Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-08Bitstream added on 2014-06-13T19:08:38Z : No. of bitstreams: 1 aquino_i_me_botib.pdf: 485581 bytes, checksum: 72dc0e003e4ace9410c6185e551add41 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O tratamento para combater a Malária, recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS), é feito com medicamentos derivados da artemisinina (tais como o artesunato), o princípio ativo extraído da Artemisia annua. Com base nesta informação, foi avaliado neste projeto o potencial genotóxico da artemisinina (ATM) e do artesunato (ART) em células HepG2 (Human hepatocellular liver carcinoma cell line), in vitro, além da investigação do potencial genotóxico e/ou mutagênico do artesunato, em células de camundongos in vivo. Nestas análises foram utilizados o ensaio cometa e o teste de micronúcleo, para a verificação da genotoxicidade e mutagenicidade; nos ensaios in vitro, também foram realizados testes de citotoxicidade e análise da expressão dos genes SOD1 e Casp3. Nos ensaios in vivo, utilizando camundongos tratados com ART, foi verificado através do Ensaio Cometa que, nas células de sangue periférico, apenas a maior dose testada (2000mg/kg) foi genotóxica, quando comparada ao grupo controle negativo. Já nas células de fígado, as doses de 5mg, 50mg e 2000mg/kg mostraram-se genotóxicas, com p<0,05. Quanto à mutagenicidade, os tratamentos com ART nas doses de 50mg, 100mg e 2000mg/kg apresentaram aumento significativo no número de células micronucleadas em relação ao grupo controle. Nos testes in vitro, os resultados do ensaio cometa com a ATM e o ART mostraram um aumento significativo (p<0,001) no número de células com danos no DNA, em relação ao controle negativo, em todos os tratamentos e para ambas as substâncias, o que indica um efeito genotóxico da ATM e do ART. Já na análise da expressão gênica, houve um aumento na expressão de Caspase 3, nas células tratadas com as duas substâncias, porém, a expressão de SOD1 foi maior em células tratadas com ATM, enquanto nas células tratadas com o ART, houve uma diminuição na expressão deste gene.... / The treatment to combat malaria, recommended by the World Health Organization (WHO), is done with drugs artemisinin derivatives (such as artesunate), the active ingredient extracted from Artemisia annua. Based on this information, and the lack of data on genotoxicity of these compounds in mammalian cells, was evaluated in this project the genotoxic potential of artemisinin (ATM) and artesunate (ART) in HepG2 cells (Human Hepatocellular liver carcinoma cell line), in vitro as well as investigating the potential genotoxic and / or mutagenic of artesunate, in mice in vivo. In these tests we used the comet assay and micronucleus test, to check the genotoxicity and mutagenicity, in vitro assays were also performed cytotoxicity tests and analysis of genes expression SOD1 and Casp3. In vivo tests using mice treated with ART, was determined using the Comet assay that in peripheral blood cells, only the highest dose tested (2000mg/kg) was genotoxic when compared to negative control group. Already in the liver cells, doses of 5mg, 50mg and 2000mg/kg were shown to be genotoxic, p <0.05. For mutagenicity, treatment with ART in doses of 50mg, 100mg and 2000mg/kg showed a significant increase in the number of micronucleated cells in the control group. In vitro tests, the results of the comet assay with the ATM and ART showed a significant increase (p <0.001) in the number of cells with DNA damage, compared to negative control in all treatments and for both substances, the indicates that a genotoxic effect of ATM and ART. The analysis of gene expression, there was an increase in the expression of Caspase 3, in cells treated with both substances, however, the expression of SOD1 was higher in cells treated with ATM, whereas in cells treated with ART, there was a decrease in expression of this gene. Although the analysis of gene expression did not reach statistical significance... (Complete abstract click electronic access below)

O acúmulo de mutações, alterações incorporadas ao patrimônio genético de células somáticas e germinais, pode causar redução de populações naturais que são críticas para a cadeia alimentar, pondo em risco a sobrevivência de determinadas espécies. Embora o dano causado pela contaminação química ocorra em nível molecular, existem efeitos emergentes nas populações, tais como perda da diversidade genética, que não é previsível com base somente no conhecimento dos mecanismos de toxicidade não genéticos. Alguns compostos de origem antrópica tendem a adsorver no material orgânico do sedimento, sendo concentrados ao longo do tempo. Contaminantes ambientais podem ser mais associados com a porção fina dos sedimentos (silte ou argila) do que com a grosseira (areia ou cascalho). O presente estudo avaliou a atividade mutagênica e citotóxica de extratos moderadamente polares de sedimento em três pontos durante 5 coletas realizadas nos anos de 1999 e 2000 no arroio Bom Jardim, que drena a região do Complexo Petroquímico, localizado no município de Triunfo, Rio Grande do Sul. Foi utilizado na avaliação da mutagenicidade e citotoxicidade o ensaio Salmonella/microssoma, método de microssuspensão. A análise de granulometria mostrou um conteúdo de partículas