Mycoplasma hyopneumoniae é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, uma enfermidade de distribuição mundial responsável por consideráveis perdas econômicas. Em organismos procariotos, a organização das ORFs em UTs e os mecanismos de regulação da expressão gênica são bem caracterizados. No entanto, no gênero Mycoplasma existem poucas informações relacionadas a transcrição gênica. Em M. hyopneumoniae, mesmo com os dados de sequenciamento de três genomas completos, poucos são os estudos englobando transcrição, bem como organização das unidades transcricionais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar a distribuição e organização gênica em M. hyopneumoniae através da análise in silico e determinação experimental, pela técnica de RT-PCR, das unidades de transcrição. As análises in silico das UTs foram realizadas utilizando dois critérios: inicialmente, foi estabelecido como distância intergênica máxima, um tamanho de até 100 pb; posteriormente, foi utilizado o critério de genes organizados na mesma fita de DNA, independente das distâncias entre eles. Primers localizados entre a região 3´ de uma ORF e a região 5´ da ORF adjacente foram empregados, na técnica de RT-PCR, para demonstrar a co-transcrição de ORFs. As análises in silico determinaram a presença de 112 UTs, sendo que 21 destas UTs foram confirmadas experimentalmente. O tamanho e a composição das UTs são extremamente variáveis, assim como, as distâncias das regiões intergênicas entre as ORFs e os produtos codificados por elas. A partir dos resultados deste trabalho é possível sugerir que, em M. hyopneumoniae, a transcrição ocorre de forma contínua na mesma fita de DNA, formando assim, extensas UTs, as quais são interrompidas quando da presença de UTs ou ORFs individuais na orientação oposta. / Mycoplasma hyopneumoniae is the agent of enzootic pneumonia, a chronic respiratory disease present in the majority of swine herds throughout the world being considered an important pathogen in the swine industry. In prokaryotic organisms the ORFs arrangement in UTs and the gene expression regulation are well characterized. However, in the Mycoplasma genus there is little information related to gene transcription. Three complete genomes of M. hyopneumoniae were sequenced, but there are few studies encompassing transcription and organization of UTs. This work aims to characterize the distribution and gene organization in M. hyopneumoniae genome by in silico and experimental analyze of the UTs. The in silico analysis of the UTs were performed using two criteria: first, was established up to 100 bp as a maximum size of the intergenic distance and, later we used the criterion of genes arranged in the same DNA strand, regardless of the distances between them. To demonstrate the co-transcription of two ORFs the RT-PCR technic was used with primers located between the 3' region of an ORF and the 5' region of the adjacent ORF. The in silico analysis showed 112 UTs. Twenty-one UTs were experimentally confirmed by RT-PCR. The size and composition of the UTs are extremely variable, as well as the distances of the intergenic regions between the ORFs, and the products encoded by them. The findings of this study can suggest that in M. hyopneumoniae transcription occurs continuously in the same DNA strand, thus forming large UTs, which are disrupted in the presence of UTs or individual ORFs in the opposite orientation.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria pertencente à classe Mollicutes, sendo o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e o agente primário do complexo de doenças respiratórias de suínos (CDRS). A sinal-peptidase I (SPase I) é uma endopeptidase de membrana que cliva os peptídeos-sinal (PS) de proteínas transportadas pelo sistema geral de secreção. A SPase I do M. hyopneumoniae (MhSPase I) é codificada pela sequência de DNA codificadora (CDS) sipS, presente nas 3 linhagens da espécie com genomas já sequenciados. Este trabalho tem como objetivo caracterizar funcional e imunologicamente a MhSPase I, assim como investigar a sua relação com a virulência da bactéria. Foi demonstrado que sipS é parte de um operon, sendo cotranscrita com outras 4 CDSs. A CDS sipS foi clonada e a MhSPase I recombinante (rMhSPase I) foi expressa em Escherichia coli. A rMhSPase I mostrou-se altamente imunogênica para camundongos e seu caráter antigênico foi confirmado para suínos. A MhSPase I apresentou expressão diferencial em linhagens patogênicas e não patogênicas de M. hyopneumoniae corroborando a ideia de que essa enzima é um fator de virulência da bactéria. Análises de sequências de aminoácidos evidenciaram que a MhSPase I tem baixa identidade com enzimas ortólogas de outras espécies de micoplasmas e de bactérias relacionadas ao CDRS. O potencial sorodiagnóstico da rMhSPase I foi demonstrado em um ELISA. Predições in silico de possíveis PSs clivados pela MhSPase I indicaram que proteínas hipotéticas e proteínas de membrana, incluindo adesinas, seriam substratos da enzima. Ensaios de atividade in vitro com PSs sintéticos derivados de predições in silico, contudo, não foram conclusivos. Estudos futuros deverão elucidar o papel da SPase I na exportação de proteínas em M. hyopneumoniae e explorar o potencial da enzima como antígeno vacinal ou diagnóstico. / Mycoplasma hyopneumoniae is a bacterium that belongs to the Mollicutes class, being the