Résumé : Les ostéosarcomes sont des tumeurs malignes osseuses primaires qui affectent principalement les enfants et les adolescents. Les thérapies utilisées depuis les 30 dernières années n'ont malheureusement eu que très peu d'effet sur la survie des patients. Ce projet de doctorat évalue deux stratégies pour contrer certaines dérégulations des cellules d'ostéosarcome humain. La première consiste à abolir leur résistance à l'apoptose avec un alcaloïde d'origine végétale. La seconde consiste à accroître leur différenciation ou à réduire leur prolifération en utilisant des protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) et leurs peptides dérivés (pBMPs). La première partie de ce doctorat s'intéresse donc au comportement et à la régulation des cellules d'ostéosarcome en comparaison avec celui des cellules osseuses normales afin d'identifier des cibles potentielles. Elle met l'accent sur trois caractéristiques de l'ostéosarcome: la résistance à l'apoptose, la prolifération incontrôlée des cellules et leur différenciation défectueuse. La sanguinarine, un alcaloïde d'origine végétale, est déjà utilisée pour traiter plusieurs types de cancers (sein et colon). Cet alcaloïde a été choisi pour vaincre la résistance à l'apoptose des cellules d'ostéosarcome. La sanguinarine a éradiqué les deux lignées cellulaires humaines d'ostéosarcome, MG-63 et SaOS-2, d'une manière dépendante du temps et de la dose. Les deux lignées cellulaires se distinguent par des états de différenciation et des taux de prolifération différents. L'alcaloïde induit l'apoptose par les voies extrinsèque et intrinsèque en activant les caspases-8 et -9. La sanguinarine semble agir sur les cellules d'ostéosarcome en fonction de leur potentiel tumorigène. La BMP-2, la BMP-9 et leurs peptides dérivés, pBMP-2 et pBMP-9, ont été utilisés pour contrer la différenciation défectueuse ou la prolifération incontrôlée des cellules d'ostéosarcome. La BMP-2, la BMP-9 et le pBMP-9 activent la phosphorylation des Smads dans les deux lignées cellulaires MG-63 et SaOS-2. Le pBMP-2 n'a eu aucun effet sur ces cellules d'ostéosarcome. Alors que le pBMP-9 agit sur la voie canonique des BMPs, il n'a cependant eu aucun effet significatif sur l'expression des gènes des marqueurs ostéogéniques à 6h. La BMP-2 induit essentiellement la phosphorylation de ERK 112, tandis que la BMP-9 et le pBMP-9 activent la voie p38. De plus, un inhibiteur de MEK1 bloque complètement l'augmentation de la phosphorylation de ERK1/2 induite par la BMP-2 et renforce la phosphorylation de la p38 en présence de BMP-9 ou du pBMP-9. Le traitement avec la BMP-2 ou la BMP-9 et l'inhibiteur MEKI augmente l'expression de gènes codant pour des marqueurs ostéogéniques précoces dans les cellules SaOS-2, tout en inhibant la croissance des cellules MG-63. Ainsi, la sanguinarine ou les BMPs en combinaison avec un inhibiteur MEKI pourraient donner lieu à un traitement anti-cancéreux prometteur. D'autres expériences sont néanmoins nécessaires pour déterminer leurs effets sur les cellules souches cancéreuses. // Abstract : Osteosarcomas are malignant primary bone tumours that normally occur in children and adolescents. Currently used therapies have not measurably improved patient survival rates over the last 30 years. This doctoral research evaluates two strategies for overcoming the major features of osteosarcoma cells. One is to abolish their resistance to apoptosis with a plant-derived alkaloid. The other is to block their defective differentiation or uncontrolled proliferation with bone