finas em média menor no ponto em frente ao complexo, sendo este também o ponto amostral com menor percentual de material orgânico extraído. Observou-se baixa atividade mutagênica nos diferentes locais estudados, variando de 3,3% até 8,3%, sendo a citototoxicidade o mais importante efeito biológico observado na região, variando de 20% até 40%, somados os resultados dos ensaios em presença e ausência de metabolização externa. Os pontos com maior contaminação estão localizados em frente e a jusante da área industrial, havendo uma distribuição gradativa e sazonal das respostas à medida que o local se aproxima da foz do arroio. Em ensaios com ausência de fração de metabolização hepática, as respostas para mutagênese e citotoxicidade foram mais freqüentes, sendo os danos do tipo erro no quadro de leitura os mais presentes. A determinação da atividade mutagênica e citotóxica em amostras de sedimento mostrou-se importante na determinação da qualidade ambiental, apesar da composição química desta matriz ser bastante complexa. O ensaio Salmonella/microssoma monitorando danos moleculares e, principalmente citotoxicidade, foi uma ferramenta importante no diagnóstico da presença de poluentes. A possibilidade de avaliar danos precoces, através deste ensaio, promove a melhoria da qualidade ambiental e motiva ações de preservação do patrimônio genético da fauna e flora atingidas pela atividade antrópica.

A síndrome de Li-Fraumeni (SLF) é uma síndrome rara de predisposição a câncer associada a mutações germinativas no gene supressor tumoral TP53. As vias de sinalização da proteína p53 estão envolvidas na regulação da apoptose, das paradas do ciclo celular, da senescência e do reparo de danos no DNA. As mutações em p53 mais comumente encontradas em tumores estão distribuídas ao longo do domínio de ligação ao DNA, incluindo a mutação G245S associada à SLF. No entanto, a mutação mais frequentemente associada à SLF nas regiões Sul e Sudeste do Brasil é a mutação R337H, que afeta o domínio de oligomerização de p53. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar os efeitos em células de p53 mutantes associadas à síndrome de SLF na viabilidade em condições basais e na sobrevivência celular sob estresse genotóxico. Células p53 null da linhagem NCI-H1299 foram transfectadas com vetores para a expressão de p53 wt e das mutantes G245S e R337H, e ensaios celulares foram realizados. A mutante R337H inibiu a formação de colônias e diminuiu a viabilidade celular de forma similar ao observado para células com expressão p53 wt, enquanto G245S demonstrou menor influência sobre a viabilidade e sobre a proliferação das células. Após submetidas a estresse genotóxico induzido por meio de exposições à radiação UVC, células com expressão de R337H mostraram-se mais sensíveis à morte celular mesmo quando expostas à baixa dose de UVC. Já as células com a expressão de G245S apresentaram aumento nas taxas de apoptose tardia somente quando submetidas a altas doses de radiação de UVC, assim como nas células com expressão de p53 wt. Dessa forma, foram observadas atividades funcionais similares entre R337H e p53 wt quanto à influência sobre a viabilidade e sobre a proliferação celular, enquanto células com expressão de G245S apresentaram fenótipo celular mais próximo ao p53-null. Todavia, G245S demonstrou atividade próxima a de p53 wt ao conferir proteção às células contra morte induzida pela radiação UVC, e a mutante R337H gerou maior sensibilidade para morte celular em condições de estresse genotóxico. / Li-Fraumeni syndrome (LFS) is a hereditary cancer predisposition disorder associated with germline mutations in the TP53 tumor suppressor gene. The p53 signaling pathways are involved in the regulation of apoptosis, cell cycle arrest, senescence and DNA repair. The p53 mutations found in tumors are commonly distributed along the DNA binding domain, including the G245S mutation associated with LFS. However, the most frequent p53 mutation associated with LFS in Southeast and Southern Brazil is the R337H mutation, which affects the oligomerization domain of p53. Thus, the aim of this study is to analyze the effects of mutant p53 associated with LFS on cell viability at basal conditions and on cell survival in genotoxic stress. Null-p53 NCI-H1299 cell line were transfected with vectors for the expression of wild-type, G245S and R337H p53, and cell assays were performed. The R337H mutant inhibited the colony formation and decreased the cell viability similar to that observed in cells with wt p53 expression, while G245S demonstrated less influence on cell viability. After undergoing genotoxic stress induced by UVC radiation exposures, cells with R337H expression were more sensitive to cell death when exposed to low UVC dose. Cells with G245S expression showed an increase in late apoptosis rates only when subjected to high doses of UVC radiation, as well as cells with wt p53 expression. Thus, similar and functional activities were observed between R337H and wt p53 concerning influence on cell viability and proliferation, with the expression of G245S presented cellular phenotype closer to p53-null. However, G245S demonstrated to confer protection for cell death as seen for wt p53, whereas R337H generated increased of sensitivity to cell death under conditions of genotoxic stress.

