Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.

Mycoplasma hyopneumoniae é a bactéria causadora da pneumonia micoplásmica suína, que afeta o rebanho suíno em nível mundial. Durante o processo de infecção, o sistema imune de organismos afetados produz espécies reativas de oxigênio (ERO), conhecidas por causarem uma variedade de lesões celulares, como uma das estratégias para neutralização do patógeno. Embora a presença de enzimas antioxidantes clássicas seja esperada em M. hyopneumoniae, genes importantes relacionados à proteção contra ERO como superóxido-dismutase, catalases e glutationa-peroxidase não foram identificados por homologia na anotação de seqüências genômicas. Entre os poucos genes de M. hyopneumoniae codificando proteínas possivelmente envolvidas na supressão da resposta do hospedeiro através da produção de ERO, foi identificado um codificando uma peroxirredoxina. Análises de seqüência e filogenéticas mostram que a peroxirredoxina de M. hyopneumoniae (MhPrx) está relacionada com a subfamília das peroxirredoxinas 2-Cys atípica, embora ela tenha apenas uma cisteína em sua seqüência. A seqüência de DNA codificadora (CDS) da MhPrx foi clonada e expressa em Escherichia coli para a produção de uma MhPrx recombinante (rMhPrx), a qual foi purificada e usada para a imunização de camundongos para produzir um anti-soro policlonal anti-MhPx. Este anti-soro foi utilizado para investigar extratos protéicos de M. hyopneumoniae e demonstrou a expressão de MhPrx nas três cepas testas (J, 7422 e 7448). A atividade da rMhPrx foi determinada com uso de um sistema de oxidação catalisado por metais, que mostrou que esta enzima pode proteger moléculas de DNA do dano causado por ERO e deve ter uma função essencial durante a infecção. / Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of the porcine enzootic pneumonia, which affects swineherds worldwide causing heavy economical losses. In the infection process, the host generates reactive oxygen species (ROS) as one of the strategies used to neutralize the pathogen. Although the presence of classical antioxidant enzymes would be expected in M. hyopneumoniae, important genes directly related to protection against ROS, like superoxide-dismutase, catalases and glutathione-peroxidase were not identified by sequence homology in the genome sequence annotation. Among the few identified M. hyopneumoniae genes coding for proteins possibly involved with suppression of the host ROS-mediated response, one coding for a peroxiredoxin was recognized. Sequence and phylogenetic analysis indicate that M. hyopneumoniae peroxiredoxin (MhPrx) is closely related to the atypical 2-Cys peroxiredoxin subfamily, although it has only one cysteine in its sequence. The MhPrx coding DNA sequence was cloned and expressed in Escherichia coli to produce a recombinant MhPrx (rMhPrx), which was purified and used to immunize mice and produce an anti-MhPrx polyclonal antiserum. This antiserum was used to probe M. hyopneumoniae extracts and demonstrated that MhPrx is expressed in all three tested strains (J, 7422 and 7448). A metal catalyzed oxidation system was used to assay the activity of rMhPrx, showing that it can protect DNA from ROSmediated damage and may play an essential role during infection.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.

Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma flocculare são duas espécies geneticamente muito similares. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, enquanto M. flocculare é amplamente distribuído em rebanhos suínos, mas nenhuma doença decorrente da sua presença é observada. O repertório de proteínas ortólogas compartilhadas entre estas duas espécies é de 70% e de proteínas de superfície chega em torno de 90%. Diferenças estruturais e funcionais entre as proteínas ortólogas poderiam explicar, pelo menos em parte, o caráter de patogenicidade ou não destas espécies. A fim de identificar domínios diferenciais, foi realizada uma análise comparativa in silico das proteínas de superfície ortólogas de M. hyopneumoniae e M. flocculare. Foram analisados 184 pares de proteínas ortólogas e foram identificados domínios diferenciais em 85% deles. As sequências codificadoras das regiões diferenciais do par de proteínas hipotéticas ortólogas MHP7448_0612, de M. hyopneumoniae, e MF_00357, de M. flocculare, foram clonadas em vetor de expressão pGEX-4T-3 e expressas em Escherichia coli para a produção dos polipeptídeos recombinantes correspondentes (rMHP61267-169 e rMF35767-197, respectivamente). A resposta imune humoral e celular de camundongos foi analisada para avaliação das possíveis propriedades imunológicas diferenciais de domínios correspondentes de M. hyopneumoniae e de M. flocculare. Ambos os polipeptídeos recombinantes induziram altos níveis de IgG a partir do dia 30 pós-imunização em relação ao grupo controle, mas não houve diferença significativa entre os níveis de IgG entre os animais imunizados com os polipeptídeos recombinantes. Na avaliação da resposta celular, rMHP61267-169 induziu níveis significativamente maiores de IFN-γ e IL-10 em esplenócitos de camundongos não imunizados em relação aos níveis induzidos por rMF35767-197 ou aos observados no controle sem estímulo. Os domínios diferenciais induziram respostas imunes celulares diferenciais em camundongos. Esses resultados apontam um possível