for growth, facilitating the implementation of new bone and protecting the defect bed throughout the extended recovery period. This study focused on three different types of bone graft (autologous, homologous and heterologous) and their association with rhBMP-2 protein, evaluating the biochemical aspects according to the amount of MMP-2 and MMP-9 in two different periods of time. In general, it was found that firstly, there is an increased production of MMP-2, and MMP-9 levels remain relatively constant in both considered periods of time. The autologous graft presented the best results followed by homologous and heterologous, respectively; however the addition of rhBMP-2 in these grafts did not seem to influence the MMP-2 and MMP-9 levels, in both periods of time. The calcium dosage revealed more mineralization at the autologous and homologous groups, the other groups, besides having lower calcium levels, decreased these levels at the second period of this experiment.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / As metaloproteinases-2 (MMP-2) e -14 (MMP-14) e o inibidor tecidual de metaloproteinases tipo 2 (TIMP-2) participam de modo fundamental na transiÃÃo epitelial-mesenquimal e progressÃo tumoral-linfonodal de muitos tipos de cÃncer, inclusive o gÃstrico. O objetivo deste trabalho à avaliar a expressÃo das trÃs enzimas no carcinoma gÃstrico e metÃstases linfonodais e suas possÃveis participaÃÃes na progressÃo tumoral. Foram utilizados 83 casos de gastrectomias por cÃncer gÃstrico (histotipo intestinal = 53 casos; difuso = 30 casos), e seus respectivos linfonodos, dos arquivos do Departamento de Patologia e Medicina Legal/UFC. Foi realizado tissue microarray e imunohistoquÃmica com anticorpo monoclonal anti-MMP-2, anti-MMP-14 e anti-TIMP-2, avaliada atravÃs dos seguintes escores: 0 = ausÃncia de imunomarcaÃÃo ou raras cÃlulas marcadas (< 5%); 1 = marcaÃÃo discreta na maioria (> 50%) das cÃlulas tumorais ou inflamatÃrias mononucleadas (muitos dos quais identificados como macrÃfagos pelo CD68) ou marcaÃÃo moderada em minoria de cÃlulas (< 50%); 2 = marcaÃÃo moderada na maioria (> 50%) das cÃlulas tumorais ou inflamatÃrias mononucleadas ou marcaÃÃo intensa em minoria de cÃlulas (< 50%); 3 = marcaÃÃo intensa na maioria (> 50%) das cÃlulas tumorais ou inflamatÃrias mononucleadas. A expressÃo de MMP-2, MMP-14 e TIMP-2 nos mononucleares associados a tumores ocorreu com maior frequÃncia comparada à imunomarcaÃÃo em mononucleares da mucosa normal, com diferenÃa significativa em relaÃÃo a TIMP-2 (40/53 vs 12/26; *p = 0,0128, teste exato de Fisher). MMP-2 foi muito mais presente nas mulheres (p = 0,0248) enquanto TIMP-2 ocorreu predominantemente apÃs os 50 anos (p = 0,0034). A expressÃo dos trÃs biomarcadores nos carcinomas gÃstricos primÃrios foi muito superior nos mononucleares, em relaÃÃo Ãs cÃlulas neoplÃsicas, sobretudo para a MMP-2 (16/46 vs 5/46; *p = 0,0118), que tambÃm prevaleceu em mononucleares das metÃstases linfonodais em tumores dos histotipos intestinal e difuso (13/16 vs 4/19; ***p = 0,0006). Neste estudo, a expressÃo preponderante dos trÃs imunomarcadores pelos mononucleares do conjuntivo reforÃa o papel central destas cÃlulas e do microambiente tumoral na progressÃo do cÃncer gÃstrico. A maior expressÃo de TIMP-2 no sÃtio primÃrio à sugestiva do efeito inibitÃrio desta enzima sobre MMP-2 e MMP-14, que parecem participar principalmente em fases mais avanÃadas da progressÃo tumoral-linfonodal. A MMP-14, atravÃs dos mononucleares, parece estar mais envolvida na progressÃo do cÃncer gÃstrico difuso do que a MMP-2 e seu inibidor tissular.

A degradação da matriz extracelular e de proteínas da parede aórtica associada à inflamação é uma das principais características dos aneurismas da aorta abdominal (AAA). O objetivo deste trabalho foi investigar a participação das metaloproteinases 2 e 9 na formação de AAAs, através de um modelo experimental inédito de indução de AAA em ratos Wistar, desencadeado por duas potenciais causas de secreção e ativação de MMP-2 e 9: alteração do fluxo sanguíneo e lesão vascular externa na aorta. A formação de aneurismas foi observada em 60%-70% dos animais, apresentando diâmetro de 7 a 8 vezes maior que o diâmetro normal da aorta. Histologicamente observou-se remodelamento, intensa resposta inflamatória, destruição maciça de fibras elásticas e aumento da síntese de colágeno na parede aórtica. A expressão de ambas as formas de MMP-2 foram observadas tanto nos AAAs como nos grupos controles, neste com menor atividade, entretanto a expressão da pró e da MMP-9 ativa foram encontradas apenas nos AAAs. Conclusão: Nossos resultados sugerem que tanto as MMP-2 quanto as MMP-9 apresentam importante papel no desenvolvimento de AAA e este novo modelo de indução de AAA, pode ajudar a elucidar os mecanismos que desencadeiam a secreção e ativação das MMP-2 e MMP-9 na formação de aneurismas. / Degradation of extracellular matrix and proteins associated with inflammation of the aortic wall is the main characteristics of the abdominal aortic aneurysms (AAA). The aim of this study was investigate the participation of Metalloproteinase 2 and 9 in AAA formation in Wistar rats. A novel experimental model of AAA was developed, providing two potential causes of MMPs secretion and activation, turbulent flow (caused by surgically induced extrinsic stenosis) and outside vascular injury is detailed described. The days analyzed were the 3rd and the 7th post surgery. Aneurysms were observed to occur in 60-70% of the Group AAA, exhibiting a major transversal diameter to 7 from 8 times larger than controls and sham groups. Histologically, the aneurysms wall showed extensive structural remodeling, intense inflammatory response, massive elastic fibers destruction and abundant collagen deposition. Increased pro- and active MMP-2 was demonstrated in the AAA and controls groups, whereas pro- and active MMP-9 were found to be expressed only in the AAA group. Conclusions: MMP-2 and MMP-9 may have a pivotal role in the development of experimental AAA. This model can help to elucidate the mechanisms which trigger off MMP-2 and MMP-9 secretion and activation causing aneurysms.

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