Orientia tsutsugamushi, l'agent pathogène responsable du typhus des broussailles, est une bactérie cytosolique qui envahit l'endothélium et les monocytes/macrophages. La réponse immune à l'infection par O. tsutsugamushi reste à ce jour mal connue. L'objectif de cette thèse est de mieux comprendre la réponse des cellules de la réponse immune innée humaine à O. tsutsugamushi. Nous avons montré que O. tsutsugamushi se réplique dans les monocytes humains. En utilisant un microarray portant sur la totalité du génome, nous avons également montré que les bactéries vivantes induisent de profondes modifications du profil transcriptionnel des monocytes. C'est ainsi que l'expression des gènes codant l'interféron de type I et des gènes stimulés par l'interféron est fortement augmentée. Les monocytes infectés expriment plusieurs gènes codant des cytokines et des chimiokines inflammatoires, ce qui montre qu'ils sont polarisés vers un phénotype M1 (classically-activated phenotype). Les bactéries vivantes induisent également la sécrétion de l'interleukine-1β et probablement l'activation des inflammasomes et de la caspase-1. O. tsutsugamushi affecte enfin l'expression des gènes associés à l'apoptose et induit la mort d'une partie des monocytes infectés. Nous avons en outre étudié le profil transcriptionnel de patients atteints d'un typhus des broussailles et avons trouvé une signature spécifique incluant la modulation de gènes de type M1 et de gènes stimulés par l'interféron. Nous avons finalement étudié la réponse des macrophages humains dérivés des monocytes à O. tsutsugamushi. / Orientia tsutsugamushi, the causative pathogen of scrub typhus, is a cytosolic bacterium that invades endothelium and monocytes/macrophages. So far, the knowledge of immune response to O. tsutsugamushi is still limited. The objective of this thesis is to better understand the response of human innate immune cells against this pathogen. We demonstrated that O. tsutsugamushi was able to replicate in human monocytes. Using whole genome microarrays, we showed that live O. tsutsugamushi induced robust changes in the transcriptional profiles of monocytes. First, type I interferons and interferon-stimulated genes were remarkably up-regulated. Second, infected monocytes expressed several inflammatory cytokine and chemokine genes, and were polarized toward the classically-activated M1 phenotype. Third, live bacteria induced interleukin-1β secretion and likely inflammasome and caspase-1 activation. We also showed that O. tsutsugamushi altered the expression of apoptosis-related genes and induced cell death in monocytes. We extended our work to the study of the transcriptional profiles of patients with scrub typhus and found a specific signature in patients that included the modulation of M1-associated genes and interferon-stimulated genes. We finally studied the response of human monocyte-derived macrophages to O. tsutsugamushi. The transcriptional and functional responses of macrophages to O. tsutsugamushi were roughly similar to those observed in circulating monocytes including type I IFN response, pro-inflammatory cytokine gene expression and IL-1β secretion.