Orientador: José Fernando Garcia / Banca: Johann Sölkner / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Paolo Ajmone Marsan / Banca: Celso Luis Marino / Resumo: O gene 1 do adenoma pleomórfico (PLAG1) apresenta evidência de seleção positiva recente e associação com tamanho corporal e fertilidade em um grande número de raças bovinas ao redor do mundo. Tendo em vista sua recentemente descoberta função como fator de transcrição para o gene do fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF2), o PLAG1 possui papel emergente como um dos principais reguladores do crescimento e da reprodução em bovinos. Apesar de sua importância, a variante de sequência de DNA responsável pelos efeitos pleiotrópicos atribuídos ao PLAG1 em bovinos permanece desconhecida. Também não está claro se a mesma mutação explica as associações fenótipo-genótipo encontradas em diferentes populações bovinas. Além disso, ainda é incerto onde e quando ocorreu a pressão de seleção responsável pelo aumento da frequência da mutação do PLAG1. No presente trabalho, reportamos o desenvolvimento de um pacote para o software estatístico R, o qual é direcionado à análise de haplótipos como preditores para variantes genéticas não observadas. Através da aplicação desta ferramenta a dados genômicos de bovinos oriundos de diversas regiões do mundo, encontramos evidência indicando que um único alelo derivado do PLAG1 aumentou em frequência rapidamente em bovinos Bos taurus do noroeste europeu entre os séculos XVI e XVIII. Este período é reconhecido como a última onda de aumento de estatura em bovinos por meio de registros arqueológicos. Os dados também sugerem que o alelo foi introgr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The pleomorphic adenoma gene 1 (PLAG1) presents both evidence of recent positive selection and association with body size and fertility in a wide range of worldwide cattle breeds. Considering its recently uncovered function as a transcription factor for the insulin-like growth factor 2 gene (IGF2), PLAG1 is emerging as a major regulator of bovine growth and reproduction. In spite of its importance, the causal DNA sequence variant underlying the pleiotropic effects of PLAG1 in cattle remains unknown. It is also unclear whether the same mutation accounts for the phenotype-genotype associations detected across different cattle populations. Furthermore, when and where the selective pressure responsible for increasing the frequency of the PLAG1 mutation occurred is still uncertain. Here, we report the development of a package for the R statistical software to analyze haplotypes as surrogates for unobserved genetic variants. By applying this tool to genomic data of worldwide cattle breeds, we found evidence that a single bovine PLAG1 derived allele increased rapidly in frequency in Northwestern European Bos taurus populations between the 16th and 18th centuries. This period is recognized as the last wave of increase in bovine stature from archaeological data. The data also suggested that the allele was introgressed into non-European B. taurus and Bos indicus breeds towards the 19th and 20th centuries, achieving an almost global distribution in the last century. Ancient DNA analyses... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eliana Aparecida Varanda / Banca: Elisângela de Paula Silveira Lacerda / Banca: Lusânia Maria Greggi Antunes / Resumo: Os ensaios de toxicologia genética são utilizados como base no desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que podem identificar rapidamente agentes que causam danos ao material genético. Agências regulatórias preconizam a utilização de ensaios que identificam danos genotóxicos, de forma que possam servir como triagem de processos que levam à carcinogênese. Na busca por novos fármacos, a química inorgânica medicinal representa um campo de grande promessa, com potencial de expansão devido a diversidade química e reatividade dos metais. Especialmente, os complexos de rutênio, têm recebido destaque no tratamento de doenças como o câncer e a tuberculose multi-droga resistente (TB-MDR). Neste contexto, este trabalho teve como objetivo, avaliar os efeitos toxicogenéticos e antitumorais de três complexos de rutênio(II), com promissora atividade anti-TB-MDR, denominados de SCAR 4, SCAR 5 e SCAR 6 e, diante