morphogenetic proteins (BMPs) and peptides derived from them (pBMPs). The first part of this thesis compares the behaviour and regulation of osteosarcoma cells and normal bone cells to identify potential targets. It focuses on three features of osteosarcoma: resistance to apoptosis, uncontrolled cell proliferation, and defective cell differentiation. The plant-derived alkaloid, sanguinarine, is already used to treat several cancers (breast and colon). It was selected to overcome the resistance of osteosarcoma cells to apoptosis. Sanguinarine killed both MG-63 and SaOS-2 human osteosarcoma cells in a time- and dose-dependent manner. These two cell lines have different differentiation states and proliferate at different rates. The alkaloid induces apoptosis through the extrinsic and intrinsic pathways, activating both caspases-8 and -9. Sanguinarine seems to act on osteosarcoma cells depending on their tumourigenic potential. BMP-2, BMP-9, and their derived peptides, pBMP-2 and pBMP-9, were used to overcome the defective differentiation or uncontrolled proliferation of osteosarcoma cells. BMP-2, BMP-9, and pBMP-9 activated the phosphorylation of Smad in both MG-63 and SaOS-2 cells. pBMP-2 had no effect on osteosarcoma cells. While pBMP-9 acted on the canonical BMP pathway, it had no significant effect on the expression of genes encoding osteogenic markers at 6h. BMP-2 mainly increased the phosphorylation of ERK1 /2, while BMP-9 and pBMP-9 activated the p38 pathway. A MEKI inhibitor completely blocked the BMP-2-triggered increase in ERK1/2 phosphorylation and enhanced the phosphorylation of p38 induced by BMP-9 or pBMP-9. Treatment with BMP-2 or BMP-9 and MEKI inhibitor increased the the expression of genes encoding osteogenic markers in SaOS-2 cells, while inhibiting the growth of MG-63 cells. Thus, sanguinarine or BMPs plus a MEK I inhibitor could give rise to a promising anti-cancer treatment. Further experiments are now required to determine their effect on cancer stem cells.

Les os constituent une part importante du corps humain. Ils sont sollicités tout au long de la vie : ceci expose les différents os à une multitude de traumatismes. La correction des traumatismes osseux est un problème de tous les jours pour les chirurgiens orthopédiques et maxillo-faciaux. Malgré toutes les connaissances actuelles en chirurgie osseuse, il existe encore plusieurs limitations en rapport avec la guérison post-chirurgicale des greffes autogènes. La régénération osseuse à partir des facteurs de croissance pourrait venir en aide à la médecine moderne. L'objectif du présent travail est d'étudier l'effet des protéines de la morphogenèse de l'os (Bone Morphogenetic Proteins : BMPs) sur la régénération osseuse par de multiples expériences in vitro. Un modèle in vitro d'ingénierie osseuse a servi à comparer l'activité ostéogénique des BMPs, soit des homodimères de BMP-2 et de BMP-7 et de l'hétérodimère de BMP-2/BMP-7, pour étudier la croissance et la différenciation des ostéoblastes sur l'expression de l'ostéocalcine (OC), de l'interleukine-6 (IL-6), de la métalloprotéinase-2 (MMP-2) et de leurs inhibiteurs tissulaires TIMP-1 et TIMP-2. Notre approche expérimentale démontre que les homodimères de BMP-2 et BMP-7 ainsi que l'hétérodimère de BMP-2/BMP-7 favorisent la croissance des ostéoblastes et la production d'OC via l'lL-6. Aussi, comme les homodimères et l'hétérodimère, les deux protéines BMP-2 et BMP-7 stimulent la production de la matrice extracellulaire par l'inhibition de la production des MMPs via les TIMPs.