Les macrophages sont fonctionnellement polarisés en macrophages inflammatoires et microbicides (M1) ou immunorégulateurs (M2). Que les monocytes circulants soient polarisables n’est pas démontré. Nous avons étudié la signature transcriptionnelle par microarray et RT-PCR en temps réel de monocytes humains stimulés par l’IFN-γ, un inducteur des macrophages M1 et l’IL-4, un inducteur des macrophages M2. Leur profil de réponse précoce est dépendent de l’agoniste alors que la réponse tardive des monocytes est similaire qu’ils soient stimulés par l’IFN-γ ou l’IL-4. Cette approche dynamique de la réponse monocytaire permet probablement une étude bien plus pertinente des patients atteints d’une fièvre Q que le modèle de polarisation macrophagique. Par ailleurs, la prévalence de la fièvre Q est plus importante chez l’homme que chez la femme. Comme il a été montré que des gènes associés au cycle circadien sont modulés chez les souris infectées par Coxiella burnetii, la bactérie responsable de la fièvre Q, nous avons étudié ces gènes au cours de la fièvre Q. C’est ainsi que le gène Per2 est fortement exprimé chez les hommes atteints d’une fièvre Q aiguë. Ces résultats suggèrent donc que la modulation de gènes circadiens est associée à une maladie infectieuse chez l’homme. L’expression des gènes LNX1 and LNX2, qui codent deux enzymes impliquées dans le catabolisme des protéines, est accrue dans l’endocardite de la fièvre Q mais pas dans la fièvre Q aiguë. / Macrophages are functionally polarized into inflammatory and microbicidal (M1) and immunoregulatory (M2) cells. If circulating monocytes may be polarized is not known. We determined the transcriptional signatures of human monocytes stimulated with IFN-γ and IL-4, known to induce the polarization of macrophages into M1 and M2 cells, respectively, using microarrays and real-time RT-PCR. We found that monocytes exhibited an early pattern of activation specific to IFN-γ or IL-4 and a late pattern of activation common to both agonists. The selected biomarkers of early and late responses were tested in patients with Q fever. We showed that the kinetic model of monocyte activation enables a dynamic approach for the evaluation of patients with acute Q fever or Q fever endocarditis. On the other hand, it is known that the prevalence of Q fever is related to sex and is higher in men than in women. Based on previous studies on an experimental model of infection by Coxiella burnetii, the agent of Q fever, we hypothesized that circadian genes are differently modulated in men and women with Q fever. We showed that the expression of the Per2 gene was significantly increased in males with acute Q fever compared with healthy volunteers but did not differ in females with Q fever and healthy females. These results suggest that that the modulation of circadian genes is associated with a human infectious disease. We also found that the expression of LNX1 and LNX2 genes that encode two enzymes involved in protein degradation is increased in Q fever endocarditis but not in acute Q fever.

Les nanoparticules (NP) sont de plus en plus utilisées en médecine (imagerie, vectorisation de médicaments). Au sein de l’EA 3452, des NP polymériques chargées en donneurs d’oxyde nitrique •NO (S-nitrosoglutathion GSNO) sont développées afin d’améliorer la stabilité et la biodisponibilité de •NO. Le travail de thèse comprend 2 parties : premièrement : évaluer les effets des NP polymériques d’Eudragit® RL vides avec deux lignées cellulaires humaine (THP-1) et de rat (NR8383). La modification de l’expression de certains gènes impliqués dans des voies de souffrance cellulaire a été étudiée par RT-qPCR après 4h d’exposition aux NP. L’expression d’ATG16L, BCL2 et TNFA est augmentée dans NR8383, ce qui est en faveur d’une induction des processus autophagiques et inflammatoires. La diminution de l’expression de NCF1, NFKB et IL1B dans THP-1 peut expliquer l'augmentation de la viabilité et de la croissance cellulaires. Deuxièmement : évaluer les effets des mêmes NP chargées ou non en GSNO sur les THP-1 par une analyse des transcriptomes ce qui a montré une variation significative de l’expression des gènes associés aux clusters « prolifération », « structure cellulaire » pour les NP vides et « mitochondrie », « processus métabolique » pour les NP chargées en GSNO. Ces résultats sont cohérents avec ceux des tests cellulaires. L’analyse du transcriptome obtenu avec le GSNO libre a permis de proposer un mécanisme d’activation de l’immunité non spécifique contre Leishmania au sein du macrophage. Ainsi, l’étude génomique devient un outil indispensable pour mieux comprendre les interactions entre les NP et les cellules et a ainsi toute sa place en toxicologie / Although nanoparticles (NP) are more and more used in medicine (diagnosis, imaging, drug targeting), few studies on their possible undesirable effects have been conducted. The aim of this work was to evaluate the effects of polymeric NP Eudragit® RL loaded or not with S-nitrosoglutathione (GSNO), a nitric oxide donor, using two different cell lines: monocytes/macrophages of rat (NR8383) and human (THP-1). First, our