etiological agent of porcine enzootic pneumoniae and one of the primary agents of the porcine respiratory disease complex (PRDC). Signal peptidase I (SPase I) is a membrane-bound endopeptidase that cleaves the signal peptide (SP) of proteins exported by the general secretory pathway. The M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I) is coded by the sipS gene in all of the three M. hyopneumoniae genomes sequenced. The aims of this work are to functional and immunologically characterize the MhSPase I and to investigate its relation with the virulence of the bacterium. The sipS coding DNA sequence (CDS) was demonstrated to be part of an operon, being co-transcribed along with 4 other CDSs. The sipS CDS was cloned and the recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was expressed in Escherichia coli. The rMhSPase I was highly immunogenic for mice and the antigenicity for pigs was demonstrated. The observed differential expression of MhSPase I between pathogenic strains and one non pathogenic strain of M. hyopneumoniae corroborates the notion of MhSPase I as a virulence factor. Amino acid sequence analyses of MhSPase I and SPases I from other Mycoplasma and PRDC bacteria evidenced low conservation between these enzymes. The potential serodiagnosis application of rMhSPase I was demonstrated by an ELISA. In silico predictions of putative SPs cleaved by MhSPase I were performed, indicating that hypothetical and membrane proteins, including adhesins, have cleavable SPs. In vitro cleavage assays of rMhSPase I were developed with synthetic SPs, but the results were not conclusive. Further studies should elucidate the role of SPase I in the exportation of proteins in M. hyopneumoniae and the putative application of MhSPase I as an antigen for vaccination and diagnosis.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia micoplásmica suína (PMS) e tem sido descrita em diversos países como um dos patógenos mais comumente envolvidos em problemas respiratórios dos suínos, causando importantes perdas econômicas. Os métodos de uso corrente para a identificação de M. hyopneumoniae, sejam eles baseados em técnicas imunológicas, no cultivo e isolamento do agente etiológico ou em métodos moleculares, apresentam diversas limitações. Além disso, as vacinas para PMS oferecem apenas proteção parcial. A identificação e a caracterização imunológica e funcional de proteínas da bactéria, especialmente aquelas preferencial ou exclusivamente expressas em cepas patogênicas, pode trazer avanços importantes no conhecimento da biologia da bactéria e da interação entre patógeno e hospedeiro. Podem também, trazer melhorias para o imunodiagnóstico da PMS, em termos de aumento da especificidade e da sensibilidade dos testes utilizados, e melhorias no aspecto imunoprotetor das vacinas atualmente disponíveis. Com a disponibilização das seqüências do genoma das cepas 232, J e 7448 de M. hyopneumoniae foi possível à realização de uma análise comparativa das seqüências entre a linhagem não-patogênica (J) e os isolados patogênicos (232 e 7448), visando à identificação de genes que codificam proteínas determinantes de patogenicidade e/ou com potencial para utilização em imunodiagnóstico e/ou vacinação. Foram identificadas 118 seqüências codificadores de proteínas (CDSs), entre elas, estão, por exemplo, componentes de membrana com variações evidentes entre as linhagens e prováveis fatores de virulência. Nesta análise, foi também feita a identificação preliminar de 22 repetições nucleotídicas variáveis em tandem (VNTRs) em 12 CDSs correspondentes a lipoproteínas, antígenos, adesinas e outros fatores de virulência das cepas J, 7448 e 232. A análise destas VNTRs no genoma de M. hyopneumoniae foi estendida de modo a incluir duas outras cepas de M. hyopneumoniae (7422 e PMS). O grau de variabilidade entre cepas, o possível significado biológico destas variações e seu potencial para ser utilizado como base em um ensaio de PCR foram investigados. As VNTRs identificadas codificam para proteínas com variações no número de repetições de aminoácidos (VNTARs) que podem determinar variações estruturais, físico-químicas e antigênicas nas proteínas correspondentes, previstas in silico. Um PCR baseado nestas VNTRs foi proposto para identificação de cepas de M. hyopneumoniae a campo. Além disso, como parte de uma estratégia para a produção de reagentes imunodiagnósticos da PMS, clones das CDS p36 e NrdF de M. hyopneumoniae foram expressos e suas proteínas recombinantes purificadas. Dentre os dois soros policlonais monoespecíficos produzidos em coelhos, o soro anti-p36 apresentou uma menor reação inespecífica em ensaios de imuno-histoquímica do que o soro controle utilizado. As proteínas recombinantes purificadas, os anti-soros produzidos, juntamente com novos antígenos, dentre os possíveis identificados neste trabalho, além do VNTR-PCR proposto, poderão ser de valia para o monitoramento sanitário de rebanhos suínos quanto à presença assintomática de M. hyopneumoniae e a identificação mais precisa deste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of mycoplasmal pneumonia of swines (MPS) and it is one of the most commonly found pathogens in respiratory tract of swines worldwide, causing important economic losses. The diagnostic methods currently available for M. hyopneumoniae identification are based on immunological techniques, culture and isolation of