Nous avons mis en évidence la présence des phagocytes exprimant le lysozyme dans les Plaque de Peyer chez l’Homme et montré que, comme chez la souris, elles sont principalement localisées dans le SED et sont distinctes des cDC. Dans un deuxième temps, nous avons étudié dans les PP de souris la fonction des différentes populations de phagocytes nouvellement caractérisées. Nous avons en particulier étudié l’impact de la détection d’un acide nucléique d’origine virale par les phagocytes en utilisant un agoniste synthétique du TLR7 : le R848. Bien que TLR7 soit exprimé par les cellules dérivées de monocytes et les DC plasmacytoïdes mais pas par les cDC, nous avons mis en évidence un processus d’activation rapide des cDC impliquant le TNF. Celui-ci conduit à une migration des cDC depuis les villosités adjacentes au dôme vers les IFR et à une forte augmentation de l’expression du CMH-II, des molécules co-stimulatrices ainsi que des gènes dépendants de l’interféron. L’activation du TLR7 induit également une forte expression de la sous unité p40 de l’IL-12 par les LysoDC et certains macrophages. De manière intéressante, nous avons également observé une forte expression d’IL-12 p40 par les LysoDC et certains macrophages peu de temps après le sevrage. Cela nous a conduits à étudier le rôle de cette cytokine dans la mise en place de la réponse immunitaire mucosale. Notre étude a donc des répercussions sur la compréhension des mécanismes conduisant à la mise en place de la réponse immunitaire mucosale en réponse à l’implantation du microbiote intestinal peu de temps après la naissance. / In this study, we first showed that lysozyme expressing cells are found in human PP and share features with their mouse counterpart, such as location and origin. Then, we investigated the behaviour of mouse PP phagocytes upon TLR7 stimulation, using the small synthetic agonist, R848. In PP TLR7 is expressed by monocyte derived cells and plasmacytoid DC, but not by cDC. Nevertheless, TLR7 stimulation triggers a quick activation of cDC. This activation relies on TNF secretion and leads to a massive migration of cDC from the dome associated villi to the IFR and to an increase of MHCII, co-stimulatory molecules and interferon-stimulated gene expression. Stimulation by TLR7 also induces a massive production of IL12p40 by LysoDC and some macrophages. Interestingly, we observed a similar increase of IL-12 p40 production by LysoDC and macrophages shortly after weaning. We thus investigated the impact of Il-12 p40 secretion on the development of the mucosal immune response. Therefore, our study provides clues on the mechanisms involved in the establishment of the mucosal immune response following microbiota colonization.

Les plaques de Peyer (PP) sont les principaux sites inducteurs de la réponse immunitaire mucosale.L’épithélium associé aux follicules comprend des cellules épithéliales spécifiques, appelées cellules M et spécialisées dans le transport du matériel présent dans la lumière intestinale vers le dôme sous épithélial (SED) où il sera pris en charge par les cellules du système phagocytaire mononuclée (MPS) qui orchestreront ensuite les réponses immunitaires mucosales.Nous avons effectué une analyse complète du phénotype, de la distribution, de l’ontogénie, de la fonction et des profils transcriptomiques du MPS des PP. Nous avons montré que les monocytes donnent naissance à deux populations: les lysoDC et les lysoMac. La première exprime de fort niveau de CMH-II et de molécules de costimulation, a une courte durée de vie et est capable d’activer les lymphocytes T naïfs pour sécréter de l’IFNγ tandis que la deuxième exprime faiblement le CMH-II, à une longue durée de vie et n’est pas capable d’activer les LT naïfs. Ces deux populations ont toutefois des propriétés communes de phagocytose et de défense innée contre les virus et les bactéries entéropathogènes. Nous avons identifié deux populations distinctes de lysoMac selon l’expression de Tim4: les lysoMac Tim4+ situés dans l’IFR et la partie inférieure du follicule ; les lysoMac Tim4- situés dans le SED et la partie supérieure du follicule. Nous avons aussi déterminé 4 états de maturation pour les lysoDC suivant l’expression d’Emb, Jam-A et CD24. Nous avons également redéfini la localisation de chaque population du MPS des PP fournissant ainsi une base solide pour étudier le rôle de chacun de ses membres dans l’immunité mucosale. / Peyer’s patches (PPs) are primary inductive sites of mucosal immunity. The follicle-associated epithelium contains specialized epithelial cells, called M cells, that bind and rapidly transport microorganisms from the lumen to the subepithelial dome (SED) where they are internalized by cells of the mononuclear phagocyte system (MPS) which are involved in the initiation of the mucosal immune responses. MPS comprise monocytes, macrophages (Mφ) and dendritic cells (DC). Here, we provide a comprehensive analysis of the phenotype, distribution, ontogeny, function, and transcriptional profile of PP MPS. We show that monocyte give rise to two different cell populations named lysoDC and lysoMac. The former express high levels of MHCII and costimulatory molecules, have a short half life and are able to prime naïve T cells for IFNγ production while the latter display low levels of MHCII, have a long half life and are unable to prime naïve T cells efficiently. However, these two cell populations share common features such as phagocytosis and antimicrobial defense mechanisms. LysoMac can be separated in two subpopulations according to Tim4 expression: Tim4+ lysoMac located in the IFR and the lower part of the follicle; Tim4- lysoMac located in the SED and upper part of the follicle. LysoDC can be separated in four different maturation stages according to Emb, Jam-A and CD24 expression. Finally, we redefined the location of each PP MPS population. In summary, we provide a comprehensive map of the PP MPS which will allow to study its role in mucosal immune response initiation and regulation.

