The use of near ambient air drying for the preservation of wheat stored in granaries is common in Western Canada. Guidelines have been developed to assist farmers in selecting appropriate drying methods. During this process the top layer of wheat can remain at moisture contents (m.c.) greater than the safe storage limit, 14.5% wet bulb (wb), for up to 12 weeks. This study tested the effects of this drying procedure on the development of ochratoxin A (OTA) using 1 m3 bulks of durum wheat at 18% m.c. (wb) contained within steel bins inside a Weather Simulation Lab. In a second study using 20 L volumes of wheat at a m.c. of 20% (wb) within an environmental growth chamber potential development of OTA was also evaluated. The wheat was exposed to two treatments, airflow and no airflow, for a period of 12 weeks under conditions of high relative humidity (greater than 80%) and typical Manitoba fall temperatures. The storage quality parameters of germination, fat acidity value, and presence of OTA were measured weekly. It was found that high moisture wheat stored under all treatment conditions showed a rapid decrease in germination and increase in fat acidity value over time, with no significant difference between the treatments. Under the tested conditions the development of ochratoxin A was not detected in significant quantities in the 1 m3 bulks of grain but was detected in the smaller 20 L bulks.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 1998. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 131-144). Also available on the Internet.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 1998. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 131-144). Also available on the Internet.

A ocratoxina (OTA) é uma micotoxina que possui propriedades nefrotóxicas, hepatotóxicas, teratogênicas e carcinogênicas. No Brasil, o limite máximo permitido de OTA em vinhos foi estabelecido em 2011 e é 2 μg/L. A ocorrência desta toxina em vinhos está relacionada principalmente à presença de fungos do gênero Aspergillus nas uvas usadas para a vinificação. Deste modo, o objetivo deste estudo foi verificar a influência das etapas de elaboração de vinho Cabernet Sauvignon sobre os níveis de OTA, através de dois diferentes experimentos: (A) vinho elaborado a partir de uvas inoculadas com fungo ocratoxigênico e (B) vinho elaborado com uvas naturalmente contaminadas com OTA. Para os dois experimentos, amostras das etapas mosto, fermentação/maceração, descuba, pós-fermentação, trasfega e maturação foram coletadas em triplicata, durante um período de 5 meses. A OTA foi detectada através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência (CLAE-FL) e o limite de detecção e quantificação foi de 0,06 μg/L e 0,6 μg/L, respectivamente. Durante a vinificação, as etapas que apresentaram maior percentual de redução da toxina foram descuba, pós-fermentação e trasfega. Reduções significativas nos níveis de OTA foram observadas após a conclusão da vinificação. No vinho elaborado com uvas inoculadas com fungo ocratoxigênico observou-se uma redução de 92,6%. Valor similar (92%) foi verificado no vinho produzido com uvas naturalmente contaminadas por OTA. Considerando todo o processo de vinificação, pode-se sugerir que a diminuição dos níveis de OTA foi observada principalmente, devido à adsorção da toxina à parede celular das leveduras. Além disso, a adsorção da toxina aos sólidos em suspensão presentes no vinho durante a elaboração pode ter ocorrido. / The ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin with nephrotoxic, hepatotoxic, teratogenic and carcinogenic properties. In Brazil, the permitted maximum limits for the OTA in wines was established in 2011 and is 2 μg/L. The occurence of this toxin in wines is due mainly for presence of fungi from Aspergillus genera in grapes used for winemaking. In this way, the aim of this study was to check the influence of stages of the winemaking process of Cabernet Sauvignon grape on the OTA levels through two different experiments: (A) wine made from grapes inoculated with ochratoxigenic fungi and (B) wine made from grapes naturally contaminated with OTA. For the two experiments, samples of must, fermentation/maceration, drawn-off wine, after fermentation, racking and maturation stages were collected in triplicate, during 5 months. The OTA was detected using high-performance liquid chromatography with fluorecence detector (HPLC-FL) and the limit of detection and limit of quantitation were 0.06 and 0.6 μg/L, respectively. During the winemaking, the stages that show higher toxin reduction were drawn-off wine, after alcoholic fermentation and racking. Significant reductions in OTA levels were observed when winemaking was finished. A reduction of 92.6% was observed in wine made from grapes inoculated with ochratoxigenic fungi. Similar value (92%) was verified in wine made from grapes naturally contaminated with OTA. Considering all winemaking process, we may suggest that the decreasing of OTA levels was observed mainly due to adsorption of the toxin in cell wall of yeast. Furthermore, the adsorption of the toxin in suspended solids present in wine during the winemaking may be occurred.