the etiologic agent or molecular methods, all of them presenting peculiar limitations. Regarding control methods, the vaccines currently available for MPS offer only partial protection. The identification and the immunological and functional characterization of mycoplasmal proteins, especially those preferentially expressed in pathogenic strains, can help in the understanding of this bacterium’s biology as well as its host-pathogen interaction. Another important outcome of such studies would be increasing the specificity and sensitivity of the immunodiagnostic tests for MPS and improvements in the immune protection of currently available vaccines. The availability of the complete genome sequences of M. hyopneumoniae strains 232, J and 7448 became feasible a comparative analysis between the non-pathogenic strain (J) and the pathogenic ones (232 and 7448), focusing at the identification of gene products related to pathogenicity and/or presenting a potential for use in immunodiagnostic and/or vaccination. In this work we report the identification of 118 CDSs encoding putative virulence factors, which were based on specific criteria including predicted cell surface location, variations between strains, previous functional studies showing antigenicity or possible involvement in host-pathogen interaction. Using this analysis it was possible to identify 22 variable number of tandem nucleotides repeats (VNTRs) in 12 CDSs corresponding to lipoproteins, antigens, adhesins and other virulence factors of strains J, 7448 and 232. The analysis of these VNTRs from M. hyopneumoniae genome was further extended, including two others M. hyopneumoniae strains (7422 and PMS). The degree of variability between strains, the possible biological meaning of these variations and their potential to be used as VNTR-based PCR had been investigated. The identified VNTRs codes for proteins with variations in the number of amino acid repeats (VNTARs) that determine structural, physicochemical and antigenic variations in the corresponding proteins, as predicted in silico. As part of a strategy for the production of immunodiagnostic reagents for MPS, recombinant clones of p36 and NrdF CDSs were expressed, the correspondent proteins purified and polyclonal sera were produced in rabbits. The anti-p36 protein sera presented a low background in an immunohistochemistry assay when compared to the control sera. In conclusion, taken together the recombinant proteins and anti-sera that were produced, the new putative antigens that were identified and the development of a VNTR-PCR, could be of value for the sanitary monitoring of swine herds, specialy for the identification of asymptomatic carriers of M. hyopneumoniae and in the establishment of more efficient, specific and sensitive MPS diagnostic methods.

Genomas reduzidos de bactérias apresentam-se como complexos sistemas evolutivos, evidenciando diferentes propriedades genômicas de acordo com o nicho ocupado por cada organismo. Em bactérias simbiontes, genomas reduzidos apresentam uma grande estabilidade em relação a rearranjos e taxas mutacionais em comparação com genomas reduzidos de bactérias parasitas. Dentre as espécies parasitas com genoma reduzido, Mycoplasma hyopneumoniae distingue-se por apresentar, em diferentes cepas, genomas com características específicas dentro da classe Mollicutes, incluindo maior taxa mutacional, e freqüência de rearranjos. Através do desenvolvimento de um método quantitativo para avaliar a preferência de disposição preferencial de genes nas fitas senso e anti-senso de genomas de procariotos, foi possível avaliar comparativamente a estrutura genômica de espécies bacterianas em 8 filos de procariotos. Os resultados dessa análise indicam que dentre os genomas analisados as espécies de Mollicutes do grupo hominis são as que possuem a maior desorganização estrutural em relação à colocação preferencial de genes nas fita senso e anti-senso, enquanto que as espécies do grupo pneumoniae apresentam valores intermediários, o que se correlaciona com a maior sintenia observada entre genomas nesse grupo. Uma análise em grande escala de mutações sinônimas e não-sinônimas em 7 grupos de genomas reduzidos indica a ocorrência de evolução positiva em uma série de genes possivelmente relacionados a patogenicidade. Com base em dados comparativos de rearranjos, presença de recombinação, transferência horizontal e elevadas taxas de mutações sinônimas sobre não-sinônimas, um novo modelo de evolução de genomas reduzidos de parasitas foi proposto. No modelo, sugere-se que, ao contrário dos genomas de bactérias simbiontes, a redução genômica em bactérias parasitas caracteriza-se por um processo altamente turbulento, no qual a constante geração de variabilidade é um ponto crítico para o sucesso da estratégia de colonização do hospedeiro. / Reduced genomes present an interesting evolutionary system, showing different genomic properties accordingly their lifestyle as parasites or symbionts. In symbiont bacteria, reduced genomes present a great stability regarding rearrangements and mutational rates comparing with reduced genomes from parasite bacteria. Among these species, the Mycoplasma hyopneumoniae genome distinguish itself by presenting specific characteristics inside the Mollicutes class, including higher mutational and rearrangements rates. Through the development of a quantitative method of gene