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Plusieurs méthodes de capture antigénique ont été décrites dans l’intestin grêle, surtout en cas d’infection: échantillonnage direct par les cellules dendritiques (DC), capture par les macrophages qui délivrent ensuite l’antigène aux DC du stroma, passage des antigènes à travers les cellules caliciformes. Des travaux antérieurs in vitro dans le laboratoire ont montré l’importance de la myosine IIA dans la coordination de la migration des DC avec la capture et de l’apprêtement antigénique. L’objectif de ma thèse était de combiner plusieurs méthodes d’imagerie telle que la microscopie intravitale, la microscopie confocale ex vivo et l’immunofluorescence sur tissus à la cytométrie en flux pour déterminer l’impact de la myosine IIA sur la capture antigénique in vivo. Cette étude montre que les DC patrouillent en permanence dans l’épithélium de l’intestin grêle, y compris hors conditions infectieuses. Elles sont recrutées dans la lamina propria (LP) et pénètrent dans l’épithélium par transmigration à travers la membrane basale qui sépare ces deux compartiments. La myosine IIA est indispensable à la transmigration de CD103+CD11b+DC. Ces événements de transmigration surviennent plus fréquemment dans les parties proximales de l’intestin grêle, duodénum and jéjunum, que dans l’iléon. Chez les souris adultes, ces DC ne sont pas recrutées sous l’influence du microbiote mais sont sensibles au rétinal, un métabolite de la vitamine A qu’elles transforment en une molécule active l’acide trans-rétinoïque (AtRA). D’après notre analyse transcriptomique, les DC intra-épithéliales constituent une population homogène dont le profil est distinct de celui de leurs homologues de la LP. Elles sont enrichies en ARN des voies liées à l’apprêtement antigénique, l’autophagie et les lysosomes. Ces résultats suggèrent qu’elles ont une fonction différente des CD103+CD11b+DC de la LP: elles n’agissent pas sur la prolifération ni la différenciation des lymphocytes T mais contrôlent spécifiquement l’effectif des lymphocytes intra-épithéliaux CD8+αβ. Ces découvertes reflètent l’importance de l’épithélium comme première ligne de défense contre les pathogènes. Elles soulèvent également de nouvelles questions concernant la régulation de la réponse immune dans l’épithélium et les interactions mutuelles entre la lumière intestinale, l’épithélium et le stroma des villosités. / Several routes for antigen capture have been described in the small intestine, mainly upon pathogenic infection: direct sampling by Dendritic Cells (DCs), sampling by macrophages that deliver antigens to DCs in the stroma, antigenic passage through goblet cells. Previous in vitro work in the lab showed that myosin IIA is essential to coordinate antigen uptake and processing with DC migration. The objective of my thesis was to combine several imaging methods including intravital microscopy, ex vivo confocal microscopy and immunofluorescence on gut tissue to flow cytometry in order to unravel the impact of myosin IIA on DC physiology in vivo. My work shows that CD103+CD11b+ DCs, which are unique to the gut, constantly patrol the epithelium of the small intestine at steady state: they are recruited from the lamina propria (LP) and penetrate into the epithelium by transmigrating through the basal membrane that separates these two compartments. DC transmigration requires myosin IIA in vivo. Remarkably, we found that DC transmigration into the epithelium occurs mainly in the upper parts of the small intestine, the duodenum and the jejunum, but is not observed in the ileum. DC transmigration does not require the gut microbiota but relies on retinal, a vitamin A metabolite of that they convert into its active form all-trans retinoic acid (AtRA). Strikingly, single cell RNA-seq showed that intra-epithelial CD103+CD11b+ DCs constitute a homogenous cell population with a distinct transcriptomic signature from their LP counterpart. They are enriched with RNA related to antigen presentation, autophagy and lysosome pathways. Our results further suggest that these cells have a different function from LP CD103+CD11b+ DCs, as they do not significantly impact proliferation or differentiation of T helper lymphocytes but control the CD8+αβ intraepithelial lymphocytes (IELs) pool. These findings highlight the importance of the epithelial tissue as a first line of defense against pathogens in the upper parts of the small intestine. They also raise new questions about the regulation of the immune response in the epithelium and the mutual influences between lumen, epithelium and intestinal lamina propria.