da importância do conhecimento farmacocinético de novos fármacos, outro objetivo foi avaliar a permeabilidade in vitro desses complexos. A avaliação toxicogenética foi realizada por meio dos ensaios de mutação gênica reversa com Salmonella typhimurium (Teste de Ames) e pelo ensaio do micronúcleo citoma com bloqueio da citocinese (CBMN-cit) em ausência e em presença do sistema de metabolização. Ensaios de sobrevivência clonogênica foram utilizados para avaliar a viabilidade das células CHO-K1 e HepG2, utilizadas no ensaio do CBMN-cit. A avaliação da atividade antitumoral foi investigada por meio de ensaios de citotoxicidade frente às linhagens tumorais humanas Caco-2, DU-145, HeLa, HepG2 e MDA-MB-231, pela capacidade de inibição da topoisomerase I humana (Top IB) e por ensaios físico-químicos de interação com o calf thymus DNA (ct-DNA). A permeabilidade foi analisada por meio do ensaio in vitro de permeação em monocamadas de células Caco-2 na presença e ausência de albumina do soro... / Abstract: The genetic toxicology assays are used as the basis in the development of new drugs since it's may rapidly identify agents that cause damage to the genetic material. Regulatory agencies have recommend the use of assays that identify genotoxic effcts, thus they may serve as a screening processes that lead to carcinogenesis. In the search of new molecules for therapeutic purposes, medicinal inorganic chemistry is a major promise of the field, with potential expansion due to chemical diversity and reactivity of metals. Especially, ruthenium complexes, have been highlighted in the treatment of growing diseases such as cancer and multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB). In this context, this study aimed to evaluate the toxicogenetic effects of three ruthenium(II) complex, that showed promising anti-MDR-TB activity, called SCAR 4, SCAR 5 and SCAR 6. In addition to this safety profile, and cosidering the traditionally antitumor activity of ruthenium complexes, this study also aimed to evaluate the antitumor activity of these complexes. In front of the importance of pharmacokinetic knowledge of new drugs, another aim of this study was to evaluate the in vitro permeability of these complexes. The toxicogenetics evaluation was performed by reverse gene mutation assays with Salmonella typhimurium (Ames test) and by Cytokinesis-block micronucleus cytome assay (CBMN-cyt). In both assays, we used models to assess the effect of complexes's metabolization. The clonogenic survival assays were used to assess the viability of HepG2 and CHO-K1 cells, that it has been used in CBMN-cyt assay. The evaluation of the antitumor activity was investigated by means of cytotoxicity assays with the human tumor cell lines Caco-2, DU-145, HeLa, HepG2 and MDAMB-231, by the ability to inhibit human topoisomerase I (Top IB) and physico-chemical assays of interaction with the thymus calf DNA (ct-DNA). The permeability was examined by means of in vitro ... / Mestre

Orientador: Eliana Aparecida Varanda / Banca: Valéria Valente / Banca: Fernando Rogerio Pavan / Banca: Fábio Vieira dos Santos / Banca: Raquel Alves dos Santos / Resumo: Os extratos metanólicos dos capítulos de quatro espécies, pertencentes à família Eriocaulaceae, Syngonanthus dealbatus (Sd), S. macrolepsis (Sm), S. nitens (Sn) e S. suberosus (Ss), suas substâncias isoladas, 1 (luteolina), 2 (1,5,7-trihidroxi-3,6-dimetoxixantona), 3 (1,3,6,8-tetrahidroxi-2,5-dimetoxixantona), 4 (1,3,6,8-tetrahidroxi-5-metoxixantona), 5 (7-metoxiluteolina-8-c--glicopiranosídeo), 6 (7-metoxiluteolina-6-c--glicopiranosídeo), 7 (7,3'-dimetoxiluteolina-6-c--glicopiranosídeo), 8 (6-hidroxiluteolina) e a mistura M (A-1,3,6-trihidroxi-2-metoxixantona e B-1,3,6-triidroxi-2,5-dimetoxixantona) foram avaliados quanto ao seu potencial em causar mutações e também de prevenir o acontecimento dessas, através do teste de Ames e verificou-se que todos os extratos e suas substâncias isoladas não foram considerados mutagênicos sob as condições testadas, e que os mesmos apresentaram um efeito antimutagênico de forte a moderado contra a aflatoxina B1 (AFB1), o benzo[a]pireno (BaP), o 4-nitro-o-fenilenodiamino (NPD), a mitomicina C (MMC) e a azida sódica (AS); quanto ao potencial em causar danos no DNA e de prevenir e/ou reparar os danos causados por