results show that exposure to blank NP Eudragit® induced an up-regulation of ATG16L, BCL2 and TNFA and a down-regulation of PDCD4 in rat cells, what are in favor of a repression of apoptosis and an induction of autophagy. On the other hand, NCF1, NFKB, and IL1B were down-regulated in human cells, which may contribute to explain the increase of cellular viability. Second, we evaluated the effects of these NP loaded or not with GSNO on THP-1 cells. The results show that NP Eudragit® were internalized by cells using likely the clathrine and caveoline endocytic pathways. Transcriptome analyses by microarray of THP-1, exposed to either GSNO-loaded or empty NP, have shown a significant dose and time-dependent variation of the expression of genes belonging to the clusters “proliferation”, “cell structure” for the empty NP and “mitochondria” and “metabolic processes” for the loaded ones. These results are consistent with those of cellular assays. Transcriptome analyses of free GSNO allowed to propose a mechanism of non-specific immunity activation against Leishmania in the macrophage. Thus, (i) the cytotoxicity of NP is cellular model dependent and (ii) mechanistic toxicology should be the corner stone for the evaluation of NP harmfulness

TREM-1 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1) est un récepteur exprimé par les cellules de l’immunité innée qui amplifie l’inflammation initiée par les TLRs (Toll-like Receptors) et est impliquée dans plusieurs pathologies inflammatoires aigües et chroniques. À ce jour, peu de choses sont connues quant aux mécanismes moléculaires d’activation de TREM-1. Ainsi, nous avons développé des outils pour pouvoir stimuler TREM-1 de façon monovalente et multivalente. Ces travaux montrent que TREM-1 est activé par multimérisation et qu’il est régulé différemment sur les neutrophiles et monocytes. En effet, sur les monocytes activés au LPS, l’activation de TREM-1 s’effectue en deux étapes tandis qu’une seule est nécessaire dans les neutrophiles. Grâce à des approches de protéomiques, nous avons confirmé la dimérisation de l’ectodomaine de TREM-1 en solution. De plus, la multimérisation semble aussi être médiée par le ligand naturel de TREM-1, qui est, entre autres, libéré par les neutrophiles activés au LPS. Le travail présenté ici est une première étape vers la compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à l'interaction de TREM-1 et son ligand, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques / Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1 (TREM-1) is a receptor expressed on innate immune cells which amplifies inflammatory signals initially triggered by TLRs (Toll-like receptors) and TREM-1 has been characterized as a major player in the pathophysiology of acute and chronic inflammatory diseases. Currently, the molecular mechanisms leading to the activation of TREM-1 remain unknown. We have developed specific tools to stimulate TREM-1 in a monovalent and divalent way. Here we show that TREM-1 is activated by multimerization and is differentially regulated on neutrophils and monocytes. Indeed, TREM-1 activation on primary human monocytes by LPS required a two-step process while one is required on neutrophils. Using proteomic approaches, we have confirmed that TREM-1 ectodomain dimerizes in solution. Furthermore, the multimerization seems to be mediated by the natural ligand of TREM-1, which is released by LPS activated neutrophils. Collectively, our findings uncover molecular mechanisms leading to TREM-1 and its ligand interaction, painting the way of new therapeutics

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) reste à l’heure actuelle la seule thérapie curative de nombreuses hémopathies malignes. Les lymphocytes T (LT) du donneur constituent une immunothérapie contre les cellules de la leucémie (ou lymphome) appelé effet « GVL » pour « Graft versus Leukemia ». Malheureusement cet effet est intimement lié à la maladie du greffon contre l’hôte appelée « GVH » pour « Graft versus Host » (destruction des cellules saines du receveur par les LT du donneur). L’allogreffe de CSH est de plus en plus souvent réalisées avec des greffons mobilisés par du G-CSF. Quelques publications identifient des cellules immunosuppressives avec un phénotype peu précis CD11b+ Gr1+ induites par le G-CSF pouvant regrouper plusieurs sous-types cellulaires et sans trouver de contre-partie humaine ou avec un mécanisme d’action peu clair. Nous avons démontré que le G-CSF mobilise chez l’homme, dans la fraction CD34+ du greffon, une population monocytaire. Lorsqu’elle représente plus de 12% des CD34+, les receveurs ont une incidence moindre de la GVH aiguë. Cette même population est phénotypiquement et fonctionnellement conservée chez la souris. En réponse à l’IFN-γ relargué par les LT allogéniques, elle produit de l’Oxyde Nitrique capable d’induire l’apoptose de ces LT in vitro. In vivo, nous avons pu décortiquer (chez la souris uniquement) les mécanismes de régulation de la GVH aiguë. Les LT apoptotiques phagocytés par les macrophages capables alors de devenir tolérogènes en produisant du TGF-β et ainsi