Ulm, Univ., Diss., 2008.

Konstanz, Univ., Diplomarb., 2008.

Techn. Hochsch., Diss., 2000--Aachen.

Universiẗat, Diss., 2004--Würzburg. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.

Universiẗat, Diss., 2006--Kassel.

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.

Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.