Abstract Visceral leishmaniasis is a devastating neglected parasitic disease caused by infection with Leishmania donovani. It life cycle has two stages with promastigote (insect stage) and amastigote (animal stage) morphologies. Miltefosine is currently the only commercially available oral drug available to treat leishmaniasis and recent evidence suggests clinical resistance has emerged. Due to the importance of this drug and the scarcity of new drugs in the pipeline, work has been done on understanding the mechanism(s) of miltefosine, yet the mechanism of action for resistance is still not known. In previous studies investigators generated miltefosine resistance on the insect vector stage (promastigotes), yet there is an important gap in understanding miltefosine resistance in the human infectious stage (amastigotes) of the disease. Before we could accomplish this goal a L. donovani cell line was converted into a stable, continuously cultured axenic amastigote cell line and characterized by disease burden generated in vitro and in vivo. The axenic line of L. donovani (MHOM/SD/75/1246/130) retains characteristics of amastigotes infecting macrophages and proliferated better than metacyclic promastigotes in macrophages in vitro and hamsters. The axenic amastigote line was used to induce miltefosine resistance by using discontinuous stepwise increasing drug pressure. Stable high-grade resistance was established (62-fold) and characterized in vitro and in vivo. Lastly, the fitness of miltefosine resistant versus susceptible parasite was established for the first time. This work adds the first efforts characterizing and understanding the complex problem of miltefosine resistance in amastigotes.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(エネルギー科学) / 甲第20097号 / エネ博第344号 / 新制||エネ||69(附属図書館) / 33213 / 京都大学大学院エネルギー科学研究科エネルギー社会・環境科学専攻 / (主査)教授 坂 志朗, 教授 髙野 俊幸, 准教授 河本 晴雄 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Energy Science / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24802号 / 医博第4994号 / 新制||医||1067(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 石見 拓, 教授 近藤 尚己, 教授 湊谷 謙司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(農学) / 乙第13346号 / 論農博第2889号 / 新制||農||1080(附属図書館) / 学位論文||R2||N5253(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻 / (主査)教授 菅原 達也, 教授 佐藤 健司, 教授 澤山 茂樹 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

Au siècle dernier, les maladies infectieuses avaient pu être endiguées dans les pays développés grâce au développement des antibiotiques. Cependant, l’apparition de bactéries résistantes aux traitements antimicrobiens remet ce problème de santé publique au premier plan. De plus, on observe l’apparition de poly-résistances de plus en plus fréquentes, notamment en milieu hospitalier, et les organisations de santé ont donc, depuis le début des années 2000, appelé à utiliser les antibiotiques avec parcimonie afin de stopper la propagation des résistances. Aujourd’hui, un effort doit être fait pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.Une des voies envisagées consiste à cibler le système de communication appelé quorum sensing que les bactéries utilisent pour réguler de façon concertée l’expression de leurs gènes afin de s’adapter aux pressions environnementales. Le quorum sensing est basé sur l’échange de molécules signal sécrétées appelées phéromones qui sont détectées par des récepteurs transmembranaires ou cytoplasmiques appelés quorum senseurs.Chez les pathogènes à Gram positif, des phéromones peptidiques re-internalisées par les bactéries viennent réguler l’activité des quorum senseurs appelés RNPP, pour les premiers membres identifiés : Rap, NprR, PlcR et PrgX. Ces systèmes de quorum sensing régulent le changement de comportement de la population bactérienne. Ils sont impliqués dans des processus cellulaires importants tels que la sporulation, la formation de biofilm, la compétence et la virulence.Mon projet a porté sur l’analyse structure-fonction de deux des membres de la famille : NprR, du groupe Bacillus cereus, et ComR, un nouveau membre récemment identifié chez les Streptocoques. En combinant la cristallographie aux rayons X avec des approches biochimiques et génétiques, nous avons