Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Certaines maladies neurodégénératives sont associées au mauvais repliement de la protéine prion (PrP[indice supérieur c]) et sont connues sous le nom de maladies à prion ou les encéphalopathies spongiformes transmissibles (ESTs). Récemment, il a été démontré que PrP[indice supérieur c] augmente l'efficacité des micro-ARN (miARN) via son interaction directe avec la protéine Argonaute 2 (Ago2) au niveau de la membrane des corps multivésiculaires (multivesicular bodies (MVBs)). Ago2 est une des protéines centrales du complexe RISC (RNA-induced silencing complex) qui est responsable de l'efficacité des ARNi. Certaines formes pathologiques de PrP[indice supérieur c] induisent l'activation de la réponse au stress eiF2a dépendante, une étape déterminante pour le développement de la pathologie. Cependant, l'activation de la réponse au stress eiF2a dépendante, favorise normalement la survie cellulaire via la formation de deux types de granules d'ARN, les granules de stress (GSs) et les P-Bodies. Aucune étude n'a investigué le rôle de ces deux types de granules d'ARN et de la régulation de l'efficacité des miARN par PrP[indice supérieur c] dans la neurotoxicité associée aux ESTs. Mon premier objectif est d'approfondir nos connaissances sur le nouveau rôle de PrP[indice supérieur c] dans la régulation du système miARN et de l'implication des miARN et du système endosomal dans les ESTs génétiques. Mon second objectif est d'investiguer le rôle des GSs et des P-Bodies, dans la neurotoxicité reliée aux ESTs et établir un lien entre la dérégulation de la réponse au stress et du système ARNi. PrP[indice supérieur c] augmente l'efficacité des miARN via l'interaction de sa région octapeptidique répété (OR, octapeptide repeat region) avec la protéine Ago2. L'effet d'un mutant cytoplasmique artificiel nommé CyPrP (connu comme agent neurotoxique potentiel) et de cinq mutants familiaux de PrP[indice supérieur c] sur le système endosomal et miARN a été caractérisé. Les mutants de PrP[indice supérieur c] affectent la maturation des MVBs et, conséquemment, induisent une délocalisation de GW182, une diminution l'efficacité des miARN et de la production des exosomes. Nous proposons que cette dérégulation de la voie endosomale et miARN par les mutants familiaux de PrP[indice supérieur c] contribue à la neurodégénérescence observée dans les ESTs. Les mutants de PrP[indice supérieur c] induisent également l'expression de la protéine PACT qui est responsable de l'activation de la kinase de stress PKR et de la phosphorylation d'eiF2a. Cependant, malgré la phosphorylation d'eiF2a, les mutants familiaux de PrP[indice supérieur c] et PrP[indice supérieur Sc] inhibent la formation des GSs et des P-Bodies augmentant la susceptibilité des cellules aux différents stress. L'inhibition des P-bodies par les mutants confirment également que les mutants de PrP[indice supérieur c] induisent une diminution de l'efficacité des miARN. Je propose que le maintien de l'activation de la voie PACT-PKR-eiF2a et l'inhibition des GSs et des P-Bodies contribuent à la dérégulation du système d'ARNi, à la susceptibilité des neurones et à la neurodégénérescence observée dans les ESTs. Une meilleure compréhension des mécanismes de neurotoxicité plus particulièrement de l'inhibition du système ARNi et de la réponse au stress par les formes mal repliées de PrP[indice supérieur c] peut mener au développement de médicaments afin de contrer l'évolution de la pathologie. [symboles non conformes]

Les exosomes sont des vésicules membranaires de 30 à 100 nm de diamètre, formées dans les endosomes multivésiculaires et sécrétées par la plupart des cellules. Les propriétés biophysiques et biochimiques des exosomes ainsi que les mécanismes permettant leur biogénèse et sécrétion ont fait l’objet de nombreuses études. Cependant, ces derniers sont encore méconnus, limitant l'analyse des fonctions des exosomes in vivo. Au moins deux mécanismes ont été proposés pour la biogénèse des exosomes : un mécanisme nécessiterait l’action de protéines impliquées dans le tri endosomal, les ESCRT (« endosomalsorting complex required for transport »). Un autre mécanisme serait indépendant de leur fonction. La sécrétion des exosomes, une fois générés dans les endosomes, requiert la petite