L'infection par le (virus de l'immunodéficience humaine) VIH est caractérisée par une déplétion sévère et massive, précoce des T CD4+ dans l'intestin. Les mécanismes à l'origine de cette déplétion sont imparfaitement connus, mais la conséquence de cette atteinte muqueuse est une activation chronique du système immunitaire liée à la translocation microbienne. Surtout, cette atteinte semble irréversible malgré le contrôle efficace de la réplication virale à long terme.La translocation microbienne, causée par l'infection à VIH, établit une activation immunitaire chronique dans l'intestin, et cela a un impact grave sur la reconstitution des cellules T CD4 + et de leurs fonctions. Cependant, on ne sait pas si les dommages de la muqueuse intestinale peuvent être restaurés à un niveau normal grâce à l'intervention thérapeutique, et les facteurs déterminants qui influenceront T CD4 + restauration cellulaire n'ont pas été identifiés.En induisant une défense de la muqueuse contre les agents pathogènes microbiens dans l'intestine et le maintien de l'intégrité intestinale de l'épithélium, les cellules Th17+T CD4 + nouvellement caractérisé orchestrent l'immunité muqueuse. Une perte de cellules Th17 a été observée dans infections par le VIH et l'immunodéficience simien virale (SIV) et conduit à une défense immunitaire altérée contre les agents pathogènes microbiens entrants et, en conséquence, la diffusion systémique des agents pathogènes.Dans cette étude, j'ai cherché à mieux comprendre les déterminants de la restauration de la muqueuse intestinale afin de répondre à la question si leur fonction peut être restaurée au cours de traitement antirétroviral (combined antiretroviral therapy, cART) tôt initié.Analyse phénotypique et l'expression des gènes ont été effectués à partir de l'intestin de patients naïfs infectés par le VIH ou les patients initiés au traitement de cART soit à la phase précoce de l'infection primaire, ou plus tard au cours de la phase chronique. Ces données démontrent une diminution de la muqueuse Th22 et IL-17 cellules produisant chez les patients naïfs. Ces populations, à l'exception des cellules Th22, n'ont pas été restaurées sous cART. Le rapport Treg/Th17 a été significativement augmentée chez les patients infectés par le VIH et a été inversement corrélée avec la restauration des cellules T CD4 +, mais pas avec des niveaux d'ADN du VIH dans l'intestin. Les analyses d'expression génique profilage de la muqueuse intestinale distingué deux groupes de patients, qui a coïncidé avec le moment de l'initiation du cART. La majorité de début traitée, mais pas les patients traités plus tard a montré une structure conservée intestinale lymphoïde, l'intégrité de la barrière épithéliale et dendritiques voies de maturation cellulaire. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que l'initiation précoce d'antirétroviraux contribue à préserver et / ou restaurer l'homéostasie lymphoïde de la muqueuse intestinale et donc fournir une justification pour lancer cART au cours de la phase aiguë de l'infection par le VIH. / Human Immunodeficiency Viral (HIV) infection leads to a severe and massive CD4+T cell depletion in the gut associated lymphoid tissue (GALT) very early during the course of viral infection. This depletion, which is not reflected in peripheral blood, persists despite the initiation of combined antiretroviral therapy (cART). The loss of lamina propria CD4+T cells, changes in the lymphatic architecture and altered intestinal epithelial barrier leading to microbial translocation are the common features of HIV-1 infection and are not fully restored under cART.Microbial translocation, caused by HIV infection, establishes a chronic immune activation, and this has a severe impact on the reconstitution of CD4+T cells and their functions. However, it is not known whether gut mucosal damage can be restored to normal levels through therapeutic intervention, and the determining factors that would influence CD4+T cell restoration have not been identified.By inducing a mucosal defense against microbial pathogens in GALT and maintaining the gut epithelial integrity, newly characterized Th17 CD4+T cells orchestrate the mucosal immunity. A loss of Th17CD4+T cells has been observed in HIV and Simian Immune Deficiency Viral (SIV) infections and leads to an impaired immune defense against incoming microbial pathogens and, as a consequence, systemic dissemination of pathogens.In this study, we analyzed parameters of gut mucosal restoration in order to answer the question if their function can be restored during early initiated cART.Phenotypic and gene expression analyses have been performed from the gut of HIV-infected naïve patients or patients treated for several years. We analyzed 2 groups of treated patients, one initiated cART treatment at the early phase of the primary infection, the second during the chronic phase. These data demonstrate a depletion of mucosal Th22 and IL-17 producing cells in naive patients. These populations, except Th22 cells, were not restored under cART. The Treg/Th17 ratio was significantly increased in HIV infected patients and was inversely correlated with the restoration of CD4+T cells, but not with HIV DNA levels in the gut. Gene expression profiling analyses of gut mucosal distinguished two groups of patients, which coincided with the timing of cART initiation. The majority of early treated, but not later treated patients exhibited a conserved intestinal lymphoid structure, epithelial barrier integrity and dendritic cell maturation pathways. Overall, these results demonstrate that early initiation of cART helps to preserve and/or restore lymphoid gut mucosal homeostasis and thus provide a rationale for initiating cART during the acute phase of HIV infection.