agentes genotóxicos por meio do ensaio Cometa, que identificou os extratos Sd, Sn e Ss e as flavonas 1 e 5 como causadores de dano significativo no DNA das células HepG2, após 4 horas de tratamento, dano esse que foi reparado pelas células, visto que nenhum efeito genotóxico foi observado após 24 horas. E ainda Sm, Sn e Ss e todas as isoladas, exceto 8, foram capazes de inibir os danos causados pelo agente genotóxico MMS no DNA; quanto ao seu potencial citotóxico frente às células cancerosas HepG2 e MCF-7/BUS, que identificou que todos os extratos, exceto Sm, e todas as substâncias isoladas foram capazes de induzir morte das células HepG2 significativamente, com a maioria das amostras alcançando... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The methanol extracts of capitula of four species belonging to the Eriocaulaceae family, Syngonanthus dealbatus (Sd), S. macrolepsis (Sm), S. nitens (Sn) and S. suberosus (Ss), its isolated compounds 1 (luteolin), 2 (1,5,7-trihydroxy-3,6-dimethoxyxanthone), 3 (1,3,6,8-tetrahydroxy-2,5-dimethoxyxanthone), 4 (1,3,6,8-tetrahydroxy-5-methoxyxanthone), 5 (7-methoxyluteolin-8-C--glucopyranoside), 6 (7-methoxyluteolin-6-C--glucopyranoside), 7 (7,3'-dimethoxyluteolin-6-C--glucopyranoside), 8 (6-hydroxyluteolin) and the mixture M (A-1,3,6-trihydroxy-2-methoxyxanthone and B-1,3,6-trihydroxy-2,5-dimethoxyxanthone) were evaluated for their potential to cause mutations and also to prevent the occurrence of them, using the Ames test, and it was found that all extracts and their isolated compounds were not considered mutagenic under the test conditions, and they also showed a strong to moderate antimutagenic effect against aflatoxin B1 (AFB1), benzo[a]pyrene (BaP), 4-nitro-o-phenilenodiamine (NPD), mitomycin C (MMC) and sodium azide (SA). They were also evaluated for the potential to cause DNA damage and to prevent and/or repair the damage caused by genotoxic agents, using the Comet assay, which identified the extracts Sd, Sn, Ss and the flavones 1 and 5 as causing significant DNA damage, after 4 hours of treatment. Such damage has been repaired by the cells, since no genotoxic effect was observed after 24 hours. Also Sm, Sn, Ss and all isolated compounds, except 8, were able to inhibit the damage caused by the genotoxic agent MMS. They were evaluated for their potential to cause cancer cells (HepG2 and MCF-7/BUS) death, and we found that all extracts, except Sm, and all the compounds were able to induce significant death of HepG2 cells, with most of the samples reaching 50% cell death. In MCF-7/BUS cells, after 24 hours of treatment, values were lower than 50% cell death... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-13Bitstream added on 2014-06-13T21:01:39Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_tcc_dr_rcla.pdf: 2200644 bytes, checksum: 409c85d73c03ec2d26288cc8ef322eaa (MD5) / O ramnolipídio é um biossurfactante da classe dos glicolipídios, produzido pela bactéria Pseudomonas aeruginosa. Estudos têm mostrado que, mesmo com um grande potencial de uso do ramnolipídio na indústria cosmética e na área da saúde, este composto é, principalmente, promissor para uso na indústria do petróleo. Apesar dos biossurfactantes serem considerados menos tóxicos e mais biodegradáveis que os surfactantes sintéticos, estes compostos ainda não foram investigados quanto a sua ação genotóxica direta ou indireta sob o material genético de organismos expostos. Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi investigar os possíveis danos celulares promovidos pela ação do biossurfactante ramnolipídio e suas implicações no material genético quando utilizado como agente biorremediador de águas impactadas por petróleo, por meio dos bioindicadores Allium cepa, Oreochromis niloticus e as células humanas mantidas em cultura - HepG2. Para a realização da investigação, o biossurfactante ramnolipídio foi produzido em condições de laboratório e a partir da concentração indicada para o uso em processos de biorremediação (1g/L), foram estabelecidas as concentrações utilizadas no estudo. Para avaliar o potencial tóxico, genotóxico e mutagênico das concentrações de ramnolipídio, assim como seu feito sinérgico com o petróleo, foram realizados os testes de germinação de sementes, aberrações cromossômicas e teste do micronúcleo