pu élucider le mécanisme moléculaire qui régule l’activité de ces deux systèmes de quorum sensing.NprR est un régulateur bifonctionnel qui, chez Bacillus thuringiensis, régule la survie de la bactérie jusqu’à la sporulation dans le cadavre des insectes infectés par cet entomopathogène. Alors que NprR agit comme régulateur transcriptionnel en présence de son peptide signal NprX, nous avons montré qu’en son absence il fixe la phosphotransférase Spo0F et agit comme inhibiteur de la sporulation.ComR régule quant à lui l’état de compétence qui permet aux streptocoques de prélever une molécule d’ADN libre dans leur environnement. Nous avons mis en évidence un mécanisme de régulation par le peptide ComS différent de celui des autres régulateurs transcriptionnels de la famille RNPP. Enfin, la spécificité du peptide pour son régulateur a également été caractérisée.Enfin, la comparaison de ces résultats avec les données structurales des autres RNPP nous a permis de mettre en évidence un mode de fixation du peptide conservé mais un mécanisme d’activation propre à chaque membre de la famille. Cette étude pose donc les bases structurales nécessaires à la mise au point rationnel d’inhibiteurs de RNPP pouvant répondre au problème de résistance aux antibiotiques dans la lutte contre la recrudescence des maladies infectieuses. / In the last century, infectious diseases had been successfully stopped in developed countries through the development of antibiotics. However, the emergence of bacteria resistant to the antimicrobial treatments brings this public health issue back at the forefront of concerns. In addition, increasing appearance of poly resistances is observed since the early 2000s, particularly in hospitals, and healthcare organizations have therefore called to a reduction of the use of antibiotics in order to stop the spread of resistances. Today, an effort should be made to the development of new therapeutic strategies.One of the approaches consists in targeting the communication system called quorum sensing used by the bacteria to regulate the expression of their genes in a concerted manner in order to adapt to their environment. Quorum sensing is based on the exchange of secreted signaling molecules called pheromones, which are detected by transmembrane or cytoplasmic receptors called quorum sensors.In pathogenic Gram positive bacteria, peptidic pheromones re-internalized by bacteria regulate the activity of quorum sensors called RNPP for the first identified members: Rap, NprR, PlcR and PrgX. These quorum sensing systems regulate behavior changes in the bacterial population. They are involved in important cellular processes such as sporulation, biofilm formation, competence and virulence.My project focused on the structure-function analysis of two members of the RNPP family: NprR, from the Bacillus cereus group, and ComR, a new member recently identified in Streptococci. By combining X-ray crystallography with biochemical and genetic approaches, we were able to elucidate the molecular mechanism that regulates the activity of these two quorum sensing systems.NprR is a bifunctional regulator which, in Bacillus thuringiensis, regulates the survival of the bacteria until sporulation in the cadaver of insects infected by this entomopathogene. While NprR acts as a transcriptional regulator in the presence of its peptide signal NprX, we showed that in its absence, NprR binds to the phosphotransferase Spo0F and acts as inhibitor of sporulation.ComR regulates the competence state that allows Streptococci to uptake free DNA molecules in their environment. We showed that the regulatory mechanism of its cognate peptide ComS is different from other transcriptional regulators of the RNPP family. The specificity of the peptide for its regulator was also characterized.Finally, a comparison of these results with the structural data of other RNPP allowed us to demonstrate a conserved peptide binding mode but an activation mechanism specific to each family member. This study thus brings the structural basis for the future rational design of RNPP inhibitors which may help respond to the antibiotic resistance problem in the fight against the resurgence of infectious diseases.