Malgré sa réputation d'être statique, le tissu osseux est un organe dynamique maintenu en équilibre sous les actions respectives des cellules résorbant l'os, les ostéoclastes, et les cellules formant l'os, les ostéoblastes. Les pathologies osseuses comme l'ostéoporose, découlent d'un débalancement entre la résorption et la formation osseuse. Ces maladies mènent à des diminutions nettes de la masse osseuse, à une augmentation de la fragilité du tissu et par conséquent à une perturbation de la qualité de vie chez les personnes atteintes. Les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) ont été identifiées comme d'intéressants candidats pour stimuler la régénération du tissu osseux. Les BMP-2 et -7 ont été approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) pour des applications orthopédiques spécifiques. Récemment, il a été démontré que la BMP-9 possédait un potentiel ostéogénique supérieur aux BMP-2 et -7 qui sont couramment utilisées en clinique. Toutefois, son effet sur l'ostéoclaste n'a jamais été caractérisé. À partir d'un modèle d'ostéoclastes obtenus à partir de sang de cordon ombilical, l'effet de la BMP-9 sur la différenciation ostéoclastique, la résorption osseuse et l'apoptose chez l'ostéoclaste a été étudié. La transduction du signal par la BMP-9 a été étudiée chez l'ostéoclaste. Les cultures d'ostéoclastes ayant atteint une différenciation terminale expriment les ARNm codant pour ALK-1, BMPR-IA, -IB et -II. La BMP-9 active la voie canonique des Smad chez l'ostéoclaste. Par une analyse de l'expression de marqueurs ostéoclastiques, il est observé que la BMP-9 ne module pas la formation des ostéoclastes. Pour l'étude sur la résorption osseuse, les précurseurs ostéoclastiques ont été cultivées sur des lamelles osseuses bovines. Il est observé que la BMP-9 ne module pas la résorption osseuse régulée par les ostéoclastes. L'apoptose des ostéoclastes a été étudiée par marquage TUNEL. Il est observé qu'en absence et présence des facteurs de survie, RANKL (Receptor activator of the nuclear factor KB ligand) et M-CSF (Macrophage colony stimulating factor), la BMP-9 à 50 et 150 ng.ml-1 protège les ostéoclastes de la mort cellulaire. Les mécanismes moléculaires de l'inhibition d'apoptose induite par la BMP-9 ont également été étudiés. La BMP-9 induit chez l'ostéoclaste une inhibition du clivage de la caspase-9 et non de la caspase-8, suggérant que celle-ci découle d'une diminution de l'activation de la voie intrinsèque de l'apoptose. Une étude de la modulation des homologues de la famille Bcl-2 a montré que la BMP-9 à 150 ng.ml-1 induit une diminution de l'expression de Bid, un homologue pro-apoptotique. Cette étude démontre pour la première fois les effets de la BMP-9 chez l'ostéoclaste humain. [Symboles non conformes]

L'ingénierie tissulaire osseuse est une branche de la médecine régénératrice. Le «concept diamant» avec ses quatre éléments fondamentaux permet d'approcher les problèmes actuels de la création d'un tissu osseux au laboratoire. Les facteurs de croissance s'avèrent la clé de voûte qui permet la stimulation des cellules souches. Le développement d'un tissu osseux passe par une succession d'évènements cellulaires dictés par des facteurs de croissance et implique la prolifération, la différenciation et la minéralisation. Les travaux présentés dans cette thèse, de part 1 'utilisation de techniques in vitro, me permettent de dire que: 1) J'ai démontré que le facteur EGF stimule la prolifération des ostéoblastes et que son effet est amplifié par les facteurs BMP-2 et BMP-7. Aussi, la formation de nodules à 28 jours est fortement réduite en présence de l'EGF. Ainsi, l'EGF est un facteur d'intérêt dans les stades précoces mais moins dans les évènements tardifs, comme au moment de la formation de nodules minéralisés. 2) J'ai identifié les voies de signalisation ERKl/2, JNKl/2 et SMADs qui régissent la prolifération dans des cultures d'ostéoblastes dérivés de cellules humaines souches pulpaires (hDPSCs) différenciées, par une co-stimulation avec le FGF-2 et la BMP-2. L'analyse génique et protéinique de l'ostéocalcine (OST), de la phosphatase alcaline (ALP) et du marqueur Runx-2 ont permis de mieux comprendre la différenciation cellulaire des hDPSCs dans un milieu de culture à différenciation ostéoblastique composé d'acide ascorbique, de dexaméthasone et de β-glycérophosphate. 3) J'ai fait la démonstration que le FGF-2 est un facteur ostéogénique précoce qui favorise la croissance des ostéoblastes plutôt qu'un facteur tardif impliquant la différenciation et la minéralisation. De fait, la formation de nodules à 28 jours était fortement réduite en présence du FGF -2. En marge des expériences au laboratoire, j'ai proposé un bioréacteur hypothétique que j'ai nommé « IV2B2TEC », il est breveté de manière provisoire, et il intègre les 4 éléments conceptuels en ingénierie tissulaire osseuse.