em A. cepa; teste do micronúcleo em eritrócitos circulantes, ensaio do cometa com sangue periférico e células de brânquias e análise ultraestruturais de eritrócitos circulantes em O. niloticus; e teste do MTT, teste do micronúcleo e ensaio do cometa em células HepG2. Nossos resultados mostraram que as concentrações 1g/L e 2g/L de ramnolipídio são tóxicas para A. cepa. No entanto, quando as concentrações 1g/L e 10g/L... / Rhamnolipids belong to the glycolipid class of biosurfactants, which are produced by the bacterium Pseudomonas aeruginosa. Studies have shown that, even being potentially used in the cosmetics industry, this compound is especially promising in the petroleum industry. Although the biosurfactants are considered less toxic and more biodegradable than the synthetic surfactants, these compounds have not yet been investigated when it comes to their either direct or indirect genotoxic action upon the genetic material of exposed organisms. Thus, the purpose of this study was to investigate the possible cell damage promoted by the action of rhamnolipid biosurfactants and their implications for the genetic material when they are used as a bioremediation agent of petroleum-impacted water, by using Allium cepa, Orechromis niloticus and human cells kept in culture – HepG2. In order to carry out this investigation, the rhamnolipid biosurfactant was produced under laboratory conditions, and the recommended concentration for use in bioremediation processes (1g/L) was also used; the concentrations used in the study were established. To assess the toxic, genotoxic and mutagenic potential of rhamnolipid concentrations, as well as their synergy with petroleum, seed germination, chromosome aberration tests and micronucleus test in A. ceppa; micronucleus test in circulating red blood cells, comet assay in the peripheral blood and gill cells, and ultrastructural analysis of circulating blood cells in O. niloticus; and MTT test, micronucleus test and comet assay in HepG2 cells. Our studies showed that the 1 g/L and 2 g/L rhamnolipid concentrations are toxic to A. cepa. However, when 1 g/L and 10 g/L concentrations were used in the bioremediation process, these concentrations did not cause toxic, genotoxic or mutagenic damage besides the ones observed for the cells exposed to soluble petroleum... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Edson Luis Maistro / Banca: Maria Aparecida Marin Morales / Banca: Cláudia Aparecida Rainho / Resumo: Garcinia achachairu (GAC) é uma planta de origem boliviana que vem sendo utilizada na medicina popular para o tratamento de distúrbios gástricos, reumatismo, inflamações e como cicatrizante. A caracterização fitoquímica do extrato desta planta revelou que, uma benzofenona, a Gutiferona A (GA), é um dos seus compostos majoritários, que segundo estudos recentes, apresenta importante atividade antioxidante e antimicrobiana. Considerando o interesse em se aprofundar as análises do potencial farmacológico da GA e a inexistência de estudos que avaliem a sua toxicidade genética, o presente estudo foi elaborado visando investigar o potencial genotóxico e mutagênico da GA em diferentes células de camundongos in vivo, utilizando alguns dos testes tradicionais na área de mutagênese, como o Ensaio Cometa (EC) para a verificação da genotoxicidade e o Teste do Micronúcleo (TM) para a verificação da mutagenicidade. O experimento foi conduzido com camundongos Suíços albinos machos (Mus musculus) de 12 semanas, divididos em cinco grupos, constituídos cada um por seis animais. O grupo controle negativo recebeu, via gavagem, 0,3 mL de DMSO 1%. O grupo controle positivo, recebeu intraperitonealmente, 80 mg/kg de doxorrubicina. Os grupos tratados receberam, via gavagem, 0,3 mL da GA nas doses de 15, 30 e 60 mg/kg. Para a avaliação da genotoxicidade foi coletado sangue da veia caudal dos camundongos (4 e 24 horas após o tratamento), células do fígado, medula óssea, cérebro e testículos (coletadas 24 horas após o tratamento). Para a avaliação da mutagenicidade, foram coletadas células da medula óssea 24 horas após o tratamento. A citotoxicidade foi avaliada pela contagem de 200 eritrócitos policromáticos (PCE) e normocromáticos (NCE) e determinação de sua razão (PCE/NCE). Na amostra de sangue de 4h, analisadas pelo EC, os resultados