Les interactions non covalentes entre cytokines et glycosaminoglycanes interviennent dans de nombreux processus physiologiques, tels que la signalisation et la reconnaissance cellulaire, mais également dans des processus pathologiques tels que les infections virales ou bactériennes ainsi que dans certains processus cancéreux. Il apparait essentiel, d’un point de vue fondamental et pour des applications thérapeutiques, de comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu lors de ces interactions. A cette fin, le couplage entre l’électrophorèse capillaire (CE) et la spectrométrie de masse par ionisation electrospray (ESI-MS) s’est révélée être une méthode de choix pour l’étude des interactions non covalentes, avec la caractérisation des différents complexes formés en termes de stœchiométrie et de données thermodynamiques (constantes de dissociation Kd). Cette approche a également bénéficié de l’utilisation d’oligosaccharides de synthèse de type héparine, ce qui a permis pour la première fois de mettre en évidence les déterminants structuraux des oligosaccharides sulfatés impliqués dans l’interaction avec les protéines cibles. Cette étude a concerné les deux chimiokines SDF-1α et MCP-1, pour lesquelles les bases d’une relation structure-activité de liaison ont pu être établies. Enfin, nous avons également mis en œuvre des premiers essais d’une stratégie de « ligand fishing » avec l’interféron gamma humain (IFNγ) dans le but de déterminer les ligands oligosaccharidiques mis en jeu. / The non-covalent interactions between cytokines and glycosaminoglycans are involved in many physiological processes such as cell signaling and recognition, but also in pathological processes such as viral or bacterial infections and in certain cancer processes. From a fundamental point of view and for therapeutic applications, it is essential to understand the molecular mechanisms involved in these interactions. For this purpose, the hyphenation between capillary electrophoresis (CE) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) has emerged as a preferred method for the study of non-covalent interactions with the characterization of complexes in terms of stoichiometry and thermodynamic data (dissociation constants Kd). This approach has also benefited from the use of synthetic heparin-like oligosaccharides, which allowed for the first time to identify the sulfated oligosaccharides structural determinants involved in the interaction with target proteins. This study involved two chemokines SDF-1α and MCP-1, for which the structure-binding activity foundations have been established. Finally, we also implemented the first experiments of a "ligand fishing" strategy with the human gamma interferon (IFNγ) to determine the oligosaccharide ligands involved.

L'espèce Candida glabrata, qui se situe au deuxième rang parmi les agents des candidoses toutes formes cliniques confondues, possède des caractéristiques singulières et engendre notamment une plus grande mortalité chez les patients atteints de candidoses profondes ou systémiques. Cette espèce présente notamment la particularité d'être peu sensible aux azolés, les antifongiques les plus couramment utilisés en clinique. De plus, il semble que le développement d'une résistance aux antifongiques aussi bien azolés, que polyéniques ou pyrimidiques, soit plus fréquent chez C. glabrata. Nous nous sommes donc proposé d'étudier des isolats cliniques ou des mutants induits de cette espèce résistants à ces trois classes d'antifongiques et de déterminer les mécanismes moléculaires à l'origine de leur résistance. Les outils de biologie moléculaire classique ont mis en évidence dans chaque cas une dérégulation de l'expression de certains gènes impliqués dans le métabolisme de ces molécules antifongiques ou de leur cible, ainsi que des mutations sur ces mêmes gènes. Le génome haploïde de C. glabrata, et donc la plus forte probabilité d'exprimer un gène muté, ainsi que le contexte médical actuel, prônant la prophylaxie dans nombre de pathologies où l'immunité des patients est touchée, représentent un terrain favorable au développement d'une candidose et à la sélection simultanée d'isolats résistants.