Fungos filamentosos com capacidade de produzir micotoxinas podem estar presentes em alimentos, desde o cultivo até o produto após industrialização. Devido a isso, estratégias para controlar o crescimento fúngico devem ser investigadas, a fim de evitar o desenvolvimento desses microrganismos, bem como a produção de suas toxinas nos alimentos. Neste trabalho, duas abordagens para o controle de fungos toxigênicos foram avaliadas. A primeira estratégia foi a utilização de bactérias provenientes de diferentes ambientes aquáticos, sendo que 10 linhagens de Bacillus spp. e a linhagem Pseudomonas sp. 4B foram testadas quanto à influência sobre os parâmetros de crescimento (taxas de crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos) de fungos toxigênicos (Aspergillus e Penicillium) e formação de micotoxinas. Todas as bactérias foram capazes de inibir o crescimento dos fungos em meio de cultura, apresentando halos de inibição variando de 1,0 até 15,7 mm. Bacillus sp. P11 apresentou resultados mais expressivos em relação às demais linhagens do gênero Bacillus com maiores valores de redução na maioria dos parâmetros de crescimento. Além disso, Bacillus sp. P11 e Pseudomonas sp. 4B apresentaram efeito sobre as taxas de crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos, com níveis de redução acima de 43,3, 32,1 e 84,1% respectivamente. Mesmo assim, as demais linhagens também apresentaram resultados satisfatórios sobre esses parâmetros. Estas bactérias também reduziram a síntese de aflatoxina B1 e ocratoxina A em mais de 94 e 63%, respectivamente, quando cultivadas simultaneamente com os fungos produtores de cada micotoxina. Adicionalmente, a capacidade de Bacillus sp. P11 em produzir os lipopeptídeos iturina A (167,9 mg/mL de extrato butanólico) e surfactina (361,9 mg/mL de extrato butanólico) foi confirmada. Estes compostos podem ter contribuído para a atividade antifúngica desta bactéria. A segunda estratégia investigada neste estudo para controlar o desenvolvimento de fungos toxigênicos foi o emprego de nanofibras de poli-ɛ-caprolactona (PCL) incorporadas com cetoconazol e natamicina como material antimicrobiano. Nesta abordagem, as nanofibras foram produzidas pela técnica de eletrofiação e posteriormente caracterizadas e avaliadas quanto ao seu potencial antifúngico. Nanofibras funcionalizadas com cetoconazol ou natamicina apresentaram atividade antifúngica contra os isolados toxigênicos uma vez que zonas de inibição variando de 6 a 44 mm foram observadas. Além disso, as análises de microscopia eletrônica e espectroscopia demonstraram que a incorporação dos antifúngicos não altera de forma expressiva as principais características das nanofibras. Também foi possível verificar a capacidade de liberação controlada dos antifúngicos durante 72 h de contato das nanofibras com diferentes soluções simulantes. Valores próximos a 80 e 45 μg/mL de cetoconazol e natamicina, respectivamente, foram observados em solução de Tween 20 (5%). Portanto, o processo de eletrofiação foi capaz de agregar propriedades antifúngicas às nanofibras de PCL. Os resultados demonstraram que as bactérias e os nanomateriais investigados neste estudo são promissores para o controle de fungos toxigênicos e produção de micotoxinas. / Filamentous fungi that have the potential to produce mycotoxins may be present in food, from cultivation to after industrialization. Therefore, several strategies to control fungal growth must be investigated in order to avoid the development of these microorganisms and the production of their toxins in food. In this work, two approaches to toxigenic fungi control were evaluated. The first one was the use of bacteria from different aquatic environments as biocontrol agents in which 10 Bacillus spp. strains and the Pseudomonas sp. 4B strain were tested in relation to the effect on growth parameters (mycelial growth, sporulation and spore germination rates) of toxigenic fungi (Aspergillus and Penicillium) and mycotoxin formation. All bacteria were able to inhibit the fungal growth in culture medium with inhibition zones ranging from 1.0 to 15.7 mm. It was also observed that Bacillus sp. P11 had better results compared to other Bacillus strains with larger reduction values in most of growth parameters. Furthermore, Bacillus sp. P11 and Pseudomonas sp. 4B exhibited effect on mycelial growth, sporulation and spore germination rates with reduction values above of 43.3, 32.1 and 84.1%, respectively. Even so, the other strains also showed satisfactory results on these parameters. Finally, these bacteria reduced the synthesis of aflatoxin B1 and ochratoxin A at levels above 94 and 63%, respectively, when co-cultivated with each mycotoxin producing fungi. Additionally, the ability of Bacillus sp. P11 to produce lipopeptides