obtidos mostraram que nas doses de 30 mg/kg e 60 mg/Kg. A análise ... / Abstract: Garcinia achachairu (GAC) is a native plant from Bolivia that has been used in folk medicine for the treatment of gastric disorders, rheumatism, inflammation and as a healing. The phytochemical characterization of this plant extract revealed that the benzophenone guttiferone A (GA) is one of its major compounds, which according to recent studies, has important antioxidant and antimicrobial activity. Considering the interest in deepening the analysis of the pharmacological potential of GA and the lack of studies assessing its genetic toxicity, the present study was designed in order to investigate the genotoxic and mutagenic effects of GA in different cells of mice in vivo, using some of the traditional tests in the mutagenesis area, the Comet Assay (CA) for genotoxicity evaluation and the Micronucleus Test (MT) for the mutagenicity assessment. The experiment was conducted in Swiss albino male mice (Mus musculus) with 12 weeks, divided into five groups with six animals each. The negative control group received, by oral gavage, 0.3 mL of 1% DMSO. The positive control group received, intraperitoneally, 80 mg/Kg of doxorubicin. The treated groups received 0.3 ml of GA at 15, 30 and 60 mg/kg, by gavage. For the genotoxicity evaluation, blood was collected from the tail vein of the mice (4 and 24 hours after treatment), and liver, bone marrow, brain and testicular cells were collected 24 hours after treatment. For the mutagenicity assessment, bone marrow cells were collected 24 hours after treatment. Cytotoxicity was assessed by scoring 200 consecutive polychromatic (PCE) and normochromatic (NCE) erythrocytes and their ratio (PCE/NCE) determined. For the 4 h blood sample, the results with GA at doses of 30 and 60 mg/kg showed that was a statistically significant increase in DNA damage in comparison to the negative control. For the 24 h blood sample, only 60 mg/kg dose showed significant genotoxicity. The analysis of ther ... / Mestre

Neisseria gonorrhoeae is a human-specific pathogen that causes gonorrhea. It is defined as a super bacterium by the WHO due to the emergence of gonococci that are resistant to a variety of antibiotics and a rapidly increasing infection incidence. Genome-wide investigation of neisserial gene essentiality and novel virulence factors is urgently required in order to identify new targets for anti-neisserial therapeutics. To identify essential genes and new virulence factors, a high-density mutant library in N. gonorrhoeae MS11 was generated by in vitro transposon mutagenesis. The transposon library harbors more than 100,000 individual mutants, a density that is unprecedented in gonococcal research. Essential genes in N. gonorrhoeae were determined by enumerating frequencies of transposon insertion sites (TIS) with Illumina deep sequencing (Tn-seq). Tn-seq indicated an average distance between adjacent TIS of 25 bp. Statistical analysis unequivocally demonstrated 781 genes that were significantly depleted in TIS and thus are essential for Neisseria survival. A subset of the genes was experimentally verified to comprise essential genes and thus support the outcome of the study. The hereby identified candidate essential genes thus may constitute excellent targets for the development of new antibiotics or vaccines. In a second study, the transposon mutant library was applied in a genome-scale “negative-selection strategy” to identify genes that are involved in low phosphate-dependent invasion (LPDI). LPDI is dependent on the Neisseria porin subtype PorBIA which acts as an epithelial cell invasin in absence of phosphate and is associated with severe pathogenicity in disseminated gonococcal infections (DGI). Tn-seq demonstrated 98 genes, which were involved in adherence to host cells and 43 genes involved in host cell invasion. E.g. the hypothetical protein NGFG_00506, an ABC transporter ATP-binding protein NGFG_01643, as well as NGFG_04218 encoding a homolog of mafI in N. gonorrhoeae FA1090 were experimentally verified as new invasive factors in LPDI. NGFG_01605, a predicted protease, was identified to be a common factor involved in PorBIA, Opa50 and Opa57-mediated neisserial engulfment by the epithelial cells. Thus, this first systematic Tn-seq application