strand bias, was possible a comparative analysis of 8 bacterial phyla. The results of such analysis indicated that genomes of Mollicutes bacteria from the hominis group possess the most disordered genomes regarding gene position on the leading or lagging chromosome strand, while genomes from bacteria of the pneumoniae group have intermediary values, in agreement with the higher sinteny between the genomes in this group. A large-scale analysis of synonymous and non synonymous mutations in 7 groups of reduced genome bacteria determined positive evolution in several genes related to pathogenicity. Based in comparative data from rearrangements, recombination, horizontal transfer and high synonymous over non-synonymous mutational rates, a new model of evolution for parasite species with reduced genomes is proposed. In this model is suggested that, in opposition with symbionts bacteria, genome reduction of parasite prokaryotes is characterized by a high turbulent process, where the constant variability generation is a critical point for the success of the host colonization.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, uma enfermidade de distribuição mundial responsável por consideráveis perdas econômicas. Em organismos procariotos, a organização das ORFs em UTs e os mecanismos de regulação da expressão gênica são bem caracterizados. No entanto, no gênero Mycoplasma existem poucas informações relacionadas a transcrição gênica. Em M. hyopneumoniae, mesmo com os dados de sequenciamento de três genomas completos, poucos são os estudos englobando transcrição, bem como organização das unidades transcricionais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar a distribuição e organização gênica em M. hyopneumoniae através da análise in silico e determinação experimental, pela técnica de RT-PCR, das unidades de transcrição. As análises in silico das UTs foram realizadas utilizando dois critérios: inicialmente, foi estabelecido como distância intergênica máxima, um tamanho de até 100 pb; posteriormente, foi utilizado o critério de genes organizados na mesma fita de DNA, independente das distâncias entre eles. Primers localizados entre a região 3´ de uma ORF e a região 5´ da ORF adjacente foram empregados, na técnica de RT-PCR, para demonstrar a co-transcrição de ORFs. As análises in silico determinaram a presença de 112 UTs, sendo que 21 destas UTs foram confirmadas experimentalmente. O tamanho e a composição das UTs são extremamente variáveis, assim como, as distâncias das regiões intergênicas entre as ORFs e os produtos codificados por elas. A partir dos resultados deste trabalho é possível sugerir que, em M. hyopneumoniae, a transcrição ocorre de forma contínua na mesma fita de DNA, formando assim, extensas UTs, as quais são interrompidas quando da presença de UTs ou ORFs individuais na orientação oposta. / Mycoplasma hyopneumoniae is the agent of enzootic pneumonia, a chronic respiratory disease present in the majority of swine herds throughout the world being considered an important pathogen in the swine industry. In prokaryotic organisms the ORFs arrangement in UTs and the gene expression regulation are well characterized. However, in the Mycoplasma genus there is little information related to gene transcription. Three complete genomes of M. hyopneumoniae were sequenced, but there are few studies encompassing transcription and organization of UTs. This work aims to characterize the distribution and gene organization in M. hyopneumoniae genome by in silico and experimental analyze of the UTs. The in silico analysis of the UTs were performed using two criteria: first, was established up to 100 bp as a maximum size of the intergenic distance and, later we used the criterion of genes arranged in the same DNA strand, regardless of the distances between them. To demonstrate the co-transcription of two ORFs the RT-PCR technic was used with primers located between the 3' region of an ORF and the 5' region of the adjacent ORF. The in silico analysis showed 112 UTs. Twenty-one UTs were experimentally confirmed by RT-PCR. The size and composition of the UTs are extremely variable, as well as the distances of the intergenic regions between the ORFs, and the products encoded by them. The findings of this study can suggest that in M. hyopneumoniae transcription occurs continuously in the same DNA strand, thus forming large UTs, which are disrupted in the presence of UTs or individual ORFs in the opposite orientation.

Genomas reduzidos de bactérias apresentam-se como complexos sistemas evolutivos, evidenciando diferentes propriedades genômicas de acordo com o nicho ocupado por cada organismo. Em bactérias simbiontes, genomas reduzidos apresentam uma grande estabilidade em relação a rearranjos e taxas mutacionais em comparação com genomas reduzidos de bactérias parasitas. Dentre as espécies parasitas com genoma reduzido, Mycoplasma hyopneumoniae distingue-se por apresentar, em diferentes cepas, genomas com características específicas dentro da classe Mollicutes, incluindo maior taxa mutacional, e freqüência de rearranjos. Através do desenvolvimento de um método quantitativo para avaliar a preferência de disposição preferencial de genes nas fitas senso e anti-senso de genomas de procariotos, foi possível avaliar comparativamente a estrutura genômica de espécies bacterianas em 8 filos de procariotos. Os resultados dessa análise