envolvimento de domínios diferenciais na resposta imune do hospedeiro contra M. hyopneumoniae e no desenvolvimento da doença. / M. hyopneumoniae and M. flocculare are two genetically similar bacterial species. M. hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia, while M. flocculare is also widespread in swine herds, although no disease has been associated with its presence. The repertoire of orthologous proteins between M. hyopneumoniae and M. flocculare are 70% of total CDS and 90% of surface proteins. Functional and structural differences between orthologous surface proteins could explain the pathogenicity or non-pathogenicity of these species. To identify differential domains between pairs of orthologous, a comparative in silico analysis of orthologous surface proteins between these two species was performed. A total of 184 ortholog pairs were analyzed and differential domains were found in 85% of them. The coding sequences of differential domains from the pair of ortholog hypothetical proteins MHP7448_0612, from M. hyopneumoniae, and MF_00357, from M. flocculare, were cloned into pGEX-4T-3 and expressed in E. coli for the production of the correspondent recombinant polypeptides (rMHP61267-169 and rMF35767-197, respectively). The humoral and cellular immune response from mice were assessed to evaluate the possible differential immunological properties of corresponding domains from M. hyopneumoniae and M. flocculare. Both recombinant polypeptides induced high levels of IgG starting at 30 post-imunization in comparison to the control group, but no significant difference was observed between IgG levels from mice immunized with the recombinant polypeptides. Regarding cellular immune responses, rMHP61267-169 induced high levels of IFN-γ e IL-10 in splenocytes from non-immunized mice, in comparison to the levels observed in animals immunized with rMF35767-197 or in the non-stimulated control group. Differential domains induced differential cellular immune response in mice. This results suggest a possible involvement of differential domains in host immune response against M. hyopneumoniae and in disease development.

Mycoplasma hyopneumoniae é a bactéria causadora da pneumonia micoplásmica suína, que afeta o rebanho suíno em nível mundial. Durante o processo de infecção, o sistema imune de organismos afetados produz espécies reativas de oxigênio (ERO), conhecidas por causarem uma variedade de lesões celulares, como uma das estratégias para neutralização do patógeno. Embora a presença de enzimas antioxidantes clássicas seja esperada em M. hyopneumoniae, genes importantes relacionados à proteção contra ERO como superóxido-dismutase, catalases e glutationa-peroxidase não foram identificados por homologia na anotação de seqüências genômicas. Entre os poucos genes de M. hyopneumoniae codificando proteínas possivelmente envolvidas na supressão da resposta do hospedeiro através da produção de ERO, foi identificado um codificando uma peroxirredoxina. Análises de seqüência e filogenéticas mostram que a peroxirredoxina de M. hyopneumoniae (MhPrx) está relacionada com a subfamília das peroxirredoxinas 2-Cys atípica, embora ela tenha apenas uma cisteína em sua seqüência. A seqüência de DNA codificadora (CDS) da MhPrx foi clonada e expressa em Escherichia coli para a produção de uma MhPrx recombinante (rMhPrx), a qual foi purificada e usada para a imunização de camundongos para produzir um anti-soro policlonal anti-MhPx. Este anti-soro foi utilizado para investigar extratos protéicos de M. hyopneumoniae e demonstrou a expressão de MhPrx nas três cepas testas (J, 7422 e 7448). A atividade da rMhPrx foi determinada com uso de um sistema de oxidação catalisado por metais, que mostrou que esta enzima pode proteger moléculas de DNA do dano causado por ERO e deve ter uma função essencial durante a infecção. / Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of the porcine enzootic pneumonia, which affects swineherds worldwide causing heavy economical losses. In the infection process, the host generates reactive oxygen species (ROS) as one of the strategies used to neutralize the pathogen. Although the presence of classical antioxidant enzymes would be expected in M. hyopneumoniae, important genes directly related to protection against ROS, like superoxide-dismutase, catalases and glutathione-peroxidase were not identified by sequence homology in the genome sequence annotation. Among the few identified M. hyopneumoniae genes coding for proteins possibly involved with suppression of the host ROS-mediated response, one coding for a peroxiredoxin was recognized. Sequence and phylogenetic analysis indicate that M. hyopneumoniae peroxiredoxin (MhPrx) is closely related to the atypical 2-Cys peroxiredoxin subfamily, although it has only one cysteine in its sequence. The MhPrx coding DNA sequence was cloned and expressed in Escherichia coli to produce a recombinant MhPrx (rMhPrx), which was purified and used to immunize mice and produce an anti-MhPrx polyclonal antiserum. This antiserum was used to probe M. hyopneumoniae extracts and demonstrated that MhPrx is expressed in all three tested strains (J, 7422 and 7448). A metal catalyzed oxidation system was used to assay the activity of rMhPrx, showing that it can protect DNA from ROSmediated damage and may play an essential role during infection.

Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma flocculare são duas espécies geneticamente muito similares. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, enquanto M. flocculare é amplamente distribuído em rebanhos suínos, mas nenhuma doença decorrente da sua presença é observada. O repertório de proteínas ortólogas compartilhadas entre estas duas espécies é de 70% e de proteínas de superfície chega em torno de 90%. Diferenças estruturais e funcionais entre as proteínas ortólogas poderiam explicar, pelo menos em parte, o caráter de patogenicidade ou não destas espécies. A fim de identificar domínios diferenciais, foi realizada uma análise comparativa in silico das proteínas de superfície ortólogas de M. hyopneumoniae e M. flocculare. Foram analisados 184 pares de proteínas ortólogas e foram identificados domínios diferenciais em 85% deles. As sequências codificadoras das regiões diferenciais do par de proteínas hipotéticas ortólogas MHP7448_0612, de M. hyopneumoniae, e MF_00357, de M. flocculare, foram clonadas em vetor de expressão pGEX-4T-3 e expressas em Escherichia coli para a produção dos polipeptídeos recombinantes correspondentes (rMHP61267-169 e rMF35767-197, respectivamente). A resposta imune humoral e celular de camundongos foi analisada para avaliação das possíveis propriedades imunológicas diferenciais de domínios correspondentes de M. hyopneumoniae e de M. flocculare. Ambos os polipeptídeos recombinantes induziram altos níveis de IgG a partir do dia 30 pós-imunização em relação ao grupo controle, mas não houve diferença significativa entre os níveis de IgG entre os animais imunizados com os polipeptídeos recombinantes. Na avaliação da resposta celular, rMHP61267-169 induziu níveis significativamente maiores de IFN-γ e IL-10 em esplenócitos de camundongos não imunizados em relação aos níveis induzidos por rMF35767-197 ou aos observados no controle sem estímulo. Os domínios diferenciais induziram respostas imunes celulares diferenciais em camundongos. Esses resultados apontam um possível envolvimento de domínios diferenciais na resposta imune do hospedeiro contra M. hyopneumoniae e no desenvolvimento da doença. / M. hyopneumoniae and M. flocculare are two genetically similar bacterial species. M. hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia, while M. flocculare is also widespread in swine herds, although no disease has been associated with its presence. The repertoire of orthologous proteins between M. hyopneumoniae and M. flocculare are 70% of total CDS and 90% of surface proteins. Functional and structural differences between orthologous surface proteins could explain the pathogenicity or non-pathogenicity of these species. To identify differential domains between pairs of orthologous, a comparative in silico analysis of orthologous surface proteins between these two species was performed. A total of 184 ortholog pairs were analyzed and differential domains were found in 85% of them. The coding sequences of differential domains from the pair of ortholog hypothetical proteins MHP7448_0612, from M. hyopneumoniae, and MF_00357, from M. flocculare, were cloned into pGEX-4T-3 and expressed in E. coli for the production of the correspondent recombinant polypeptides (rMHP61267-169 and rMF35767-197, respectively). The humoral and cellular immune response from mice were assessed to evaluate the possible differential immunological properties of corresponding domains from M. hyopneumoniae and M. flocculare. Both recombinant polypeptides induced high levels of IgG starting at 30 post-imunization in comparison to the control group, but no significant difference was observed between IgG levels from mice immunized with the recombinant polypeptides. Regarding cellular immune responses, rMHP61267-169 induced high levels of IFN-γ e IL-10 in splenocytes from non-immunized mice, in comparison to the levels observed in animals immunized with rMF35767-197 or in the non-stimulated control group. Differential domains induced differential cellular immune response in mice. This results suggest a possible involvement of differential domains in host immune response against M. hyopneumoniae and in disease development.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica, enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes causas de perdas econômicas na suinocultura mundial. Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica (linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas funcionais neste organismo. Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em M. hyopneumoniae. Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de supostas regiões promotoras nesta espécie. O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de resistência à tetraciclina. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante tetM heterólogo é funcional neste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia of pigs.The disease has a worldwide distribution in growing and finishing pigs. The enzootic pneumonia has been considered one of the most important causes of economic losses in the worldwide swine breeding. The now available complete sequences of the genomes of two pathogenic (7448 and 232) and one non-pathogenic strain (J) of M. hyopneumoniae and the lack of suitable genetic systems to study these genomes points to the emergent need for the development of functional genetic tools for this organism. Currently, there are replicating vectors available for five species of mycoplasmas. However none of them posses oriC of M. hyopneumoniae, and studies suggest that these vectors are species-specific and they would not be functional in M. hyopneumoniae. The aim of the present study was to construct a replicating vector and the development of a system for transformation of M. hyopneumoniae. These constitute a previous and essential stage for the study of putative promoter regions in this species. To construct the replicating plasmid pOSTM the oriC of M. hyopneumoniae and the expression cassette containing the gene for tetracycline resistance (tetM), controlled by spiralin gene promoter of Spiroplasma citri, were introduced into the vector pUC18. The transformation was achieved by electroporation and transformants were selected for tetracycline resistance. Tetracycline resistance transformants were confirmed through PCR amplification of portion of the inserted vector. Such evidence allows the conclusion that M. hyopneumoniae is amenable to transformation and heterologous tetM determinant is functional in this pathogen.