Contexte : En culture, les cellules endothéliales cornéennes humaines (CECH) adoptent fréquemment une morphologie fibroblastique [transition endothélio-mésenchymateuse (TEM)], les rendant inutilisables en génie tissulaire en raison de l’incapacité fonctionnelle associée. Objectifs : En accord avec les précédents travaux provenant de notre laboratoire et la littérature scientifique, nous avons séparément étudié les effets de la culture sous pression hydrostatique physiologique (18 mmHg) et de l’antagonisme de la TEM sur la fonctionnalité des CECH. Méthodes : D’une part, l’ensemencement des CECH sur stromas décellularisés et la culture en chambre antérieure artificielle ont permis de soumettre les CECH à une pression hydrostatique. D’autre part, les agents présumés antagonistes de la TEM suivants ont été étudiés : le SB431542, la dexaméthasone et BMP-7. Résultats : La pression hydrostatique physiologique et l’antagonisme de la TEM par le SB431542 et la dexaméthasone sont des moyens efficaces pour maintenir et améliorer la fonctionnalité des CECH in vitro. / Background: Cultured human corneal endothelial cells (HCEC) often adopt a fibroblastic-like morphology [endothelial-mesenchymal transition (EMT)], making them unusable in tissue engineering due to the associated loss of function. Purpose: In agreement with previous work from our laboratory and scientific literature, we separately investigated the effects of culture under physiological hydrostatic pressure (18 mmHg) and the antagonism of EMT on HCEC functionality. Methods: First, seeding HCEC on decellularized corneal stromas and culture in an artificial anterior chamber allowed to submit HCEC to hydrostatic pressure. Second, the following putative EMT antagonists agents were studied: SB431542, dexamethasone and BMP-7. Results: Physiological hydrostatic pressure and EMT antagonism by SB431542 and dexamethasone are effective ways to maintain and improve HCEC functionality in vitro.

Le but de cette étude était d’évaluer si la bone morphogenetic protein (BMP)-2 pouvait aider à contrôler le phénotype de chondrocytes humains dans des conditions de culture à long terme nécessaires pour la transplantation de chondrocytes autologues (TCA). Nous avons aussi évalué le potentiel de la BMP-2 comme facteur de réparation du cartilage, en combinaison avec un biomatériau à base de collagène, pour étendre la technique aux lésions arthrosiques. Des chondrocytes humains ont été cultivés selon la procédure utilisée pour la TCA. Nous avons évalué la réponse des chondrocytes à la BMP-2 en culture monocouche ou dans les éponges de collagène par des analyses par PCR en temps réel, par Western blotting et Immunohistochimie.L’ajout de BMP-2 améliore le caractère chondrogénique des chondrocytes humains amplifiés en monocouche. L’effet stimulateur de la BMP-2 sur l’expression du collagène de type II a été observé au niveau des gènes mais aussi des protéines, ce qui est une propriété essentielle pour la reconstruction d’une matrice cartilagineuse. Nos résultats ont aussi montré que dans des chondrocytes tout d’abord amplifiés en monocouche puis cultivés en éponges de collagène en présence de BMP-2, la BMP-2 est capable de restaurer l’expression du gène COL2A1 et la synthèse de collagène de type II qui avaient été perdues pendant l’amplification. De manière importante, aucun signe de maturation hypertrophique ou d’induction ostéogénique n’a été détecté. Cette étude est la première à révéler le bénéfice de l’ajout de BMP-2 à des chondrocytes humains comme un agent thérapeutique pour la réparation du cartilage. / The aim of this study was to investigate if bone borphogenetic brotein (BMP)-2 could help to control human chondrocytes phenotype in long-term culture conditions necessary for autologous chondrocyte implantation (ACI). We also evaluated the potential of BMP-2 as a repair factor in combination with collagen-based biomaterials, to extend the technique to osteoarthritic lesions. Human chondrocytes were cultured independently, according to the procedure used for ACI. We evaluated the responsiveness of chondrocytes to BMP-2 when cultured in monolayer or within collagen sponges using Real-time PCR, Western blotting and Immunohistochemistry. Exogenous BMP-2 improved the chondrogenic character of human chondrocytes when amplified in monolayer. The stimulatory effect of BMP-2 on type II collagen expression was observed not only at the mRNA level but also at the protein level, and this is crucial for cartilage matrix reconstruction. Our data with human chondrocytes first amplified in monolayer then cultured in collagen sponges in the presence of BMP-2 have revealed that BMP-2 is able to restore COL2A1 gene expression and type II collagen synthesis that were lost during the amplification step. Importantly, no sign of hypertrophic maturation or osteogenic induction was detected beside the chondrogenic stimulatory effect of BMP-2. This study is the first to reveal the benefit of adding exogenous BMP-2 to human chondrocytes as a therapeutic agent for cartilage repair.