indicam que dentre os genomas analisados as espécies de Mollicutes do grupo hominis são as que possuem a maior desorganização estrutural em relação à colocação preferencial de genes nas fita senso e anti-senso, enquanto que as espécies do grupo pneumoniae apresentam valores intermediários, o que se correlaciona com a maior sintenia observada entre genomas nesse grupo. Uma análise em grande escala de mutações sinônimas e não-sinônimas em 7 grupos de genomas reduzidos indica a ocorrência de evolução positiva em uma série de genes possivelmente relacionados a patogenicidade. Com base em dados comparativos de rearranjos, presença de recombinação, transferência horizontal e elevadas taxas de mutações sinônimas sobre não-sinônimas, um novo modelo de evolução de genomas reduzidos de parasitas foi proposto. No modelo, sugere-se que, ao contrário dos genomas de bactérias simbiontes, a redução genômica em bactérias parasitas caracteriza-se por um processo altamente turbulento, no qual a constante geração de variabilidade é um ponto crítico para o sucesso da estratégia de colonização do hospedeiro. / Reduced genomes present an interesting evolutionary system, showing different genomic properties accordingly their lifestyle as parasites or symbionts. In symbiont bacteria, reduced genomes present a great stability regarding rearrangements and mutational rates comparing with reduced genomes from parasite bacteria. Among these species, the Mycoplasma hyopneumoniae genome distinguish itself by presenting specific characteristics inside the Mollicutes class, including higher mutational and rearrangements rates. Through the development of a quantitative method of gene strand bias, was possible a comparative analysis of 8 bacterial phyla. The results of such analysis indicated that genomes of Mollicutes bacteria from the hominis group possess the most disordered genomes regarding gene position on the leading or lagging chromosome strand, while genomes from bacteria of the pneumoniae group have intermediary values, in agreement with the higher sinteny between the genomes in this group. A large-scale analysis of synonymous and non synonymous mutations in 7 groups of reduced genome bacteria determined positive evolution in several genes related to pathogenicity. Based in comparative data from rearrangements, recombination, horizontal transfer and high synonymous over non-synonymous mutational rates, a new model of evolution for parasite species with reduced genomes is proposed. In this model is suggested that, in opposition with symbionts bacteria, genome reduction of parasite prokaryotes is characterized by a high turbulent process, where the constant variability generation is a critical point for the success of the host colonization.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia micoplásmica suína (PMS) e tem sido descrita em diversos países como um dos patógenos mais comumente envolvidos em problemas respiratórios dos suínos, causando importantes perdas econômicas. Os métodos de uso corrente para a identificação de M. hyopneumoniae, sejam eles baseados em técnicas imunológicas, no cultivo e isolamento do agente etiológico ou em métodos moleculares, apresentam diversas limitações. Além disso, as vacinas para PMS oferecem apenas proteção parcial. A identificação e a caracterização imunológica e funcional de proteínas da bactéria, especialmente aquelas preferencial ou exclusivamente expressas em cepas patogênicas, pode trazer avanços importantes no conhecimento da biologia da bactéria e da interação entre patógeno e hospedeiro. Podem também, trazer melhorias para o imunodiagnóstico da PMS, em termos de aumento da especificidade e da sensibilidade dos testes utilizados, e melhorias no aspecto imunoprotetor das vacinas atualmente disponíveis. Com a disponibilização das seqüências do genoma das cepas 232, J e 7448 de M. hyopneumoniae foi possível à realização de uma análise comparativa das seqüências entre a linhagem não-patogênica (J) e os isolados patogênicos (232 e 7448), visando à identificação de genes que codificam proteínas determinantes de patogenicidade e/ou com potencial para utilização em imunodiagnóstico e/ou vacinação. Foram identificadas 118 seqüências codificadores de proteínas (CDSs), entre elas, estão, por exemplo, componentes de membrana com variações evidentes entre as linhagens e prováveis fatores de virulência. Nesta análise, foi também feita a identificação preliminar de 22 repetições nucleotídicas variáveis em tandem (VNTRs) em 12 CDSs correspondentes a lipoproteínas, antígenos, adesinas e outros fatores de virulência das cepas J, 7448 e 232. A análise destas VNTRs no genoma de M. hyopneumoniae foi estendida de modo a incluir duas outras cepas de M. hyopneumoniae (7422 e PMS). O grau de variabilidade entre cepas, o possível significado biológico destas variações e seu potencial para ser utilizado como base em um ensaio de PCR foram investigados. As VNTRs identificadas codificam para proteínas com variações no número de repetições de aminoácidos (VNTARs) que podem determinar variações estruturais, físico-químicas e antigênicas nas proteínas correspondentes, previstas in silico. Um PCR baseado nestas VNTRs foi proposto para identificação de cepas de M. hyopneumoniae a campo. Além disso, como parte de uma estratégia para a produção de reagentes imunodiagnósticos da PMS, clones das CDS p36 e NrdF de M. hyopneumoniae