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Mucosa associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma is characterized by t(11;18)(q21;q21)/API2-MALT1, t(1;14)(p22;q32)/BCL10-IGH andt(14;18)(q32;q21)/IGH-MALT1, which commonly activate the NF-κB pathway. Gastric MALT lymphomas harbouring such translocation do not respond to Helicobacter pylori eradication, while those without translocation can be cured by antibiotics. To understand the molecular mechanism of MALT lymphoma with and without chromosome translocation, 24 cases (15 translocation-positive and 9 translocation-negative) of MALT lymphomas together with 7 follicular lymphomas and 7 mantle cell lymphomas were analysed by Affymetrix gene expression microarray platform. Unsupervised clustering showed that cases of MALT lymphoma were clustered as a single branch. However, within the MALT lymphoma group, translocation-positive cases were intermingled with translocation-negative cases. Gene set enrichment analysis (GSEA) of the NF-κB target genes and 4394 additional gene sets covering various cellular pathways, biological processes and molecular functions showed that translocation-positive MALT lymphomas were characterized by an enhanced expression of NF-κB target genes, particularly TLR6, CCR2, CD69 and BCL2, while translocation-negative cases were featured by active inflammatory and immune responses, such as IL8, CD86, CD28 and ICOS. Separate analyses of the genes differentially expressed between translocation-positive and negative cases and measurement of gene ontology term in these differentially expressed genes by hypergeometric test reinforced the above findings by GSEA. The differential expression of these NF-κB target genes between MALT lymphoma with and without translocation was confirmed by quantitative RT-PCR and immunohistochemistry or Western blot. Expression of TLR6, in the presence of TLR2, enhanced both API2-MALT1 and BCL10 mediated NF-κB activation in vitro. In addition, there was cooperation between expression of BCL10, MALT1 or API2-MALT1, and stimulation of the antigen receptor or CD40 or TLR in NF-κB activation as shown by both reporter assay and IκBα degradation. Interestingly, expression of BCL10 but not API2-MALT1 and MALT1, in the presence of LPS stimulation, also triggered IκBβ degradation, suggesting activation of different NF-κB dimers between these oncogenic products. Study by co-immunoprecipitation showed that BCL10 directly interacts with MALT1. Sub-cellular localisation experiments in BJAB B-cells, showed that BCL10 localisation was affected by MALT1. When BCL10 was over-expressed, the protein was predominantly expressed in the nuclei, but when MALT1 was over-expressed, BCL10 was mainly localised in the cytoplasm. When both BCL10 and MALT1 were over-expressed, BCL10 was expressed in the cytoplasm in the early hours when the protein level was low, but in both the cytoplasm and nuclei after 9 hours when the protein level was high. Over-expression of API2-MALT1 did not shown any apparent effect on BCL10 sub-cellular localisation in vitro. Finally, comparison of MALT lymphoma expression microarray with other lymphomas showed lactoferrin to be highly expressed in MALT lymphoma. This was confirmed by qRT-PCR, showing lactoferrin to be significantly over-expressed in MALT lymphoma compared to FL and MCL. Thus lactoferrin may be a potential marker for MALT lymphoma.