Les spondyloarthrites (SpA) sont des maladies inflammatoires chroniques articulaires qui se caractérisent par des atteintes de la colonne vertébrale et des articulations périphériques, en particulier des enthèses, souvent associées à des manifestations extra-articulaires telles que le psoriasis, l’uvéite, ou l’inflammation intestinale. Ces maladies complexes possèdent une forte composante génétique dominée par l'antigène HLA-B27 du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH-I), présent chez plus de 80% des patients atteints de SpA. Découverte il y a 45 ans, l'association entre HLA-B27 et le développement des SpA reste inexpliquée. Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer cette association au niveau moléculaire. Cependant, la plupart se heurtent à des incohérences expérimentales qui semblent les invalider. Pour élucider les mécanismes moléculaires pathogènes liés au HLA-B27, nous avons utilisé une nouvelle approche. Drosophila melanogaster est un puissant modèle génétique qui a permis des avancées considérables dans la compréhension de nombreuses fonctions des cellules de métazoaires, ainsi que dans la description des processus cellulaires et moléculaires de nombreuses pathologies humaines. Nous avons établi plusieurs lignées de drosophiles transgéniques pour des formes d’HLA-B associées aux SpA ou pour une forme non associée à la maladie, ainsi que pour la chaîne invariante du CMH-I, la β2m humaine (hβ2m). L'expression des formes associées à la maladie, exclusivement en présence de la hβ2m, dans l'aile et dans l'œil de la drosophile conduit à l'apparition de deux phénotypes spécifiques. Mes résultats ont permis de mettre en évidence que le phénotype de perte des veines transversales de l’aile était associé à une perturbation de la signalisation par la voie des Bone Morphogenetic Protein (BMP). Cette perturbation est associée à une co-localisation de HLA-B27 avec le récepteur BMP de type I, Sax. Nos résultats préliminaires obtenus dans les cellules de patients atteints de SpA suggèrent l’existence d’une co-localisation analogue d’HLA-B27 avec le récepteur ALK2, orthologue de Sax. L'ensemble de nos résultats plaide en faveur d’un rôle pathogène de HLA-B27 passant par une dérégulation de la voie BMP à l’intersection des voies de l’ossification et de l’inflammation et pourrait donc s’appliquer à la physiopathologie des SpA. / Spondyloarthritis (SpA) is a chronic inflammatory rheumatic disorder characterized by joint manifestations affecting the spine, peripheral joints and entheses, as well as extra-articular manifestations such as psoriasis, uveitis, or intestinal inflammation. This complex disorder has a strong genetic component dominated by the HLA-B27 antigen of the major histocompatibility complex class I (MHC-I), which is present in more than 80% of SpA patients. Discovered 45 years ago, the association between HLA-B27 and SpA development remains unexplained. Several hypotheses have been proposed to explain this association at the molecular level, but all face experimental inconsistencies that seem to invalidate them. Therefore, it appeared to us essential to elaborate new and yet unexplored approaches in order to better understand the molecular role of HLA-B27 in SpA development. Drosophila melanogaster is a powerful genetic model that has led to considerable advances in understanding numerous functions of metazoan cells, as well as in describing the cellular and molecular processes of many human pathologies. To elucidate the molecular pathogenic mechanisms associated with HLA-B27, we have established several transgenic Drosophila lines for SpA-associated and non-associated of HLA-B alleles, as well as for the MHC-I invariant chain, the human 2-microglobulin (hβ2m). Expression of the HLA-B27 alleles, in the presence of hβ2m, in the Drosophila wing and eye led to two specific phenotypes. The crossveinless wing phenotype is due to a disturbance in the Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling pathway. Interestingly, this misregulation is associated with a co-localization of HLA-B27 and the BMP type I receptor named Sax. Our preliminary results obtained in SpA patient cells suggest that HLA-B27 also colocalizes with ALK2 receptor, which is ortholog to Sax. Altogether, our results suggest that the pathogenic role of HLA-B27 in SpA may depend on a BMP signaling misregulation at the crosstalk between ossification and inflammation.