d’induire des LT régulateurs. Dans le modèle murin d’allogreffe de CSH, le transfert adoptif de cette population purifiée protège le receveur de la GVH aiguë. Nous pensons que si cette population peut être cultivée et expandue ex vivo, elle pourrait être une thérapie cellulaire préventive contre la GVH. / Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Allo-HSCT) is the most effective immunotherapy for acute leukemia, due to the development of graft-versus-leukemia (GVL) effect mediated by alloreactive donor T cells. However, donor T cells specific for recipient alloantigens are also responsible for graft-versus-host disease (GVHD), a life-threatening complication that frequently occurs after allo-HSCT. The administration of Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is routinely performed to collect Peripheral Blood Stem Cells (PBSC) from healthy donors for allo-HSCT. Few studies identified that G-CSF can induce myeloid suppressive cells in mice (CD11b+ Gr1+) with no human counterpart. We demonstrated in our study that G-CSF can induce a new population named CD34+Monocyte. The cumulative incidence of acute grade II to IV GVHD following allo-HSCT was lower in patients receiving grafts containing CD34+ monocyte frequencies above 12% of the CD34+ population. In mice, we demonstrated that G-CSF mobilized a highly conserved CD34+ monocyte population. CD34+Monocytes require T cell-mediated IFN-γ to produce Nitric Oxide that inhibits T cell activation and proliferation. In vivo, we report that CD34+ monocyte-derived NO regulates the alloreactive response by inducing T cell apoptosis and subsequently, the induction of regulatory T cells. In fact, uptake of apoptotic T cells by macrophages triggers them to produce high levels of TGF-β that drives the expansion of Tregs and induces immune tolerance. Such tolerogenic monocytes could represent a good candidate for the development of novel immunoregulatory and therapeutic cellular therapies.

Background: Breast and endometrial cancers are the most common gynaecological cancers in women in the UK. Early detection of tumours is crucial for improving patient survival rates. In breast cancer, mammography is the most reliable screening method for asymptomatic patients; however, its sensitivity is limited by breast density. Currently, there are no early screening assays for endometrial cancer. Thus, there is an urgent need to identify clinical biomarkers for improved non-invasive diagnosis of breast and endometrial cancer. Macrophages are abundant in the tumour microenvironment and their density has been associated with poor prognosis in breast cancer and decreased survival in endometrial cancer. Monocytes are precursors of macrophages and recent studies have shown an association with pro-tumoral functions. The aim of this study has been to examine the transcriptional profiles of human circulating monocytes and tumour associated macrophages (TAMs) in order to investigate their biological relevance and potential as biomarkers for cancer detection and prognosis. Methods: RNA-sequencing was performed on purified monocytes (22 healthy individuals, 21 breast cancer, 16 endometrial cancer samples), as well as purified normal macrophages, TAMs from breast tissue (4 breast cancer, 4 healthy breast) and endometrium tissue (5 endometrial cancer, 9 healthy endometrium). Results: A shift in the transcriptional profile of monocytes in cancer compared to controls was observed. Given these cancer-associated alterations circulating monocytes from cancer patients were called “Tumour Educated Monocytes” (TEMo). A TEMo-derived 13-gene signature was extracted that detected cancer, yielding an accuracy of 94%, a positive predictive value (PPV) of 92% and a negative predictive value (NPV) of 97%. External validation confirmed the ability of the signature to accurately identify cancer patients with perfect accuracy. Transcriptome profiling of TAMs revealed a significantly altered gene expression profile when compared to normal tissue resident macrophages. Furthermore, comparison of TAMs between breast and endometrial cancer also revealed differences suggesting that different tumour microenvironments induce different gene expression profiles in TAMs. Functional analysis of significant genes in breast cancer revealed similar biological pathways to those of murine studies suggesting that TAMs in humans and mice may have similar functions. A gene list of transmembrane receptors has been extracted by comparing breast cancer TAMs with publicly available datasets that could serve as markers for their identification. Finally, exploratory analysis identified a subset of 49 genes associated with recurrence-free and overall survival in publicly available datasets. Conclusion: To my knowledge this is the first genome-wide profiling study of human circulating monocytes and TAMs in breast and endometrial cancer. It provides evidence that monocytes and TAMs can alter their expression profile in the presence of cancer and, using bioinformatics tools I was able to identify biomarkers for diagnosis and prognosis of breast and endometrial cancer.