L'ostéochondrose (OC) est une affection ostéo-articulaire juvénile caractérisée par une perturbation locale de la maturation du cartilage créant des zones de fragilité. L'OC a été décrite chez de nombreuses espèces dont l'Homme, le Chien, le Porc, le Poulet et le Cheval. Chez le cheval les lésions s'installent progressivement, sans symptômes, avant l'âge d'un an et les manifestations cliniques ne se manifestent que tardivement, souvent à l'entraînement. L'OC affecte 10 à 30 % de la population équine représentant ainsi un souci majeur pour la filière tant sur le plan du bien être animal que sur le plan économique. Son étiologie, multifactorielle, est encore mal comprise et implique des composantes génétiques et environnementales ainsi que traumatiques. Les objectifs des travaux présentés étaient d'améliorer la compréhension de la physiopathologie de l'OC équine et de mettre en évidence les processus biologiques perturbés. L'ensemble des résultats a permis de préciser la définition des différentes entités de l'OC et pourraient également être pertinentes dans l'amélioration du diagnostic et le dévelopement de nouveaux traitements. Un défaut constitutif de l'os et du cartilage a été mis en évidence chez les individus atteints d'OC, notamment associé à une perturbation du métabolisme énergénique et un stress du reticulum endoplasmique. De plus, selon le type de lésions, des mécanismes moléculaires sous-jacents différents sont impliqués dans leur développement. D'autre part, les microARNs (miRNAs) semblent également jouer un rôle dans la physiopathologie de l'OC et certains d'entre eux pourraient constituer de bonnes cibles thérapeutiques ou être utilisés comme biomarqueurs diagnostics. / Osteochondrosis (OC) is a juvenile osteo-articular disease characterized by a focal failure of cartilage maturation leading to weak areas. OC has been described in several species including Human, Dog, Swine, Poultry and Horse. In horse, lesions develop gradually without symptoms before one year old and clinical manifestations occur tardily during training. OC affects 10 to 30% of equine population and constitutes a major concern in terms of animal welfare and economy. Its multifactorial etiology remains poorly understood and involved several factors including genetics, environment and traumas. The aim of this current work was to improve the comprehension of equine OC physiopathology and highlight biological pathways disrupted. Taken together, our results made it possible to refine the definition of OC entities and our data could be relevant to improve diagnosis and develop new therapies. A constitutive defect was found in cartilage and bone of OC-affected horses and particularly a defective energy metabolism and a endoplasmic reticulum stress. Moreover, in function of lesion type, different underlying molecular mechanisms are involved in their development. Secondly, mircoRNAs (miRNAs) seem to take part in the OC physiopathology and some miRNAs could constitute a relevant therapeutic target or be used as diagnosis biomarkers.

Les bactéries utilisent la communication intercellulaire pour se coordonner afin de réguler des processus bactériens majeurs comme la virulence, la sporulation, la compétence ou la formation de biofilms en fonction de la densité cellulaire. Ce processus repose sur la sécrétion de petites molécules signal appelées phéromones. Chez les bactéries à gram positif, ces phéromones sont de petits peptides qui peuvent être, soit reconnus au niveau de la membrane externe par des systèmes à deux composants dits systèmes indirects, soit être re-internalisés afin de se fixer directement sur un régulateur transcriptionnel cytoplasmique. Dans la recherche de nouveaux agents antimicrobiens, le potentiel thérapeutique d’inhibiteurs ciblant les systèmes de communication intercellulaire est bien étudié chez les bactéries à gram négatif qui utilisent des homosérine lactones comme phéromones. Quelques études s’intéressent aux systèmes indirects de bactéries pathogènes à gram positif mais le potentiel des systèmes directs, plus récemment identifiés, n’a pas encore été explorés.Les récepteurs cytoplasmiques directement régulés par des peptides signal re-internalisés forment la famille des RNPP. Ces récepteurs sont caractérisés par un domaine de fixation du peptide composé d’une répétition de motifs en hélice  appelés TetratricoPeptide Repeats (TPR). La plupart de ces récepteurs sont des régulateurs transcriptionnels contenant un domaine N-terminal de fixation de l’ADN de type Hélice-Tour-Hélice (HTH). Les études précédentes ont montré que, malgré une structure conservée, les modes de régulation des différents membres de la famille RNPP suivent des mécanismes moléculaires distincts. L’un de ces systèmes directs le mieux caractérisé est le système ComRS qui régule la compétence chez les streptocoques. La compétence permet aux bactéries d’internaliser des fragments d’ADN exogènes pour l’acquisition de nouveaux phénotypes tels que la