foram expressos e suas proteínas recombinantes purificadas. Dentre os dois soros policlonais monoespecíficos produzidos em coelhos, o soro anti-p36 apresentou uma menor reação inespecífica em ensaios de imuno-histoquímica do que o soro controle utilizado. As proteínas recombinantes purificadas, os anti-soros produzidos, juntamente com novos antígenos, dentre os possíveis identificados neste trabalho, além do VNTR-PCR proposto, poderão ser de valia para o monitoramento sanitário de rebanhos suínos quanto à presença assintomática de M. hyopneumoniae e a identificação mais precisa deste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of mycoplasmal pneumonia of swines (MPS) and it is one of the most commonly found pathogens in respiratory tract of swines worldwide, causing important economic losses. The diagnostic methods currently available for M. hyopneumoniae identification are based on immunological techniques, culture and isolation of the etiologic agent or molecular methods, all of them presenting peculiar limitations. Regarding control methods, the vaccines currently available for MPS offer only partial protection. The identification and the immunological and functional characterization of mycoplasmal proteins, especially those preferentially expressed in pathogenic strains, can help in the understanding of this bacterium’s biology as well as its host-pathogen interaction. Another important outcome of such studies would be increasing the specificity and sensitivity of the immunodiagnostic tests for MPS and improvements in the immune protection of currently available vaccines. The availability of the complete genome sequences of M. hyopneumoniae strains 232, J and 7448 became feasible a comparative analysis between the non-pathogenic strain (J) and the pathogenic ones (232 and 7448), focusing at the identification of gene products related to pathogenicity and/or presenting a potential for use in immunodiagnostic and/or vaccination. In this work we report the identification of 118 CDSs encoding putative virulence factors, which were based on specific criteria including predicted cell surface location, variations between strains, previous functional studies showing antigenicity or possible involvement in host-pathogen interaction. Using this analysis it was possible to identify 22 variable number of tandem nucleotides repeats (VNTRs) in 12 CDSs corresponding to lipoproteins, antigens, adhesins and other virulence factors of strains J, 7448 and 232. The analysis of these VNTRs from M. hyopneumoniae genome was further extended, including two others M. hyopneumoniae strains (7422 and PMS). The degree of variability between strains, the possible biological meaning of these variations and their potential to be used as VNTR-based PCR had been investigated. The identified VNTRs codes for proteins with variations in the number of amino acid repeats (VNTARs) that determine structural, physicochemical and antigenic variations in the corresponding proteins, as predicted in silico. As part of a strategy for the production of immunodiagnostic reagents for MPS, recombinant clones of p36 and NrdF CDSs were expressed, the correspondent proteins purified and polyclonal sera were produced in rabbits. The anti-p36 protein sera presented a low background in an immunohistochemistry assay when compared to the control sera. In conclusion, taken together the recombinant proteins and anti-sera that were produced, the new putative antigens that were identified and the development of a VNTR-PCR, could be of value for the sanitary monitoring of swine herds, specialy for the identification of asymptomatic carriers of M. hyopneumoniae and in the establishment of more efficient, specific and sensitive MPS diagnostic methods.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, uma enfermidade de distribuição mundial responsável por consideráveis perdas econômicas. Em organismos procariotos, a organização das ORFs em UTs e os mecanismos de regulação da expressão gênica são bem caracterizados. No entanto, no gênero Mycoplasma existem poucas informações relacionadas a transcrição gênica. Em M. hyopneumoniae, mesmo com os dados de sequenciamento de três genomas completos, poucos são os estudos englobando transcrição, bem como organização das unidades transcricionais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar a distribuição e organização gênica em M. hyopneumoniae através da análise in silico e determinação experimental, pela técnica de RT-PCR, das unidades de transcrição. As análises in silico das UTs foram realizadas utilizando dois critérios: inicialmente, foi estabelecido como distância intergênica máxima, um tamanho de até 100 pb; posteriormente, foi utilizado o critério de genes organizados na mesma fita de DNA, independente das distâncias entre eles. Primers localizados entre a região 3´ de uma ORF e a região 5´ da ORF adjacente foram empregados, na técnica de RT-PCR, para demonstrar a co-transcrição de ORFs. As análises in silico determinaram a presença de 112 UTs, sendo que 21 destas UTs foram confirmadas experimentalmente. O tamanho e a composição das UTs são extremamente variáveis, assim como, as distâncias das regiões intergênicas entre as ORFs e os produtos codificados por elas. A partir dos resultados deste trabalho é possível sugerir que, em M. hyopneumoniae, a transcrição ocorre de forma contínua na mesma fita de