La LMMC est une hémopathie est caractérisée par une monocytose persistante (>1.10^9/L) ainsi que par la présence anormale de granulocytes immatures dans le sang des patients. Actuellement, il n’existe aucun traitement ciblé, il est donc essentiel de mieux caractériser et de comprendre les mécanismes qui causent cette monocytose afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de proposer des traitements ciblés. A partir de monocytes primaires humain stimulés par du CSF-1, nous avons observé que l’autophagie, est induite et qu’elle est dépendante des protéines Beclin1, ATG5, ATG7 et ULK1. Cette autophagie est également nécessaire à la différenciation macrophagique. Nous avons déterminé que l’AMP kinase (AMPK), est nécessaire à l’induction de l’autophagie et par conséquent à la différenciation macrophagique. Nous avons également découvert que le récepteur purinergique P2RY6 via la stimulation du CSF-1R active l’axe PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 conduisant à l’induction de l’autophagie nécessaire à la différenciation macrophagique. Enfin, dans le cadre de la LMMC, où la différenciation macrophagique est altérée, nous avons confirmé que la présence de granulocytes immatures est responsable de l’inhibition de l’axe P2RY6-AMPK. Dans ce contexte, nous avons observé que l’ajout d’agonistes du P2RY6 est capable d’une part de réinduire l’expression de l’AMPK et d’autre part de restaurer la différenciation macrophagique. L’ensemble de ces résultats souligne l’importance de l’induction du processus autophagique au cours de la différenciation macrophagique des monocytes mais également désigne l’axe P2RY6-AMPK comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la LMMC. / CMML is a hematologic malignancy characterized by a persistent monocytosis (> 1.10^9/ L) and an abnormal presence of immature granulocytes in the blood of patients. Currently, there is no targeted therapy for this disease, so there is a real need to better understand the mechanisms leading to monocytosis in order to establish new therapeutic strategies and propose targeted treatments for CMML patients. From primary human monocytes, stimulated by CSF-1 to induce their differentiation into macrophages, we found that autophagy is induced during this process and is required for proper macrophagic differentiation. Then we were able to show that AMPK kinase (AMPK) is required for the induction of autophagy and therefore macrophage differentiation. We also found that the P2RY6 purinergic receptor via the CSF-1R stimulation, activate the PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 axis leading to the induction of autophagy, which is necessary for the macrophagic differentiation. Finally, in CMML context, where the macrophagic differentiation is impaired, we confirmed that the presence of immature granulocytes is responsible for the inhibition of AMPK P2RY6-axis. In this context, we observed that the addition of agonists P2RY6 is first capable of re-inducing the expression of AMPK and then restoring the macrophagic differentiation. All of these results emphasize the importance of autophagy induction during macrophage differentiation of monocytes and highlight the P2RY6 AMPK-axis as a potential therapeutic target in the treatment of CMML.

Akademisk avhandling--Lund. / Extra t.p., with thesis statement, inserted. Errata slip inserted. Bibliography: p. [117]-125.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 6 uppsatser.

Thesis (doctoral)--Katholieke Universiteit te Nijmegen.