GTPase, Rab27a, comme montré dans un modèle cellulaire humain. Mes travaux de thèse ont porté sur l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la biogénèse et la sécrétion des exosomes. Une première étude visant à analyser la fonction de Rab27a dans des cellules murines, m’a permis de mettre en évidence l’existence de différentes populations d’exosomes, dont la sécrétion dépend ou non de Rab27a. Une deuxième étude a eu pour objectif d’analyser l’implication des ESCRT dans la biogénèse des exosomes dans des cellules HeLa CIITA. Le criblage d’une librairie d’ARN d’interférence dirigés contre les différentes protéines ESCRT, a permis l’identification de 7 molécules potentiellement impliquées dans cette voie : HRS, STAM1, TSG101, leur inactivation induisant la diminution de la sécrétion des exosomes. L’inactivation de CHMP4C, VPS4B,VTA1 et ALIX, au contraire, l’augmente. L’inhibition de l’expression de ces candidats suivie de l’analyse des exosomes sécrétés a démontré l’hétérogénéité des vésicules sécrétées, et une modification de leur taille et de leur composition protéique par rapport aux cellules contrôle. Plus particulièrement, l’inactivation d’ALIX induit une augmentation de lasécrétion d‘exosomes de plus grande taille, et l’enrichissement sélectif en molécules de CMH de classe II. En accord, j’ai montré que les cellules inactivées pour ALIX, aussi bien des cellules HeLa que des cellules dendritiques humaines ont une plus forte expression de CMH de classe II à la surface et dans des compartiments intracellulaires. Ces résultats suggèrent l’implication de certains membres de la famille ESCRT dans la voie de biogenèse et sécrétion des exosomes, ainsi qu’un rôle potentiel d’Alix dans le trafic des molécules CMH de classe II, et dans la modulation de la composition protéique des exosomes. / Exosomes are small membrane vesicles with sizes ranging from 30 to 100 nm in diameter, which are formed in multivesicular endosomes and secreted by most cell types. Numerous studies have focused on the biophysical and biochemical properties of exosomes, as well as the mechanisms of biogenesis and secretion of these vesicles. However, these aspects are not fully understood, which limits the analysis of the functions of exosomes in vivo. At least two mechanisms have been proposed for the biogenesis of exosomes : one would rely on the function of proteins involved in endosomal sorting, the ESCRT family (for “endosomal sorting complex required for transport”). Another mechanism would be independent of their activity. Once exosomes are formed in endosomes, their secretion requires the small GTPase RAB27A, as shown in a human cell line. The objective of my PhD project was to gain insights into the molecular mechanisms that drive exosome biogenesis and secretion. A first study performed to analyze the function of Rab27a in murine cells allowed me to show the existence of different populations of exosomes, dependent or not on Rab27a for their secretion. A second study was aimed at analyzing the involvement of ESCRT proteins in exosome biogenesis in HeLa-CIITA cells. Seven molecules potentially involved in this process were identified on the basis of the screening of an RNA interference library directed against the different ESCRT proteins: the inactivation of HRS, STAM1 and TSG101 induced a decrease in exosome secretion, whereas the down regulation of CHMP4C, VPS4B, VTA1 and ALIX increased it. Gene expression of the different candidate proteins was inhibited and exosomes secreted by these cells were analyzed: we showed the heterogeneity of the secreted vesicles, as well as an alteration of their size and protein composition, as compared to control cells. In particular, the inactivation of ALIX induced an increase in the secretion of larger vesicles, and the selective enrichment of these vesicles in MHC class II molecules. Accordingly, I showed that both HeLa-CIITA and human primary dendritic cells inactivated for ALIX possess a higher expression of MHC class II molecules at the cell surface and in intracellular compartments. These results suggest that some members of the ESCRT family are involved in the exosome biogenesis and secretion pathway, and propose a potential role of ALIX in the trafficking of MHC class II molecules and in the modulation of the protein composition of exosomes.