DNA, formando assim, extensas UTs, as quais são interrompidas quando da presença de UTs ou ORFs individuais na orientação oposta. / Mycoplasma hyopneumoniae is the agent of enzootic pneumonia, a chronic respiratory disease present in the majority of swine herds throughout the world being considered an important pathogen in the swine industry. In prokaryotic organisms the ORFs arrangement in UTs and the gene expression regulation are well characterized. However, in the Mycoplasma genus there is little information related to gene transcription. Three complete genomes of M. hyopneumoniae were sequenced, but there are few studies encompassing transcription and organization of UTs. This work aims to characterize the distribution and gene organization in M. hyopneumoniae genome by in silico and experimental analyze of the UTs. The in silico analysis of the UTs were performed using two criteria: first, was established up to 100 bp as a maximum size of the intergenic distance and, later we used the criterion of genes arranged in the same DNA strand, regardless of the distances between them. To demonstrate the co-transcription of two ORFs the RT-PCR technic was used with primers located between the 3' region of an ORF and the 5' region of the adjacent ORF. The in silico analysis showed 112 UTs. Twenty-one UTs were experimentally confirmed by RT-PCR. The size and composition of the UTs are extremely variable, as well as the distances of the intergenic regions between the ORFs, and the products encoded by them. The findings of this study can suggest that in M. hyopneumoniae transcription occurs continuously in the same DNA strand, thus forming large UTs, which are disrupted in the presence of UTs or individual ORFs in the opposite orientation.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES), uma doença crônica, caracterizada pela alta morbidade e baixa mortalidade, e que infecta 200 milhões de suínos anualmente, gerando milhões de dólares de perdas em todo o mundo. M. hyopneumoniae adere-se aos cílios das células do epitélio traqueal, causando a redução do movimento ciliar, predispondo o animal a patógenos secundários. É uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido, sem parede celular e com alto conteúdo de guanina+citosina. Atualmente, estão disponíveis as sequências dos genomas de três linhagens de M. hyopneumoniae, duas patogênicas (7448 e 232) e uma não patogênica (J), porém pouco se sabe a respeito das sequências que regulam e controlam a expressão gênica em espécies de Mycoplasma ou das proteínas que ligam ao DNA, que desempenham um papel fundamental em todos os aspectos genéticos do organismo, como transcrição, replicação e reparo. Tipicamente, 2-3% de um genoma procariótico e 6-7% de um eucariótico codificam proteínas que ligam ao DNA. A interação mais comum entre proteína e DNA ocorre entre uma alfa-hélice da proteína com a cavidade maior do DNA, sendo que aproximadamente 84% dos fatores de transcrição de um componente utilizam o motivo hélice-volta-hélice para a ligação ao DNA Sendo assim, a hélice-volta-hélice assume um papel central na regulação da trancrição e, portanto, torna-se um excelente alvo para análises in silico. Não há relatos de trabalhos de identificação de proteínas que ligam ao DNA de M. hyopneumoniae utilizando métodos experimentais e predições in silico. Neste trabalho foi empregado um método de cromatografia de afinidade DNA-celulose para obter amostras enriquecidas com proteínas de superfície, onde foram identificas 32 proteínas, sendo que muitas delas são conhecidas e estão realmente envolvidas em processos que requerem a ligação ao DNA. Além da análise experimental, uma análise utilizando o genoma de M. hyopneumoniae 7448 foi realizada, utilizando vários algoritmos designados a encontrar genes que codificam proteínas que ligam ao DNA, sendo que 59 proteínas foram preditas como ligantes a DNA. Da sobreposição dos dados obtidos in silico e experimentalmente foram identificadas sete proteínas, sendo duas hipotéticas. A identificação destas proteínas disponibiliza um grupo de proteínas-alvo para futuros estudos de regulação e controle da expressão gênica de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of Enzootic Pneumonia (EP), a chronical disease, characterized by high morbidity and low mortality that infects 200 million pigs every year causing hundreds of millions of dollars of loss for swine farmers worldwide. M. hyopneumoniae attaches to the cilia of the tracheal epithelial cells, causing a reduction in the ciliary action, predisposing the swine to secondary pathogens. M. hyopneumoniae is one of the smallest bacteria present in nature with a small genome, no cell wall and high guanine/cytosine content. Published genome sequences of three M. hyopneumoniae strains, two pathogenic (232 and 7448) and one nonpathogenic (J) are available, but little is understood about the sequences that regulates and control gene expression in Mycoplasma species and its DNA-binding proteins (DBPs), that plays a central role in all aspects of genetic activity within an organism, such transcription, replication and repair. Typically 2-3% of a prokaryotic genome and 6-7% of a eukaryotic genome encodes genes that codify DBPs proteins. The common protein-DNA interaction region in bacteria occurs between an alpha-helix present in the protein and the major groove of DNA. Among the bacterial