Durant les dernières décennies, la vitamine D a été décrite comme un micronutriment d'intérêt, bénéfique pour la santé humaine, mais les mécanismes régissant son absorption intestinale ont été peu investigués. Il a longtemps été admis que son absorption était régie par un phénomène de diffusion passive. Nous avons tout d'abord montré qu'elle n'était pas uniquement passive mais impliquait des transporteurs membranaires du cholestérol tels que SR-BI, CD36 et NPC1-L1 et que des molécules pharmaceutiques utilisées pour inhiber l'absorption du cholestérol (Ezétimibe - Ezetrol®) pouvaient également diminuer celle de la vitamine D. Dans un second temps, nous avons montré que des composés présents au sein de notre alimentation comme les phytostérols pouvaient limiter l'absorption de la vitamine D. Au contraire, certains acides gras libres comme l'acide oléique pouvaient augmenter sa biodisponibilité. Ces données suggèrent que les autres composés lipidiques que nous consommons quotidiennement peuvent améliorer ou a contrario limiter l'absorption de la vitamine D. Pour finir, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires en temps réel entre divers vecteurs lipidiques et les boucles extracellulaires de SR-BI et CD36 grâce à la technique de la résonnance plasmonique de surface. Nous avons montré que la nature et la composition des vecteurs lipidiques modulaient les interactions micelles-protéines. Ces travaux de thèse dégagent des perspectives prometteuses quant à l'avancement des connaissances et des mécanismes moléculaires régissant l'absorption intestinale de la vitamine D, et souligne le fait que nos choix alimentaires pourraient optimiser notre statut en vitamine D. / Overs the last past decades, vitamin D has been described as a micronutrient of interest, beneficial to human health, but the mechanisms governing its intestinal absorption have been poorly investigated. Indeed, it has long been assumed that vitamin D was absorbed by a passive process. We first showed that vitamin D absorption was not only passive but involved membrane transporters including such as SR-BI, CD36 and NPC1-L1 and that pharmaceutical compounds used to inhibit cholesterol absorption (ei: Ezetimibe - Ezetrol ®) could also reduce vitamin D absorption. Then, we have shown that dietary molecules such as phytosterols could limit its absorption, while some free fatty acids such as oleic acid could increase its bioavailability. These data suggest that other dietary lipids daily consumed with vitamin D could improve or conversely limit its absorption. Finally, we investigated real-time interactions between various lipid ligands and scavenger receptors such as SR-BI and CD36 using the technique of surface plasmon resonance. This highlighted the fact that mixed-micelle lipid composition could modulate their interactions with these proteins.This thesis bring promising prospects in the advancement of knowledge and molecular mechanisms regulating vitamin D intestinal absorption, and enlightens the fact that our food choices could lead to an optimization of our vitamin D status.

L'ostéochondrose (OC) est une affection ostéo-articulaire juvénile caractérisée par une perturbation locale de la maturation du cartilage créant des zones de fragilité. L'OC a été décrite chez de nombreuses espèces dont l'Homme, le Chien, le Porc, le Poulet et le Cheval. Chez le cheval les lésions s'installent progressivement, sans symptômes, avant l'âge d'un an et les manifestations cliniques ne se manifestent que tardivement, souvent à l'entraînement. L'OC affecte 10 à 30 % de la population équine représentant ainsi un souci majeur pour la filière tant sur le plan du bien être animal que sur le plan économique. Son étiologie, multifactorielle, est encore mal comprise et implique des composantes génétiques et environnementales ainsi que traumatiques. Les objectifs des travaux présentés étaient d'améliorer la compréhension de la physiopathologie de l'OC équine et de mettre en évidence les processus biologiques perturbés. L'ensemble des résultats a permis de préciser la définition des différentes entités de l'OC et pourraient également être pertinentes dans l'amélioration du diagnostic et le dévelopement de nouveaux traitements. Un défaut constitutif de l'os et du cartilage a été mis en évidence chez les individus atteints d'OC, notamment associé à une perturbation du métabolisme énergénique et un stress du reticulum endoplasmique. De plus, selon le type de lésions, des mécanismes moléculaires sous-jacents différents sont impliqués dans leur développement. D'autre part, les microARNs (miRNAs) semblent également jouer un rôle dans la physiopathologie de l'OC et certains d'entre eux pourraient constituer de bonnes cibles thérapeutiques ou être utilisés comme biomarqueurs diagnostics. / Osteochondrosis (OC) is a juvenile osteo-articular disease characterized by a focal failure of cartilage maturation leading to weak areas. OC has been described in several species including Human, Dog, Swine, Poultry and Horse. In horse, lesions develop gradually without symptoms before one year old and clinical manifestations occur tardily during training. OC affects 10 to 30% of equine population and constitutes a major concern in terms of animal welfare and economy. Its multifactorial etiology remains poorly understood and involved several factors including genetics, environment and traumas. The aim of this current work was to improve the comprehension of equine OC physiopathology and highlight biological pathways disrupted. Taken together, our results made it possible to refine the definition of OC entities and our data could be relevant to improve diagnosis and develop new therapies. A constitutive defect was found in cartilage and bone of OC-affected horses and particularly a defective energy metabolism and a endoplasmic reticulum stress. Moreover, in function of lesion type, different underlying molecular mechanisms are involved in their development. Secondly, mircoRNAs (miRNAs) seem to take part in the OC physiopathology and some miRNAs could constitute a relevant therapeutic target or be used as diagnosis biomarkers.