Dans le désert Libyque (Égypte), l'un des plus arides du monde, l'action du vent trouvant peu de limites, l'ablation et le transport éoliens sont des éléments prégnants de la morphogenèse. Au cœur de ce désert, les oasis de la dépression de Kharga, nées de l'artésianisme et des activités humaines, constituent au contraire, par la profusion de l'eau et de la végétation, des secteurs où les processus de dépôt sont renforcés. L'imbrication entre une région désertique (zone-source de sédiments) et des sites oasiens (zones de dépôt), où s'appliquent des processus opposés, maximise les dynamiques éoliennes et leur impact morphogénétique. Il en découle la formation des paysages du vent, que cette thèse vise à décrire, comprendre et expliquer. Mobilisant des méthodes de géomorphologie, de géoarchéologie, de géohistoire et de sédimentologie, ce travail rend compte de l'impact paysager des interactions entre activités humaines et dynamiques éoliennes depuis la création des oasis il y a 2 500 ans. Il présente un bilan des processus naturels et anthropiques, et aborde la question des conditions de vie des oasiens depuis l'Antiquité.Trois apports principaux résultent de cette recherche :- une typologie des formations constitutives des paysages du vent- une modélisation descriptive du système à leur origine, reposant sur des cycles asynchrones de colonisation et de déprises- un bilan des grandes tendances de l'évolution environnementale et morphogénétique sur le temps long, depuis l'implantation des oasis : les paysages du vent sont nés de la distorsion entre la dégradation environnementale régionale et l'amélioration locale et temporaire des conditions édaphiques résultant des activités humaines. / The limiting features of the wind dynamics are scarce in the Western desert of Egypt, one of the most arid areas in the world: eolian ablation and transport are the prevailing factors of the morphogenesis. Born from artesian waters and human activities, the oases of Kharga basin form an area where the deposition processes are stronger thanks to the large amount of water and vegetation. Eolian dynamics, and their morphogenetic impacts, are strengthened by the nesting of oasis sites (deposition areas) in a desert region (sediment source-zone). The landscapes of the wind are thus formed by the juxtaposition of these areas where opposed processes occur. This thesis aims to describe, understand and explain their development.This work based on geomorphology, geoarchaeology, « géohistoire » and sedimentology gives an account on the impacts on the landscapes of the interactions between eolian dynamics and human activities since the creation of the oases 2 500 years ago. It consists in an overview of the natural and anthropogenic processes and an assessment of the living conditions in the oasis since the Antiquity.The three main results of this research are:- a typology of the elements forming the landscapes of the wind;- a descriptive modelisation of the system at stake in their formations, which is based on an asynchronous cycle of colonisation and abandonment of the sites;- an overview of the main patterns of the long-term environmental and morphogenetic evolution since the creation of the oases.This triple contribution shows that the landscapes of the wind are born from the distortion between the regional environmental trend towards degraded conditions and the local and temporary improvements of the edaphic conditions due to human activities.