one-component transcription factors (TFs), up to 84% of the output domains comprise a DNA-binding helix–turn–helix (HTH) region. Therefore, the HTH motif assumes a central role in the transcription regulation and becomes a main target to in silico predictions. There have been no reports of the in silico and experimental identification of DBPs in M. hyopneumoniae. In this work we employed a method of DNA-cellulose column chromatography to obtain a DBPs enriched sample, for later mass espectrometry analysis, were we identify 32 proteins, many of which are involved in biological processes that require DNA binding. In addition to the proteomic approach, genomic analysis of the M. hyopneumoniae 7448 genome was performed in silico with several algorithms designed to identify genes that encoded DBPs and we have characterized 59 proteins predict as DBPs. The overlap analyzes between bioinformatics and proteomics has resulted in the identification of seven proteins, two of which are hypothetical proteins. The identification of these proteins has provided a valuable set of proteins that may be used in the studies to analyze the regulation and control of the gene expression in M. hyopneumoniae.

A caracterização do repertório de proteínas expostas na superfície celular do Mycoplasma hyopneumoniae, agente etiológico da pneumonia enzootica suína (PES), é essencial para o entendimento dos processos fisiológicos associados a capacidade de infecção bacteriana, sobrevivência no hospedeiro e patogênese. Análises in silico indicam que aproximadamente um terço dos genes bacterianos codificam proteínas de superfície. Entretanto, até momento poucas proteínas de M. hyopneumoniae tiveram sua expressão e localização na superfície celular confirmadas experimentalmente, fazendo-se necessária a prospecção experimental destas proteínas utilizando ferramentas de proteômica, aumentando assim a confiabilidade dos dados obtidos in silico. Neste contexto, nós desenvolvemos uma abordagem experimental baseada na marcação in vivo da superfície celular com biotina seguida pela identificação por espectrometria de massas, associada à predições in silico, que nos possibilitou a identificação de proteínas expostas na superfície do M. hyopneumoniae. Como resultado, obtivemos 167 identificações proteicas, correspondendo a 59 proteínas não reduntantes, na abordagem proteômica experimental. A análise in silico resultou na identificação de 292 proteínas transmembrana e de 25 lipoproteínas. A análise comparativa revelou que 39 proteínas (66%) identificadas experimentalmente por espectrometria de massas como expostas na superfície celular, também foram preditas in silico com tal, sendo representadas principalmente por proteínas relacionadas com adesão, lipoproteínas e proteínas hipotéticas. As outras 20 proteínas (34%) correspondem principalmente a proteínas tradicionalmente relacionadas ao metabolismo, porém com várias delas previamente descritas atuando na superfície celular, participando de processos como interação patógeno-hospedeiro. Os resultados obtidos nesta tese fornecem uma visão geral da composição proteíca da superfície celular do M. hyopneumoniae, permitindo a seleção de alvos para futuros estudos funcionais visando melhorar o entendimento dos processos de patogenicidade bacteriana, além do desenvolvimento de drogas, vacinas e testes diagnósticos mais eficientes. / The characterization of the repertoire of proteins exposed on the cell surface by Mycoplasma hyopneumoniae, the etiological agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs, is critical to understanding physiological processes associated with bacterial infection capacity, survival and pathogenesis. It is predicted that about a third of the genes in the M. hyopneumoniae genome code for surface proteins, but so far, just a few of them have experimental confirmation of their expression and surface localization. An experimental proteomic survey of a surface protein enriched sample is necessary to better define the M. hyopneumoniae set of proteins exposed to the host, adding confidence to in silico predictions. In this work, we developed an experimental approach based on cell surface labeling followed by mass spectrometry coupled to an in silico analysis, which enabled us to survey the surface exposed proteins in M. hyopneumoniae. A total of 167 protein identifications corresponding to 59 different protein species were identified in proteomic approach. An in silico survey of M. hyopneumoniae transmembrane proteins and lipoproteins results in the prediction of 292 and 25 proteins, respectively. A comparative analysis revealed that 39 proteins (66%) experimentally identified in surface were also in silico predicted as transmembrane proteins or lipoproteins and are represented mainly by adhesion related proteins, lipoproteins and hypothetical proteins. The other 20 proteinas (34%) comprise mainly proteins traditionally related to metabolism, but some of them were previously suggested to be involved in bacterial-host interactions and pathogenicity of Mycoplasma species. The obtained results provided a better picture of the M. hyopneumoniae cell surface that will help in the understanding of processes important for bacterial pathogenesis, selection of targets for further functional studies and development of more efficient drugs, vaccines and diagnostic tools for EP treatment, prevention and control.