résistance aux antibiotiques ou la virulence. Dans le groupe salivarius, il a été montré que les récepteurs ComR de deux espèces très proches, S. thermophilus et S. vestibularis, ne sont pas capables de coordonner leur état de compétence par échange de leurs peptides ComS respectifs.L'objectif de ma thèse a été d'étudier les déterminants structuraux de la spécificité du système ComRS. J’ai produit, purifié et cristallisé le récepteur ComR de S. vestibularis afin d’en déterminer la structure cristalline, seul et en présence de son peptide signal ComS. La comparaison de ces structures avec celles précédemment résolues chez S. thermophilus, conjointement à une étude fonctionnelle par mutagénèse dirigée réalisée chez nos collaborateurs (P. Hols, UCLouvain, Belgique), a permis d’aller plus loin dans la compréhension du mécanisme de régulation de ComR mais aussi d’identifier les résidus responsables de la spécificité du système ComRS. En parallèle, j’ai également initié la caractérisation structurale de deux paralogues de ComR chez S. salivarius, ScuR et SarF, qui ne sont pas activés par ComS et ne reconnaissent pas les mêmes cibles ADN que ComR malgré des séquences très conservées. Une analyse par SEC-MALS et SAXS m’a permis de montrer que ScuR semble suivre un mécanisme similaire à celui de ComR alors que SarF se comporte différemment en solution. J’ai proposé un modèle par homologie pour ScuR et cristallisé SarF. La résolution de sa structure est en cours. Cette étude permet donc de mieux comprendre la régulation de la compétence chez les streptocoques et ouvre la voie à d’éventuelles applications biotechnologiques ou biomédicales. / Bacteria use intercellular communication to coordinate and regulate major bacterial processes such as virulence, sporulation, competence or biofilm formation, as a function of cell density. This process relies on the secretion of small signal molecules called pheromones. In gram-positive bacteria, these pheromones are small peptides that can be either recognized at the outer membrane by two-component systems called indirect systems, or can be re-internalized to directly interact with a cytoplasmic transcriptional regulator. In the search for new antimicrobial agents, the therapeutic potential of inhibitors targeting intercellular communication systems is well studied in gram-negative bacteria that use homoserine lactones as pheromones. Some studies focus on the indirect systems of gram-positive pathogenic bacteria, but the potential of the more recently identified direct systems has not yet been explored.The cytoplasmic receptors directly regulated by re-internalized signal peptides form the RNPP family. These receptors are characterized by a peptide binding domain consisting of repeats of  helical motifs called TetratricoPeptide Repeats (TPR). Most of these receptors are transcriptional regulators containing an N-terminal DNA binding domain of the helix-turn-helix (HTH) type. Previous studies have shown that, despite a conserved structure, the modes of regulation of the different members of the RNPP family follow distinct molecular mechanisms. One of the best characterized direct systems is the ComRS system that regulates competence in streptococci. Competence allows bacteria to internalize exogenous DNA fragments for the acquisition of new phenotypes such as antibiotic resistance or virulence. In the salivarius group, it has been shown that the ComR receptors of two closely related species, S. thermophilus and S. vestibularis, are not able to coordinate their state of competence by exchange of their respective ComS peptides.The aim of my thesis was to study the structural determinants of the specificity of the ComRS system. I produced, purified and crystallized the ComR receptor from S. vestibularis in order to determine its crystal structure, alone and in the presence of its ComS signal peptide. The comparison of these structures with those previously solved with ComR from S. thermophilus, together with a functional study by directed mutagenesis performed by our collaborators (P. Hols, UCLouvain, Belgium), allowed us to go further in the understanding of the regulatory mechanism of ComR but also to identify residues responsible for the specificity of the ComRS system. In parallel, I also initiated the structural characterization of two ComR paralogs from S. salivarius, ScuR and SarF, which are not activated by ComS and do not recognize the same DNA targets as ComR despite highly conserved sequences. SEC-MALS and SAXS analyses allowed me to show that ScuR seems to follow a mechanism similar to that of ComR whereas SarF behaves differently in solution. I proposed a homology model for ScuR and crystallized SarF. The resolution of its structure is in progress. This study therefore provides a better understanding of the regulation of competence in streptococci and opens the way to potential biotechnological or biomedical applications.

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