A l’arrivée d’un potentiel d’action au niveau d’une synapse neuronale, des ions calcium (Ca2+) pénètrent dans le neurone, permettant aux protéines SNAREs (N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptor) de s’assembler entièrement, engendrant la fusion des vésicules synaptiques contenant les neurotransmetteurs avec la membrane plasmique du neurone. Des protéines régulatrices telles que la Complexine et la Synaptotagmine sont étroitement couplées aux SNAREs et permettent une fusion rapide et synchrone. La Synaptotagmin-1 (Syt1), une protéine transmembranaire localisée sur les vésicules synaptiques, est le senseur calcique de la neurotransmission. Syt1 possède deux domaines de liaison au Ca2+, C2A et C2B, un domaine flexible reliant la région membranaire au C2A, ainsi qu’un court lien entre C2A et C2B. Il a été montré qu’une région polybasique dans le C2B se liait aux lipides anioniques tels que phosphatidylserine (PS) et phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) en l’absence de Ca2+. A l’entrée du Ca2+, les ions Ca2+ se lient au C2A et au C2B. La liaison de Syt1 aux ions Ca2+ permet aux résidus non polaires à proximité des sites de liaison au Ca2+ de s’insérer dans la membrane. Si ces mécanismes sont relativement bien acceptés, les mécanismes biochimiques et biophysiques précis du déclenchement de la fusion induit par la liaison de Syt1 au Ca2+ restent flous. Dans ce travail, nous mesurons directement les interactions de Syt1 liée à une membrane avec des membranes anioniques comprenant des lipides PS et PIP2 par un appareil à force de surface (SFA), afin d’imiter la membrane d’une vésicule synaptique contenant Syt1 interagissant avec la membrane plasmique anionique. Nous réalisons une mutagénèse dirigée sur les sites de liaison au Ca2+ de C2A et C2B, ainsi que sur le site polybasique de C2B, pour entièrement cartographier les énergies de liaison à la membrane relatives à ces sites, à la fois en présence et en l’absence d’ions divalents. Nous trouvons que Syt1 se lie avec une énergie de ~6 kBT dans l’EGTA, ~10 kBT dans le Mg2+, et ~18 kBT dans le Ca2+. Des réarrangements moléculaires mesurés pendant le confinement de Syt1 entre les membranes prévalent dans le Ca2+ et dans le Mg2+, et suggèrent que Syt1 se lie initialement via le C2B puis réoriente ses domaines C2 dans la conformation de liaison privilégiée. La neutralisation des sites de liaison au Ca2+ de C2B engendre une réduction radicale de l’énergie de liaison de Syt1 dans le Ca2+, alors que la même mutation dans le C2A a un effet plus nuancé. Ces résultats éclairent sur la coopérativité de C2A et C2B dans leur liaison à la membrane, et montrent un rôle apparent prédominant de C2B. / Upon arrival of an action potential at the neuronal synapse, calcium ions (Ca2+) enter the neuron, allowing soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptor (SNARE) proteins to fully zipper, leading to the fusion of pre-docked synaptic vesicles containing neurotransmitters with the plasma membrane of the neurone. Regulatory proteins such as Complexin and Synaptotagmin are closely coupled to SNAREs during synaptic vesicle fusion and lead to synchronous, fast fusion. Synaptotagmin-1 (Syt1) is a transmembrane protein found in synaptic vesicles and is the Ca2+ sensor for synaptic transmission. Syt1 has two Ca2+ binding domains, C2A and C2B, with a flexible linker domain from the membrane region to C2A, and a short linker between C2A and C2B. A polybasic patch in C2B has been shown to bind to anionic lipids such as phophidylserine (PS) and phosphisotinol (PIP2) in the absence of Ca2+. Upon Ca2+ influx, Ca2+ ions bind in C2A and C2B. Ca2+ binding to Syt1 allows non-polar residues nearby the Ca2+ binding sites to insert into the membrane. While these mechanisms are relatively well-accepted, the precise biochemical and biophysical mechanisms for the Syt1 Ca2+ trigger remain unclear. In this work, we directly measure the interactions of Syt1-coated membranes with anionic membranes including PS and PIP2 lipids by the surface forces apparatus (SFA) technique, in order to mimic a Syt1-coated synaptic vesicle membrane interacting with the anionic plasma membrane. We perform site directed mutagenesis of the Ca2+ binding sites of C2A and C2B, along with the polybasic patch in C2B, to fully map the site-binding energetics of Syt1 with membranes, both in the absence and presence of divalent ions. We find that Syt1 binds with ~6 kBT in EGTA, ~10 kBT in Mg2+, and ~18 kBT in Ca2+. Molecular rearrangements measured during confinement of Syt1 between membranes are more prevalent in Ca2+ and Mg2+ and suggest that Syt1 initially binds through C2B, then reorients the C2 domains into the preferred binding configuration. Neutralization of C2B Ca2+ binding site leads to a drastic decrease of Syt1 binding energy in Ca2+, while the same mutation in C2A has a milder effect. These results illuminate that C2A and C2B cooperate in membrane binding, with an apparent predominant role of C2B.