in N. gonorrhoeae identified a set of previously unknown N. gonorrhoeae invasive factors which demonstrate molecular mechanisms of DGI. / Neisseria gonorrhoeae ist ein human-spezifisches Pathogen, das die Krankheit Gonorrhoe verursacht. Aufgrund der steigenden Anzahl antibiotikaresistenter Gonokokken und der damit verbundenen, rapide zunehmenden Anzahl von Infektionen erklärte die WHO Gonokokken 2012 zum Superbakterium. Daher ist eine genomweite Untersuchung der neisseriellen Genessentiatialität und neuer Virulenzfaktoren dringend erforderlich, um neue Ziele für die antineisserielle Therapie zu identifizieren. Hierzu wurde eine high-density Mutantenbibliothek in N. gonorrhoeae MS11 durch in vitro Transposonmutagenese generiert. Die Transposonbibliothek enthält mehr als 100.000 individuelle Mutanten - eine Dichte, die in der Gonokokken-Forschung beispiellos ist. Essentielle Gene von N. gonorrhoeae wurden durch die Ermittlung der Häufigkeit von Transposon insertion sites (TIS) mit Hilfe von Illumina deep sequencing (Tn-seq) bestimmt. Tn-seq ergab eine durchschnittliche Distanz von 25 Basenpaaren zwischen benachbarten TIS. Die statistische Analyse zeigte eindeutig 781 Gene, die signifikant weniger TIS aufwiesen und deshalb als essentiell für das Überleben der Neisserien verstanden werden können. Für ausgewählte Gene wurde experimentell bestätigt, dass sie essentielle Gene beinhalten, wodurch das Ergebnis der Tn-seq unterstützt wird. Die hierbei identifizierten essentiellen Gene könnten exzellente Targets für die Entwicklung neuer Antibiotika oder Impfstoffe darstellen. In einer zweiten Studie wurde die Transposon Mutanten Bibliothek für eine genomweite „negative Selektionsstrategie“ bereitgestellt. Es sollten Gene identifiziert werden, die an der phosphatfreien Invasion (low phosphate-dependent invasion = LPDI) beteiligt sind. Die LPDI ist vom neisseriellen Porin Subtyp PorBIA abhängig, welches bei Epithelzellen in Abwesenheit von Phosphat als Invasin fungiert und mit einer schweren Pathogenität in disseminierenden Gonokokkeninfektionen (DGI) assoziiert ist. Tn-seq ergab 98 Gene, die an der Adhärenz an die Wirtszelle, und 43 Gene, die an der Wirtszellinvasion beteiligt waren. Zum Beispiel wurden das hypothetische Protein NGFG_00506, ein ABC Transporter, das ATP-bindende Protein NGFG_01643, wie auch NGFG_04218, das für ein Homolog von mafI in N. gonorrhoeae FA1090 kodiert, experimentell als neue Invasionsfaktoren in der LPDI verifiziert. NGFG_01605, bei dem angenommen wird, dass es sich um eine Protease handelt, wurde als ein allgemeiner Faktor identifiziert, der an der PorBIA-, Opa50- and Opa57-vermittelten Einstülpung der Membran von Epithelzellen beteiligt ist. Die erste systematische Anwendung von Tn-seq in N. gonorrhoeae identifizierte eine Reihe bisher unbekannter Invasionsfaktoren von N. gonorrhoeae, die molekulare Mechanismen der DGI zeigen.

Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Domänen des Lebens und erfüllen die verschiedensten zellulären Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivität unter anderem gegenüber Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert über die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, näher zu untersuchen. Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminosäuren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gestört. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Größenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich über die Struktur¬auflösung mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Aktivitätsmessungen der monomeren Mutante gegenüber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivität. Die Röntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enthüllte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifitätsschleife, die für die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und äußert sich in einer veränderten Stellung der Substratspezifitätsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ lässt eine allgemeine Gültigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifität über Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und könnte so neue Ansatzpunkte für möglicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivitätshemmungen liefern. / Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin