Neste trabalho apresentamos um modelo teórico que busca descrever aspectos do movimento bidirecional apresentado por objetos intracelulares (vesículas, organelas, vírus etc, aos quais iremos nos referir simplesmente como (\"vesículas\"), observado, sobretudo em experimentos in vivo. Este movimento nao-difusivo e caracterizado por inversões rápidas em sua direção e é capaz de gerar gradientes de concentração do objeto transportado. Os fenômenos de transporte intracelular são sabidamente mediados por proteínas motoras (como as kinesinas e dinenas) cujo movimento unidirecional sobre _lamentos protéicos e bem caracterizado (kinesinas se movem em direção a extremidade mais enquanto as dinenas se movem em direção a extremidade-menos dos microtúbulos) e é normalmente entendido através de modelos estocásticos que descrevem o comportamento de uma partícula browniana na presença de um potencial assimétrico que varia no tempo (ver Astumian [26], Adjari e Prost [22], Magnasco [23]). Mais recentemente, surgiram na literatura trabalhos que tentam descrever o movimento de partículas motoras interagentes, uma vez que se percebeu que efeitos coletivos que surgem nestas situações podem ser relevantes para os fenômenos de transporte sobre microtúbulos. Uma abordagem para a descrição do comportamento destes sistemas de partículas motoras interagentes é aquela baseada nos modelos para os sistemas difusivos dirigidos\". Em particular, a versão contínua dos modelos do tipo totally asymmetric exclusion processes\" (TASEP) e asymmetric exclusion processes\" (ASEP) tem sido utilizada para o estudo do comportamento da densidade de motores sobre os microtúbulos, através da analise de soluções estacionarias da equação de Burgers correspondente (Parmeggiani et al. [33]). Até agora, entretanto, não existem na literatura tentativas de abordar, com estes modelos, o transporte bidirecional de vesículas mediado por estes motores interagentes. A idéia que apresentamos aqui é associar este estranho tipo de movimento ao movimento de ondas de choque presentes nas soluções transientes da equa_c~ao de Burgers para algumas condições iniciais. Deste modo, as vesículas acompanhando (\"surfando\") os choques fariam o papel de suas correspondentes microscópicas partículas de segunda classe\", introduzidas h_a um bom tempo na literatura [36], [37], [38] para o estudo da dinâmica microscópica dos choques que estão presentes também na versão discreta dos modelos TASEP e ASEP. Neste sentido, é natural que as condições iniciais consideradas, que seriam perturbações no estado estacionário das partículas, possam ser causadas, no sistema real, pela própria interação com a vesícula. É o caso, portanto, de se propor que a geometria deste objeto tenha um papel importante na determinação da direcional de seu próprio movimento no meio intracelular. Esta parece ser, por exemplo, uma alternativa interessante para explicar aspectos do movimento de vírus no interior das células. / In this work we present a theoretical model to describe aspects of the bidirectional movement performed by intracellular structures (vesicles, organelles, viruses etc, to which we refer here simply as \"vesicles\"), observed essentially at in vivo experiments. This nondifusive movement is characterized by rapid inversions in direction and is capable of creating concentration gradients of the transported cargo. The phenomenon of intracellular transport is known to be mediated by motor proteins (such as kinesins and dyneins) whose own unidirectional motion along protein laments is well characterized (kinesins moves to the plus-end direction while dyneins moves to the minus-end direction of the microtubules) and is usually modeled by a stochastic dynamics describing the behavior of a Brownian particle in the presence of a time dependent asymmetrical potential held (see Astumian [26], Adjari and Prost [22], Magnasco [23]). More recently, it appeared in the literature works attempting to describe the movement of interacting motor proteins, since it was realized that collective e_ects emerging from this situation may be relevant to the transport phenomena along microtubules. An approach to describe the behavior of such interacting motor particles is based on existing models for \\driven di_usive systems\". In particular, the continuum versions of the totally asymmetric exclusion processes\" (TASEP) or the asymmetric exclusion processes\" (ASEP) have been used to study the behavior of motors density along microtubules by analyzing the steady state solutions to the corresponding Burgers equation (Parmeggiani et al. [33]). Up to now, however, there are no attempts in the literature to approach in this context the questions related to the bidirecionality of vesicles transported by these interacting motors. The idea we present here is to associate this odd movement to the movement of shock waves presented by the transient solutions of Burgers equation for certain initial conditions. Accordingly, the vesicles accompanying (sur_ng) the shocks fronts would play the role of their microscopic analogous \\particles of second class\" introduced long ago in the literature [36], [37], [38] to study the kinetics of the shocks that are also present in the discrete versions of the TASEP and ASEP. In this regard, it is natural to think that the considered initial conditions, namely perturbations to the motor density with respect to a steady state, can be created in the real systems simply by the interaction with the vesicle. It might then be the case also to propose that the geometry of the vesicle plays an important role to direct its own movement within intracellular environment. This seems to be, for example, an attractive alternative for explaining aspects of virus movement inside the cell.

Neste trabalho apresentamos um modelo teórico que busca descrever aspectos do movimento bidirecional apresentado por objetos intracelulares (vesículas, organelas, vírus etc, aos quais iremos nos referir simplesmente como (\"vesículas\"), observado, sobretudo em experimentos in vivo. Este movimento nao-difusivo e caracterizado por inversões rápidas em sua direção e é capaz de gerar gradientes de concentração do objeto transportado. Os fenômenos de transporte intracelular são sabidamente mediados por proteínas motoras (como as kinesinas e dinenas) cujo movimento unidirecional sobre _lamentos protéicos e bem caracterizado (kinesinas se movem em direção a extremidade mais enquanto as dinenas se movem em direção a extremidade-menos dos microtúbulos) e é normalmente entendido através de modelos estocásticos que descrevem o comportamento de uma partícula browniana na presença de um potencial assimétrico que varia no tempo (ver Astumian [26], Adjari e Prost [22], Magnasco [23]). Mais recentemente, surgiram na literatura trabalhos que tentam descrever o movimento de partículas motoras interagentes, uma vez que se percebeu que efeitos coletivos que surgem nestas situações podem ser relevantes para os fenômenos de transporte sobre microtúbulos. Uma abordagem para a descrição do comportamento destes sistemas de partículas motoras interagentes é aquela baseada nos modelos para os sistemas difusivos dirigidos\". Em particular, a versão contínua dos modelos do tipo totally asymmetric exclusion processes\" (TASEP) e asymmetric exclusion processes\" (ASEP) tem sido utilizada para o estudo do comportamento da densidade de motores sobre os microtúbulos, através da analise de soluções estacionarias da equação de Burgers correspondente (Parmeggiani et al. [33]). Até agora, entretanto, não existem na literatura tentativas de abordar, com estes modelos, o transporte bidirecional de vesículas mediado por estes motores interagentes. A idéia que apresentamos aqui é associar este estranho tipo de movimento ao movimento de ondas de choque presentes nas soluções transientes da equa_c~ao de Burgers para algumas condições iniciais. Deste modo, as vesículas acompanhando (\"surfando\") os choques fariam o papel de suas correspondentes microscópicas partículas de segunda classe\", introduzidas h_a um bom tempo na literatura [36], [37], [38] para o estudo da dinâmica microscópica dos choques que estão presentes também na versão discreta dos modelos TASEP e ASEP. Neste sentido, é natural que as condições iniciais consideradas, que seriam perturbações no estado estacionário das partículas, possam ser causadas, no sistema real, pela própria interação com a vesícula. É o caso, portanto, de se propor que a geometria deste objeto tenha um papel importante na determinação da direcional de seu próprio movimento no meio intracelular. Esta parece ser, por exemplo, uma alternativa interessante para explicar aspectos do movimento de vírus no interior das células. / In this work we present a theoretical model to describe aspects of the bidirectional movement performed by intracellular structures (vesicles, organelles, viruses etc, to which we refer here simply as \"vesicles\"), observed essentially at in vivo experiments. This nondifusive movement is characterized by rapid inversions in direction and is capable of creating concentration gradients of the transported cargo. The phenomenon of intracellular transport is known to be mediated by motor proteins (such as kinesins and dyneins) whose own unidirectional motion along protein laments is well characterized (kinesins moves to the plus-end direction while dyneins moves to the minus-end direction of the microtubules) and is usually modeled by a stochastic dynamics describing the behavior of a Brownian particle in the presence of a time dependent asymmetrical potential held (see Astumian [26], Adjari and Prost [22], Magnasco [23]). More recently, it appeared in the literature works attempting to describe the movement of interacting motor proteins, since it was realized that collective e_ects emerging from this situation may be relevant to the transport phenomena along microtubules. An approach to describe the behavior of such interacting motor particles is based on existing models for \\driven di_usive systems\". In particular, the continuum versions of the totally asymmetric exclusion processes\" (TASEP) or the asymmetric exclusion processes\" (ASEP) have been used to study the behavior of motors density along microtubules by analyzing the steady state solutions to the corresponding Burgers equation (Parmeggiani et al. [33]). Up to now, however, there are no attempts in the literature to approach in this context the questions related to the bidirecionality of vesicles transported by these interacting motors. The idea we present here is to associate this odd movement to the movement of shock waves presented by the transient solutions of Burgers equation for certain initial conditions. Accordingly, the vesicles accompanying (sur_ng) the shocks fronts would play the role of their microscopic analogous \\particles of second class\" introduced long ago in the literature [36], [37], [38] to study the kinetics of the shocks that are also present in the discrete versions of the TASEP and ASEP. In this regard, it is natural to think that the considered initial conditions, namely perturbations to the motor density with respect to a steady state, can be created in the real systems simply by the interaction with the vesicle. It might then be the case also to propose that the geometry of the vesicle plays an important role to direct its own movement within intracellular environment. This seems to be, for example, an attractive alternative for explaining aspects of virus movement inside the cell.

Orientador: Mário Tyago Murakami / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinto_AlineSampaio_M.pdf: 3074349 bytes, checksum: 0fdb140ae2fd1c1975ba6cde0cf00bca (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As miosinas formam uma superfamília de proteínas de alto peso molecular com atividade mecanoquímica capaz de hidrolisar a molécula de ATP e de interagir com os filamentos de actina. A estrutura das miosinas pode ser divida de modo geral em cabeça motora, pescoço e cauda. São conhecidas 35 classes de miosinas em eucariotos sendo a classe II de miosinas denominada miosinas convencionais e as demais chamadas de não convencionais. Em plantas são somente encontradas as miosinas não convencionais de classe VIII e XI. A classe VIII caracteriza-se por sua alta processividade sobre os filamentos de actina e a classe XI é a maior classe em número de genes, tendo uma estrutura muito semelhante às miosinas de classe V. Uma terceira classe, a classe XIII, foi posteriormente descoberta e somente foi encontrada no gênero Acetabularia apresentando dois genes, porém essa classificação é controversa havendo aqueles que dizem que as miosinas da classe XIII possuem tanta afinidade filogenética com as da classe XI que elas deveriam compor uma única classe. As miosinas VIII e XI desempenham papéis chave no transporte direcional de componentes intracelulares em plantas, principalmente devido às grandes dimensões das células de plantas que não sobrevivem utilizando somente a difusão como mecanismo de transporte intracelular. Neste trabalho, buscamos selecionar os melhores representantes de cada classe a partir de análises in silico para desenvolvermos os testes de expressão, purificação e análises biofísicas. Os domínios selecionados, cauda globular (GT), dilute e SH3, foram clonados em pET28a e pET28aSUMO, os testes de expressão com diversas cepas de E coli, mostraram que o domínio dilute expressa em grande quantidade na fração solúvel, porém forma agregados impedindo as análises biofísicas e os ensaios de cristalização. O domínio SH3 também foi obtido na forma solúvel, porém em pouca quantidade e apresentou migração anômala no gel, sendo identificado a partir de análises de espectrometria de massas. Foram realizados testes iniciais de cristalização para o domínio SH3, mas não resultou na formação de cristais adequados a difração de raios X. A cauda globular foi obtida apenas na fração insolúvel e submetida a procedimentos de refolding para sua solubilização. Mesmo conseguindo o reenovelamento da construção, a mesma se manteve agregada inviabilizando os testes de cristalização. Por outro lado foram analisadas as interações da cauda globular da miosina XIh com presas identificadas por duplo-híbrido realizado pelo nosso grupo com a miosina humana Va. Três das proteínas que interagiram com a miosina Va humana também mostraram sinais de interação com a miosina XIh de Arabidopsis, indicando que mesmo havendo diferenças nas sequências polipeptídicas entre as classes de miosina, a estrutura terciária se mantém permitindo que ambas apresentem interações com algumas proteínas em comum / Abstract: Myosins belong to a superfamily of high molecular weight proteins, presenting mechanochemical activity by hydrolyzing ATP molecule and ability to interact with actin filaments. The myosin structure can be divided into motor head, neck and tail. 35 myosin classes are known in eukaryotic cells, where class II is known as conventional myosins and all others, as unconventional myosins. Plants possess only unconventional myosins including classes VIII and XI. The class VIII, is characterized by its high processivity on actin filaments while class XI possesses multiple genes and its protein structure is very similar to class V myosins. A third class, XIII, was later discovered and only found in Acetabularia genome presenting two genes. However this classification is controversial, because some studies shown that class XIII myosins share such high phylogenetic similarity with class XI that they should form the same class. Myosins VIII and XI play key roles on directional intracellular components transport in plants, mainly due to the large plant cell size which would not survive only by the diffusion mechanism for intracellular transport. In this work, we have selected the best representative targets of each class from in silico analyses to develop the protein expression, purification and biophysical characterization. The selected domains (globular tail (GT), dilute and SH3) were cloned into pET28a and pET28aSUMO expression vectors. Results of expression tests with several E coli strains, showed that dilute domain is expressed in large amounts in the soluble fraction; however, it aggregates preventing biophysical analysis and crystallization trials. The SH3 domain, expressed in low soluble concentration, presented an abnormal migration in SDS-PAGE and its identity was confirmed by mass spectrometry analysis. Initial crystallization tests were conducted with SH3 domain, but owing to the low protein concentration only clear drops have appeared, and no crystals or aggregates were observed. The globular tail domain, obtained only in insoluble fraction, was subjected to refolding procedures/ techniques in order to recover its native-like state; however, even the refolded protein displayed secondary structure, the protein remained aggregated. Furthermore, we analyzed the interactions between of myosin XIh globular tail with pre-identified proteins by yeast two-hybrid conducted by our group with human myosin Va. Three proteins that interacted with human myosin Va also showed interaction with Arabidopsis myosin XIh, indicating that despite of differences in polypeptide sequences between the classes XI and V, the tertiary structure may be maintained allowing both of them to have interactions with common proteins / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Para estudar os mecanismos celulares que levam à mudança de cor cromomotora em crustáceos investigamos os cromatóforos ovarianos vermelhos do camarão de água doce Macrobrachium olfersi. A natureza do receptor do hormônio agregador de pigmento vermelho (RPCH) localizado na membrana plasmática é desconhecida. Muitos eventos das cascatas de sinalização induzidas por Ca2+ e GMPc, assim como os tipos de motores moleculares por elas ativados, são ainda obscuros. Avaliamos, farmacologicamente, pela perfusão in vitro dos cromatossomos com pigmentos inicialmente dispersos, possíveis funções do receptor acoplado à proteína G (GPCR), de receptores de glutamato não-NMDA (rGlu), da óxido nítrico sintase (NOS), da proteína cinase G (PKG), da cinase (MLCK) e da fosfatase (MLCP) da cadeia leve da miosina, da protéina cinase Rho (ROCK) e da miosina II não-muscular no mecanismo que induz a translocação pigmentar. Também investigamos a presença de microfilamentos de actina, microtúbulos, miosinas, cinesina e dineína, por microscopia de fluorescência. A inibição do GPCR com GDP--S (10 µM) não tem efeito significativo, mas com AntPG (5 µM) a agregação induzida por RPCH é inibida em 50%, e tem velocidade máxima de 13,3 ± 2,1 m/min (= RPCH-controle, 16,7 ± 1,6 m/min, P=0,85), seguida de dispersão espontânea. A inibição de rGlu com CNQX (50 µM) causa sutil hiperdispersão e inibe 25% da agregação induzida por RPCH, com velocidade máxima de 16 ± 1,5 µm/min (= RPCH-controle, P=0,95). A estimulação de rGlu com AMPA (30 µM) causa forte hiperdispersão (115%) e não afeta a agregação em relação ao RPCH-controle (velocidade máxima de 16,3 ± 1,8 µm/min, P=0,86). Com a inibição da NOS por L-NAME (5 mM), a agregação induzida por RPCH dura 14 min e chega aos 43,5 ± 10% de dispersão, com velocidade máxima de 11,1 ± 1,3 µm/min (= RPCH-controle, P=0,38). Com a PKG inibida por rp-sGMPc-trietilamina (3 µM), a agregação induzida por RPCH chega aos 36,2 ± 5,6% de dispersão em 12 min, com velocidade máxima de 16,9 ± 1,8 µm/min (= RPCH-controle, P=0,626), seguida de dispersão espontânea. A inibição da MLCP com cantaridina (10 µM) acelera a fase rápida da agregação induzida pelo RPCH (25,1 ± 2,6 µm/min, P= 0,017) e inibe sutilmente sua fase final (9,2 ± 5,1% após 30 min). A inibição da MLCK com ML-7 (10 µM) não afeta significativamente a agregação induzida pelo RPCH, que atinge 8,7 ± 3,14% de dispersão com velocidade máxima de 14,1 ± 1,6 µm/min (= RPCH-controle, P= 0,277). As inibições da ROCK com Y-27632 a 3 µM e H-1152 a 50 nM afetam a agregação pigmentar induzida por RPCH em 15,4 ± 4,8% e 32,8 ± 14,3%, e as velocidades máximas são similares ao RPCH-controle, de 18 ± 3,5 m/min (P=0,86) e 13,9 ± 2,3 m/min (P=0,9), respectivamente. Com H-1152 ocorre dispersão espontânea; e com ambos os compostos a dispersão durante a lavagem do RPCH é acelerada. A inibição da miosina II não-muscular com blebistatina reduz a resposta ao RPCH, havendo agregação até os 47 ± 6,2% em 16 min, com velocidade máxima de 9,1 ± 1,5 µm/min, (= RPCH-controle, P= 0,007), seguida de dispersão espontânea; a dispersão com a lavagem do RPCH ocorre normalmente. Por microscopia de fluorescência foram identificados microtúbulos, presentes nas extensões celulares com o pigmento agregado; microfilamentos de actina, aparentemente formandos trilhos aos grânulos pigmentares; miosina II não-muscular, em associação ao citoesqueleto; miosina esquelética e muscular, cinesina e dineína, em associação aos grânulos pigmentares. Evidenciamos que o receptor do RPCH pode ser do tipo GPCR. Os receptores pGlu não parecem ter papel na transdução de sinal deste neuropeptídeo. A NOS, a PKG, a MLCP e a ROCK têm papéis importante na agregação pigmentar, mas a MLCK aparentemente não. Sugerimos que o RPCH se acopla a um receptor associado à proteína G0 na membrana plasmática, e concomitantemente à elevação da concentração intracelular de Ca2+, desencadeia a ativação da NOS, que produz NO, estimulando da GC-S a liberar GMPc. Este segundo mensageiro ativa a PKG, que fosforila um sítio de ativação da miosina. O movimento da miosina é impulsionado por ciclos de fosforilação/defosforilação em um sítio regulatório de suas cadeias leves, catalizados pela MLCP e pela ROCK. Um dos tipos de miosina ativada pela PKG pode ser a miosina II não-muscular, que parece efetuar principalmente a fase lenta da agregação pigmentar. Outras miosinas e a dineína possivelmente também participam da agregação, enquanto que a cinesina parece ter papel na dispersão pigmentar. / To study the cellular mechanisms that lead to cromomotor color changes in crustaceans, we investigated the red ovarian chromatophores of the freshwater shrimp Macrobrachium olfersi. The nature of the receptor for red pigment concentrating hormone (RPCH) in the plasma membrane is unknown. Many events of the induced Ca2+ and GMPc signaling cascades, as well types of molecular motors activated are still obscure. We evaluated, using pharmacological perfusions in vitro of chromatossomes with initially dispersed pigments, putative functions of a G protein coupled receptor (GPCR), non-NMDA glutamate receptors (rGlu), nitric oxide sintase (NOS), protein kinase G (PKG), myosin light chain kinase (MLCK) and phosphatase (MLCP), Rho protein kinase (ROCK) and non-muscular myosin II in the mechanism that induces pigment translocation. We also investigated by fluorescence microscopy the presence of myosins, kinesin, dinein, actin microfilaments and microtubules. GPCR inhibition with 10 µM GDP--S has no significant effect, but 5 µM PGAnt inhibits 50% of RPCH-triggered aggregation, that has maximum velocity of 13,3 ± 2,1 m/min (= RPCH-control, 16,7 ± 1,6 m/min, P=0,85), followed by spontaneous dispersion. rGlu inhibition with 50 µM CNQX causes subtle hyperdispersion and inhibits 25% RPCH induced aggregation, with a maximum velocity of 16 ± 1,5 µm/min (= RPCH-control, P=0,95). rGlu stimulation with 30 µM AMPA causes strong pigment hyperdispersion (115%) but does not affect aggregation compared to RPCH-control (16,3 ± 1,8 µm/min maximum velocity, P=0,86). NOS inhibition with 5 mM L-NAME affects RPCH-triggered aggregation, that lasts 14 min and reaches 43,5 ± 10% dispersion, with maximum velocity of 11,1 ± 1,3 µm/min (= RPCH-control, P=0,38). PKG inhibition with 3 µM rp-cGMPs-thrietylamine affects RPCH-triggered aggregation, that lasts 2 min and reaches 36,2 ± 5,6% dispersion with maximum velocity of 16,9 ± 1,8 µm/min (= RPCH-control, P=0,626), followed by spontaneous dispersion. MLCP inhibition with 10 µM cantharidin accelerates the RPCH-triggered aggregation fast phase (25,1 ± 2,6 µm/min, P= 0,017) and subtly inhibits final aggregation (9,2 ± 5,1% after 30 min). MLCK inhibition with 10 µM ML-7 does not significantly affect RPCH-induced aggregation, that reaches 8,7 ± 3,14% dispersion with a maximum velocity of 4,1 ± 1,6 µm/min (= RPCH-control, P= 0,277). ROCK inhibition with 3µM Y-27632 or 50 nM H-1152 decreases RPCH-triggered pigment aggregation by 15,4 ± 4,8% and 32,8 ± 14,3%; maximum velocities are similar to RPCH-control, 18 ± 3,5 m/min (P=0,86) and 13,9 ± 2,3 m/min (P=0,9), respectively. H-1152 induces spontaneous dispersion; dispersion during RPCH washout is accelerated by both Y-27632 and H-1152. Non-muscular myosin II inhibited with blebbistatin reduces the response to RPCH, aggregation reaching 47 ± 6,2% in 16 min, with a maximum velocity of 9,1 ± 1,5 µm/min (= RPCH-control, P= 0,007), followed by spontaneous dispersion; RPCH washout leads to normal dispersion. Microtubules are present in the cellular extensions in chromatophores with aggregated pigments; actin microfilaments, apparently form trails to associate with pigment granules; non-muscular myosin II is associated with the cytoskeleton; skeletal and muscular myosin, kinesin and dinein, associated with the granules, were revealed by fluorescence microscopy. We showed that the RPCH receptor may be a GPCR. A pGlu receptor does not seem to be present and play a role in signal transduction. NOS, PKG, MLCP and ROCK play important roles in pigment aggregation, although MLCK apparently does not. We suggest that RPCH binds to a G0 protein coupled receptor in the plasma membrane, and together with cytosolic [Ca2+] increase, triggers NOS activation, producing NO, that stimulates GC-S to release cGMP. This second messenger activates PKG, that phosphorylates an activation site on myosin, whose movements are driven by a phosphorylation/dephosphorylation cycle at a regulatory site on the myosin light chain, catalyzed by MLCP and ROCK. One of the PKG activated myosins may be non-muscular myosin II, which seems to effect mainly the slow phase of pigment aggregation. Other myosins and dinein possibly also participate in pigment aggregation, while kynesin seems to play a role in pigment dispersion.

Para estudar os mecanismos celulares que levam à mudança de cor cromomotora em crustáceos investigamos os cromatóforos ovarianos vermelhos do camarão de água doce Macrobrachium olfersi. A natureza do receptor do hormônio agregador de pigmento vermelho (RPCH) localizado na membrana plasmática é desconhecida. Muitos eventos das cascatas de sinalização induzidas por Ca2+ e GMPc, assim como os tipos de motores moleculares por elas ativados, são ainda obscuros. Avaliamos, farmacologicamente, pela perfusão in vitro dos cromatossomos com pigmentos inicialmente dispersos, possíveis funções do receptor acoplado à proteína G (GPCR), de receptores de glutamato não-NMDA (rGlu), da óxido nítrico sintase (NOS), da proteína cinase G (PKG), da cinase (MLCK) e da fosfatase (MLCP) da cadeia leve da miosina, da protéina cinase Rho (ROCK) e da miosina II não-muscular no mecanismo que induz a translocação pigmentar. Também investigamos a presença de microfilamentos de actina, microtúbulos, miosinas, cinesina e dineína, por microscopia de fluorescência. A inibição do GPCR com GDP--S (10 µM) não tem efeito significativo, mas com AntPG (5 µM) a agregação induzida por RPCH é inibida em 50%, e tem velocidade máxima de 13,3 ± 2,1 m/min (= RPCH-controle, 16,7 ± 1,6 m/min, P=0,85), seguida de dispersão espontânea. A inibição de rGlu com CNQX (50 µM) causa sutil hiperdispersão e inibe 25% da agregação induzida por RPCH, com velocidade máxima de 16 ± 1,5 µm/min (= RPCH-controle, P=0,95). A estimulação de rGlu com AMPA (30 µM) causa forte hiperdispersão (115%) e não afeta a agregação em relação ao RPCH-controle (velocidade máxima de 16,3 ± 1,8 µm/min, P=0,86). Com a inibição da NOS por L-NAME (5 mM), a agregação induzida por RPCH dura 14 min e chega aos 43,5 ± 10% de dispersão, com velocidade máxima de 11,1 ± 1,3 µm/min (= RPCH-controle, P=0,38). Com a PKG inibida por rp-sGMPc-trietilamina (3 µM), a agregação induzida por RPCH chega aos 36,2 ± 5,6% de dispersão em 12 min, com velocidade máxima de 16,9 ± 1,8 µm/min (= RPCH-controle, P=0,626), seguida de dispersão espontânea. A inibição da MLCP com cantaridina (10 µM) acelera a fase rápida da agregação induzida pelo RPCH (25,1 ± 2,6 µm/min, P= 0,017) e inibe sutilmente sua fase final (9,2 ± 5,1% após 30 min). A inibição da MLCK com ML-7 (10 µM) não afeta significativamente a agregação induzida pelo RPCH, que atinge 8,7 ± 3,14% de dispersão com velocidade máxima de 14,1 ± 1,6 µm/min (= RPCH-controle, P= 0,277). As inibições da ROCK com Y-27632 a 3 µM e H-1152 a 50 nM afetam a agregação pigmentar induzida por RPCH em 15,4 ± 4,8% e 32,8 ± 14,3%, e as velocidades máximas são similares ao RPCH-controle, de 18 ± 3,5 m/min (P=0,86) e 13,9 ± 2,3 m/min (P=0,9), respectivamente. Com H-1152 ocorre dispersão espontânea; e com ambos os compostos a dispersão durante a lavagem do RPCH é acelerada. A inibição da miosina II não-muscular com blebistatina reduz a resposta ao RPCH, havendo agregação até os 47 ± 6,2% em 16 min, com velocidade máxima de 9,1 ± 1,5 µm/min, (= RPCH-controle, P= 0,007), seguida de dispersão espontânea; a dispersão com a lavagem do RPCH ocorre normalmente. Por microscopia de fluorescência foram identificados microtúbulos, presentes nas extensões celulares com o pigmento agregado; microfilamentos de actina, aparentemente formandos trilhos aos grânulos pigmentares; miosina II não-muscular, em associação ao citoesqueleto; miosina esquelética e muscular, cinesina e dineína, em associação aos grânulos pigmentares. Evidenciamos que o receptor do RPCH pode ser do tipo GPCR. Os receptores pGlu não parecem ter papel na transdução de sinal deste neuropeptídeo. A NOS, a PKG, a MLCP e a ROCK têm papéis importante na agregação pigmentar, mas a MLCK aparentemente não. Sugerimos que o RPCH se acopla a um receptor associado à proteína G0 na membrana plasmática, e concomitantemente à elevação da concentração intracelular de Ca2+, desencadeia a ativação da NOS, que produz NO, estimulando da GC-S a liberar GMPc. Este segundo mensageiro ativa a PKG, que fosforila um sítio de ativação da miosina. O movimento da miosina é impulsionado por ciclos de fosforilação/defosforilação em um sítio regulatório de suas cadeias leves, catalizados pela MLCP e pela ROCK. Um dos tipos de miosina ativada pela PKG pode ser a miosina II não-muscular, que parece efetuar principalmente a fase lenta da agregação pigmentar. Outras miosinas e a dineína possivelmente também participam da agregação, enquanto que a cinesina parece ter papel na dispersão pigmentar. / To study the cellular mechanisms that lead to cromomotor color changes in crustaceans, we investigated the red ovarian chromatophores of the freshwater shrimp Macrobrachium olfersi. The nature of the receptor for red pigment concentrating hormone (RPCH) in the plasma membrane is unknown. Many events of the induced Ca2+ and GMPc signaling cascades, as well types of molecular motors activated are still obscure. We evaluated, using pharmacological perfusions in vitro of chromatossomes with initially dispersed pigments, putative functions of a G protein coupled receptor (GPCR), non-NMDA glutamate receptors (rGlu), nitric oxide sintase (NOS), protein kinase G (PKG), myosin light chain kinase (MLCK) and phosphatase (MLCP), Rho protein kinase (ROCK) and non-muscular myosin II in the mechanism that induces pigment translocation. We also investigated by fluorescence microscopy the presence of myosins, kinesin, dinein, actin microfilaments and microtubules. GPCR inhibition with 10 µM GDP--S has no significant effect, but 5 µM PGAnt inhibits 50% of RPCH-triggered aggregation, that has maximum velocity of 13,3 ± 2,1 m/min (= RPCH-control, 16,7 ± 1,6 m/min, P=0,85), followed by spontaneous dispersion. rGlu inhibition with 50 µM CNQX causes subtle hyperdispersion and inhibits 25% RPCH induced aggregation, with a maximum velocity of 16 ± 1,5 µm/min (= RPCH-control, P=0,95). rGlu stimulation with 30 µM AMPA causes strong pigment hyperdispersion (115%) but does not affect aggregation compared to RPCH-control (16,3 ± 1,8 µm/min maximum velocity, P=0,86). NOS inhibition with 5 mM L-NAME affects RPCH-triggered aggregation, that lasts 14 min and reaches 43,5 ± 10% dispersion, with maximum velocity of 11,1 ± 1,3 µm/min (= RPCH-control, P=0,38). PKG inhibition with 3 µM rp-cGMPs-thrietylamine affects RPCH-triggered aggregation, that lasts 2 min and reaches 36,2 ± 5,6% dispersion with maximum velocity of 16,9 ± 1,8 µm/min (= RPCH-control, P=0,626), followed by spontaneous dispersion. MLCP inhibition with 10 µM cantharidin accelerates the RPCH-triggered aggregation fast phase (25,1 ± 2,6 µm/min, P= 0,017) and subtly inhibits final aggregation (9,2 ± 5,1% after 30 min). MLCK inhibition with 10 µM ML-7 does not significantly affect RPCH-induced aggregation, that reaches 8,7 ± 3,14% dispersion with a maximum velocity of 4,1 ± 1,6 µm/min (= RPCH-control, P= 0,277). ROCK inhibition with 3µM Y-27632 or 50 nM H-1152 decreases RPCH-triggered pigment aggregation by 15,4 ± 4,8% and 32,8 ± 14,3%; maximum velocities are similar to RPCH-control, 18 ± 3,5 m/min (P=0,86) and 13,9 ± 2,3 m/min (P=0,9), respectively. H-1152 induces spontaneous dispersion; dispersion during RPCH washout is accelerated by both Y-27632 and H-1152. Non-muscular myosin II inhibited with blebbistatin reduces the response to RPCH, aggregation reaching 47 ± 6,2% in 16 min, with a maximum velocity of 9,1 ± 1,5 µm/min (= RPCH-control, P= 0,007), followed by spontaneous dispersion; RPCH washout leads to normal dispersion. Microtubules are present in the cellular extensions in chromatophores with aggregated pigments; actin microfilaments, apparently form trails to associate with pigment granules; non-muscular myosin II is associated with the cytoskeleton; skeletal and muscular myosin, kinesin and dinein, associated with the granules, were revealed by fluorescence microscopy. We showed that the RPCH receptor may be a GPCR. A pGlu receptor does not seem to be present and play a role in signal transduction. NOS, PKG, MLCP and ROCK play important roles in pigment aggregation, although MLCK apparently does not. We suggest that RPCH binds to a G0 protein coupled receptor in the plasma membrane, and together with cytosolic [Ca2+] increase, triggers NOS activation, producing NO, that stimulates GC-S to release cGMP. This second messenger activates PKG, that phosphorylates an activation site on myosin, whose movements are driven by a phosphorylation/dephosphorylation cycle at a regulatory site on the myosin light chain, catalyzed by MLCP and ROCK. One of the PKG activated myosins may be non-muscular myosin II, which seems to effect mainly the slow phase of pigment aggregation. Other myosins and dinein possibly also participate in pigment aggregation, while kynesin seems to play a role in pigment dispersion.

Motores moleculares são proteínas capazes de transportar objetos tais como vesículas, organelas e macromoléculas ao longo do citoesqueleto. Tratam-se de dispositivos bastante interessantes do ponto de vista físico, pois produzem trabalho em um ambiente extremamente ruidoso. Recentemente, diversos experimentos realizados in vivo têm revelado que objetos transportados por motores moleculares ao longo dos microtúbulos apresentam movimento bidirecional. Embora o movimento unidirecional dos motores envolvidos no transporte destes objetos seja bem caracterizado tanto experimentalmente quanto teoricamente, o movimento bidirecional das partículas transportadas pelos motores ainda não é bem entendido. Contudo, acredita-se que este fenômeno seja causado pela cooperatividade dos motores moleculares. Existem na literatura diversos trabalhos que visam descrever o comportamento coletivo de partículas locomovendo-se sobre uma rede unidimensional com interações de volume excluído e taxas de transição assimétricas. Estes modelos são conhecidos como TASEP (Totally asymmetric simple exclusion processes ) ou ASEP (Asymmetric simple exclusion processes ) e fazem parte de uma classe de modelos denominados sistemas difusivos dirigidos_. Embora alguns autores tenham utilizado modelos do tipo ASEP e TASEP para descrever o movimento dos motores moleculares exclusivamente [37], [38], não há ainda nesta visão microscópica, extensões deste modelo para incorporar as partículas cuja dinâmica depende exclusivamente da presença de motores. No presente trabalho propomos um modelo de exclusão, desenvolvido com o intuito de descrever o movimento conjunto de motores moleculares e das partículas carregadas pelos mesmos, as quais por simplicidade denominamos vesículas. Neste modelo, as vesículas não possuem dinâmica própria, ou seja, dependem da interação com os motores moleculares para se movimentarem. Procuramos soluções analíticas para este modelo para o 1 RESUMO 2 caso em que há apenas uma vesícula locomovendo-se sobre a rede. Utilizando o método das matrizes [32], calculamos a velocidade média da vesícula no estado estacionário e analisamos seu comportamento em situações de interesse. / Molecular motors are proteins that transport objects such as vesicles, organelles and macromolecules along the cytoskeletum of cells. For physics, they are very interesting devices because they are able to generate work in an extremely viscous environment. Recently, many in vivo experiments have revealed that objects transported by molecular motors move bidirectionally along microtubules. Although the unidirectional movement of such molecular motors is experimentally and theoretically well characterized, the movement of particles transported by these motors is not well understood yet. However, this fenomenum is believed to be caused by the cooperativity of molecular motors. A great number of works are found in literature, which were formulated to describe the collective behaviour of many particles moving in a one-dimensional lattice with a preferred hop rate and exclusion. These models are known as TASEP (Totally asymmetric simple exclusion processes) or ASEP (Asymmetric simple exclusion processes) and are part of a class of models named _driven di_usive systems_. Although some authors made use of ASEP and TASEP models to describe the movement of molecular motors [37], [38], there is not yet, in this microscopic point of view, extensions of these models capable of incorporate particles which the dynamics depends exclusivaly from the presence of motors. In this work we propose a exclusion model developed to describe the joint movement of molecular motors and particles, generally called vesicles. In this model, vesicles do not have a proper dynamics, that is, they on the interaction with molecular motors to move. We look after analytical solutions of this model when there is only one vesicle moving on the lattice. We use a matrix formulation [32] to obtain the mean velocity of the vesicle and analyse its behaviour in situations of interest.

Motores moleculares são proteínas capazes de transportar objetos tais como vesículas, organelas e macromoléculas ao longo do citoesqueleto. Tratam-se de dispositivos bastante interessantes do ponto de vista físico, pois produzem trabalho em um ambiente extremamente ruidoso. Recentemente, diversos experimentos realizados in vivo têm revelado que objetos transportados por motores moleculares ao longo dos microtúbulos apresentam movimento bidirecional. Embora o movimento unidirecional dos motores envolvidos no transporte destes objetos seja bem caracterizado tanto experimentalmente quanto teoricamente, o movimento bidirecional das partículas transportadas pelos motores ainda não é bem entendido. Contudo, acredita-se que este fenômeno seja causado pela cooperatividade dos motores moleculares. Existem na literatura diversos trabalhos que visam descrever o comportamento coletivo de partículas locomovendo-se sobre uma rede unidimensional com interações de volume excluído e taxas de transição assimétricas. Estes modelos são conhecidos como TASEP (Totally asymmetric simple exclusion processes ) ou ASEP (Asymmetric simple exclusion processes ) e fazem parte de uma classe de modelos denominados sistemas difusivos dirigidos_. Embora alguns autores tenham utilizado modelos do tipo ASEP e TASEP para descrever o movimento dos motores moleculares exclusivamente [37], [38], não há ainda nesta visão microscópica, extensões deste modelo para incorporar as partículas cuja dinâmica depende exclusivamente da presença de motores. No presente trabalho propomos um modelo de exclusão, desenvolvido com o intuito de descrever o movimento conjunto de motores moleculares e das partículas carregadas pelos mesmos, as quais por simplicidade denominamos vesículas. Neste modelo, as vesículas não possuem dinâmica própria, ou seja, dependem da interação com os motores moleculares para se movimentarem. Procuramos soluções analíticas para este modelo para o 1 RESUMO 2 caso em que há apenas uma vesícula locomovendo-se sobre a rede. Utilizando o método das matrizes [32], calculamos a velocidade média da vesícula no estado estacionário e analisamos seu comportamento em situações de interesse. / Molecular motors are proteins that transport objects such as vesicles, organelles and macromolecules along the cytoskeletum of cells. For physics, they are very interesting devices because they are able to generate work in an extremely viscous environment. Recently, many in vivo experiments have revealed that objects transported by molecular motors move bidirectionally along microtubules. Although the unidirectional movement of such molecular motors is experimentally and theoretically well characterized, the movement of particles transported by these motors is not well understood yet. However, this fenomenum is believed to be caused by the cooperativity of molecular motors. A great number of works are found in literature, which were formulated to describe the collective behaviour of many particles moving in a one-dimensional lattice with a preferred hop rate and exclusion. These models are known as TASEP (Totally asymmetric simple exclusion processes) or ASEP (Asymmetric simple exclusion processes) and are part of a class of models named _driven di_usive systems_. Although some authors made use of ASEP and TASEP models to describe the movement of molecular motors [37], [38], there is not yet, in this microscopic point of view, extensions of these models capable of incorporate particles which the dynamics depends exclusivaly from the presence of motors. In this work we propose a exclusion model developed to describe the joint movement of molecular motors and particles, generally called vesicles. In this model, vesicles do not have a proper dynamics, that is, they on the interaction with molecular motors to move. We look after analytical solutions of this model when there is only one vesicle moving on the lattice. We use a matrix formulation [32] to obtain the mean velocity of the vesicle and analyse its behaviour in situations of interest.