Le rôle de la salive dans la perception sensorielle est de plus en plus reconnu, notamment par le biais des interactions physico-chimiques pouvant s’établir entre protéines salivaires et constituants alimentaires. Ce travail s’intéresse à la pellicule salivaire, la couche de protéines salivaires ancrées aux cellules épithéliales, et vise à caractériser les interactions pouvant s’établir d’une part entre ces protéines et épithélium oral, et d‘autre part entre ces protéines et les molécules de la flaveur. Pour cela, un modèle in vitro de muqueuse orale a été développé. Une lignée cellulaire stable (TR146/MUC1) a été obtenue par transfection de la lignée cellulaire TR146 de manière à exprimer la mucine membranaire MUC1. Afin de former une pellicule salivaire, les cellules confluentes ont été incubées avec de la salive humaine. La rétention des mucines salivaires MUC5B par les cellules TR146/MUC1 est augmentée par rapport aux TR146, apportant ainsi un argument en faveur de l’implication de MUC1 dans l’ancrage des MUC5B aux cellules épithéliales. Le modèle développé a été appliqué à l’étude des interactions entre la muqueuse orale et les molécules d’arôme et les tanins. L’analyse des coefficients de partage par GC-FID a mis en évidence 1- l’importance de l’hydratation de la muqueuse sur la libération des composés les plus hydrophiles, 2- la capacité des cellules à métaboliser certaines molécules d’arôme, 3- l’absence d’effet de la pellicule sur la libération des molécules d’arôme à l’équilibre. En revanche, l’analyse par PTR-MS a révélé un effet de la muqueuse et de la pellicule sur la cinétique de libération des molécules d’arôme. Les interactions entre les protéines de la pellicule salivaire et les tanins modifient les caractéristiques structurales de la pellicule, en particulier le tapissage des cellules par les MUC5B. Les possibles implications sensorielles, respectivement dans les phénomènes de persistance aromatique et d’astringence, sont discutées. / The role of saliva in food sensory perception is increasingly recognized, especially through physicochemical interactions occurring between salivary proteins and food components. This work focuses on the mucosal pellicle, a layer of salivary proteins anchored onto epithelial cells, and aims at characterizing interactions that may occur between the proteins of the mucosal pellicle and flavour compounds. For that purpose, an in vitro model of oral mucosa was developed. A stable cell line (TR146/MUC1) was obtaining by transfecting the TR146 cell line in order to express the membrane bound mucin MUC1. In order to form a salivary pellicle, confluent cells were incubated with human saliva. A higher retention of salivary MUC5B by TR146/MUC1 cells was observed compared to TR146 cells, emphasising the involvement of MUC1 in MUC5B anchoring to epithelial cells. The model was applied to the investigation of interactions between the oral mucosa and aroma molecules and tannins. Measurements of partition coefficients by GC-FID revealed 1- the role of hydration of the mucosa on the release of the most hydrophilic compounds, 2- the ability of cells to metabolize some aroma compounds, 3- the absence of effect of the mucosal pellicle itself on aroma release at the thermodynamic equilibrium. Oppositely, analyses by PTR-MS evidenced an effect of the mucosa and of the pellicle on aroma release kinetic. Interactions between proteins of the mucosal pellicle and tannins modified structural characteristics of the pellicle, especially the coating of cells by salivary MUC5B. Sensory relevance for the phenomena of aroma persistence and astringency, respectively, are discussed.