Dans les aciéries, la conversion de la fonte en acier est une opération qui génère des quantités très importantes de déchets : les laitiers d'aciérie de conversion (LAC), qui sont en partie valorisés en tant que granulats en génie civil. Cette thèse vise à quantifier et à expliquer le comportement à la lixiviation des LAC, c'est-à-dire leur altération et le relargage des métaux traces (Cr, V) qu'ils contiennent, par l'identification des mécanismes physico-chimiques qui régissent, au sein même de la matrice solide, la mobilité et le transfert des éléments. L'approche expérimentale choisie est basée sur des tests de lixiviation (en laboratoire à l'aide du CTG-Leachcrete et en lysimètre à l'échelle semi-pilote) et des spectroscopies d'absorption et de fluorescence des rayons X permettant de caractériser à l'échelle du site cristallochimique le degré d'oxydation, la symétrie et la nature des phases porteuses des éléments.<br />Le Cr exclusivement trivalent, très stable dans les sites octaédriques d'une ferrite de calcium, est très peu relargué lors des tests de lixiviation en laboratoire et en lysimètre. Une phase de type spinelle, issue de l'altération de (Fe, Mn, Mg)O contrôle également la mobilité du Cr(III). Au contraire, le V(III) subit une oxydation en V(V) au sein même de sa phase porteuse, qui s'accompagne d'une perte de symétrie, à l'origine de sa mobilité à l'échelle du laboratoire.<br />Les données issues de ces expériences ont permis d'écrire les équations thermodynamiques d'équilibre à l'origine de l'initialisation d'un modèle géochimique robuste (CHESS) reproduisant l'altération des LAC : évolution minéralogique et courbes cinétiques de relargage obtenues lors des tests de lixiviation statique et dynamique en laboratoire. Ce modèle vise à terme à prédire le comportement à long terme des LAC dans un scénario de valorisation donné.

L'écotoxicité de différentes nanoparticules de carbone (NPC) a été évaluée chez des organismes aquatiques, en particulier chez Xenopus laevis. Il a été montré que la surface des NPC est le paramètre le plus pertinent pour décrire l'inhibition de croissance chez le xénope, indépendamment de leur forme allotropique et de leur état de dispersion. L'induction des micronoyaux a aussi été étudiée chez le xénope, et l'oxyde de graphène (GO) s'est révélé génotoxique à faible dose, résultat corroboré par l'étude de l'expression des gènes. Les mécanismes de toxicité impliqués seraient notamment liés aux fonctions oxygénées de la particule. De plus, le GO a aussi entrainé de la génotoxicité chez Pleurodeles waltl. et de la tératogénicité, des retards de développement et de l'inhibition de croissance chez Chironomus riparius. La mise en interaction de ces organismes au sein d'un mésocosme a également conduit à l'observation de génotoxicité chez le pleurodèle en présence de GO. / The ecotoxicity of different carbon-based nanoparticles (CNPs) was assessed in freshwater organisms, especially in Xenopus laevis. The surface of the CNPs was shown to be the more relevant parameter to describe the growth inhibition in Xenopus, regardless of their allotropic form and their state of dispersion. Micronucleus induction was also studied in Xenopus and graphene oxide (GO) was found genotoxic at low dose. This result was in compliance with the study of genes expression. The involved toxicity mechanisms would be related to the oxidized functions of the CNP. Moreover, GO was also found responsible for genotoxicity in Pleurodeles waltl. and for teratogenicity, development delay and growth inhibition in Chironomus riparius. These organisms have finally been put together in a mesocosm, which has also led to genotoxicity in Pleurodeles in the presence of GO.