Cells are the minimum unit of life. They are born, they eat, the may grow, they may move, and, eventually, they die. By contrast, from a physicist point of view, cells are systems out of equilibrium continuously transducing between matter, energy and information. This transduction is what grants the cell their active properties. In order to perform such tasks, cells have a set of macromolecules, a machinery, which are called, Molecular Motors or Molecular Machines. The operation of molecular motors is multiple. For instance, kinesins are molecular motors able to transport cargoes along the cell, or the Bacterial Flagellar Motor works as a nanometric ionic turbine transmitting its rotation to bacterial flagella propelling the cell. The energy input of such nanometric devices have two primary sources. On one hand the hydrolysis of nucleotide derivatives, such as ATP. On the other hand, molecular motors can also be found in biological membranes obtaining energy from the natural flux of ions crossing the membrane due to mechano-chemical energetic differences at each side. The recycling of ATP molecules takes place in another molecular machine, the F0F1 ATP synthase. F0F1 is made up of two subunits that can be separated themselves in two different molecular machines. This way, the F1 motor can couple a rotatory motor with the synthesis/hydrolysis of ATP. Understanding the working of molecular motors is not straightforward. The transduction processes result from a complex set of interactions of all the molecules conforming the motor plus all the interactions with the surrounding molecules. Thus, different approaches with different levels of abstraction are necessary. In the current thesis, molecular motors are studied through the identification of the energetic transduction cycles out of the trajectory of the motor. Trajectories allow to identify the different mechanical and chemical processes driving the motor and allow to propose a spatio-temporal potential for the motor that give information of the energetic performance of the motor such as power and efficiency. This analysis is performed on the F1 motor (in its hydrolysis regime). Such analysis allowed to identify the origin of two well differentiated mechanical and chemical processes that were quantified by means of the reaction kinetics theory and the overdamped dynamics associated with the nanometric biological scale. From this analysis resulted a prediction for the average velocity of the motor with the experimental control parameters. The resulting velocity matches experimental measures of the average velocity without fitting any parameter since all the parameters needed can be extracted from alternative experimental assays. The appealing results of the average velocity lead to a proposal of motor potential for the F1 motor consisting on two linear piece-wise potentials flashing between them. Each potential presenting the experimental characteristics observed when the catalytic site of the motor is empty or occupied. The potential also hold the substepping mechanism observed experimentally. Thus, the resulting potential can be tested, together with the overdamped dynamics of the potential and the thermal fluctuations characteristic of the biological cellular scale. This results in a Langevin equation leading the dynamics of the motor. Again, the stochastic dynamics proposed are able to reproduce the velocity of the motor returning a better approximation than the deterministic approach. As happened in the previous case, there is no fitting in the parameters to test the validity of the velocity expression. Actually, the model is able to predict the measured substep angle from optimisation arguments. The mismatch between the deterministic and the stochastic results was identified as a result of a loss of ATP hydrolysis events due to thermal fluctuations that has been also properly quantified through the Fokker-Planck formalism of the corresponding Langevin equation. The motor potential proposed was also used to study experimental assays of the F1 motor working against conservative forces. The effect of a conservative torque in the working of the motor contains contributions both mechanical and chemical. Altogether, this contributions were successfully addressed presenting again an analytical and stochastic prediction for the velocity of the motor that matches the experimental observations without the need of any parameter fitting. This analysis also entailed a study of the energetic performance of the motor which is unavailable experimentally. The results show a complete divergence between the stochastic and deterministic predictions. The divergence is specially dramatical near the stall force of the motor where the determenistic analysis predicts an efficiency maximum and the stochastic analysis returns a null efficiency. This points out that the stochastic effects are very relevant to the energetic performance of the motor and can not be missed in a proper energetic study of a molecular machine. Besides the study of the F1 motor, also a rotatory device working with an ionic flux was analised. The aim of the analysis was the devise of a minimal mechanistic turbine and the study of its main working features. Such a machine is composed by a mobile piston with periodic boundary conditions at both ends of a nanometric channel separating two particle reservoirs. Hence, the turbine is able to transduce energy between the flux of ions and an external force hindering the natural motion of the piston. Again, thermal fluctuations provide a stochastic dynamic that must be studied through a Langevin equation that can be tackled analytically. This study revealed that the velocity and the flux are not coupled. Specially, two different stall forces appear for the motor. One for the velocity and one for the flux. This results in an intermediate zone where there is a continuous leakage of ions that does not allow any energetic output. This effect is originated from thermal fluctuations. Thus, when the energetic performance is evaluated, a similar behaviour than the one obtained for the F1 motor is recuperated. This minimal model was extended with more complex turbines that take into account more thoroughly the biophysics of molecular machines. All of them result in the same energetic landscape where a minimum of efficiency is obtained near the stall of the motor. Additionally, a new formalism has been developed to simplify the resulting Langevin equations (Fokker-planck white noise limit) and a new algorithm has been devised able to integrate Langevin equations with non-continuous multiplicative noise / Los Motores Moleculares son macromoléculas biológicas que se encargan de hacer las transducciones energéticas necesarias dentro de las células. Este trabajo estudia la transformación de energía de motores moleculares rotatorios reales principalmente la F1-ATPasa, el Motor Flagelar de las Bacterias y el F0. Para estudiar la dinámica del motor se han utilizado ecuaciones de Langevin sobreamortiguadas que recogen la importancia de las fluctuaciones térmicas, así como las fuerzas externas aplicadas al motor (conservativas y disipativas) y el potencial interno del motor que contiene la información físico-química de su comportamiento. Este estudio se ha aplicado a la F1-ATPasa, que se puede estudiar tanto analíticamente, obviando las fluctuaciones térmicas como desde su naturaleza estocástica mediante potenciales intermitentes. En ambos casos, el modelo es capaz de describir la dinámica del motor y su dependencia con los diferentes parámetros controlables experimentalmente: Concentración de ATP, fuerza disipativa y fuerza conservativa. En el mismo sentido se ha diseñado una turbina nanoscópica que recoge los principios básicos de la interacción mecánica entre un flujo de iones y la rotación del motor. En ambos casos, tanto en la turbina como en el F1 se observa que el ruido térmico no afecta mucho a la velocidad del motor y en cambio produce cambios enormes en parámetros energéticos como la potencia o la eficiencia. Concretamente, el escenario clásico en que un máximo de eficiencia se obtiene para la fuerza de calado desaparece obteniendo nuevos regímenes óptimos de trabajo. Adicionalmente, se ha desarrollado un formalismo para simplificar las ecuaciones de Langevin obtenidas (límite de ruido blanco) y se ha diseñado un nuevo algoritmo para integrar ecuaciones de Langevin en las cuales el ruido multiplicativo es discontinuo en el espacio.