such as iturin A (167.9 mg/ml of butanolic extract) and surfactin (361.9 mg/ml of butanolic extract) was confirmed. These compounds may have contributed to antifungal activity of this bacterium. The second investigation of this work in order to control the growth of toxigenic fungi was the use of poly-ε-caprolactone nanofibers incorporated with ketoconazole and natamycin as antimicrobial material. In this approach, nanofibers were produced by the electrospinning technique and subsequently characterized and evaluated for their antifungal potential. Both nanofibers functionalized with ketoconazole and natamycin showed antifungal activity against toxigenic isolates since inhibitory zones ranging from 6 to 44 mm were observed. In addition, scanning electron microscopy and infrared spectroscopy analysis showed that the antifungals incorporation does not change the characteristics of nanofibers. It was also possible to verify the ability of controlled drug release during 72 h of nanofibers contact with different simulants solutions. Values near 80 and 45 μg/ml of ketoconazole and natamycin, respectively, were observed in the solution containing 5% Tween 20. Therefore, the electrospinning process was able to provide antifungal properties to the nanofibers. The results showed that bacteria and nanomaterials investigated in this study are promising for developing control strategies of toxigenic fungi and mycotoxin production.

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Dentre as centenas de micotoxinas existentes destacam-se a AFB1 (carcinogênica) e a ZEA (estrogênica). Devido à preocupação com a saúde humana, no que diz respeito à contaminação dos alimentos, existem inúmeros países e comunidades econômicas que possuem legislações cada vez mais rígidas quanto aos níveis máximos permitidos e ao número de micotoxinas avaliadas, o que justifica os inúmeros trabalhos envolvendo o desenvolvimento de métodos analíticos para quantificação dessas substâncias em amostras alimentícias. Por outro lado, pouco tem sido feito para determinar o destino e a distribuição dessas substâncias no ambiente. Nesse sentido, o presente estudo tem como objetivos desenvolver um método para determinação das micotoxinas (AFB1 e ZEA) em solo, e avaliar a mobilidade das micotoxinas, por meio de testes de degradação e sorção/dessorção em solos de três cidades brasileiras. Para tanto, desenvolveu-se um método de determinação de AFB1 e ZEA em solo, utilizando um método de extração QuEChERS modificado, e analisado por CLAE-FLU utilizando etanol como fase móvel. O método apresentou seletividade adequada, recuperações entre 74 e 120%, precisão (CV máximo de 8%) e limite de quantificação de 45 ng g-1. O efeito matriz e a linearidade foram estudados utilizando abordagem estatística criteriosa. Para os estudos de degradação o modelo não linear de Gustafson-Holden apresentou as melhores correlações com os dados experimentais, com tempo de meia vida (DT50) de 5 a 10 dias para a AFB1 e de 1 a 3 dias para ZEA. Dos estudos que definiram a cinética de sorção, notou-se uma fase inicial, de rápida sorção (até 12 horas), seguida de uma etapa mais lenta. Das Isotermas avaliadas, a de Freundlich apresentou os melhores coeficientes de correlação. Pode-se observar que, para as duas micotoxinas, em mistura ou individual, os menores valores foram encontrados para o solo de Araraquara, o que é justificado pelos menores valores de argila e matéria orgânica, mostrando que as principais interações solo/micotoxina são as hidrofóbicas. Também foi observado e efeito sinérgico de sorção das micotoxinas em mistura, indicando que na presença de outra micotoxina, a sorção é favorecida. Os estudos de dessorção apontaram para um processo irreversível. Quanto à avaliação da mobilidade das micotoxinas, alguns modelos demonstraram o risco de dispersão da AFB1 e ZEA para o ambiente. / Mycotoxins are naturally occurring secondary metabolites of fungi that grow on agricultural products in the field and during storage. In addition to being responsible for huge economic losses, mycotoxins present a high risk to human and animal health. Among hundreds existing mycotoxins stand out the aflatoxin B1 (carcinogenic) and zearalenone (estrogenic). Due to concern for human health, in relation to contamination of food, there are many countries and economic community with increasingly stricter legislation as regards maximum levels and the number of evaluated mycotoxins, which explains the numerous studies involving the development of analytical methods for the quantification of these substances in food samples. On the other hand, little has been done to determine the fate and distribution of these substances in the environment. In this sense, this project aims to develop a method for determination of mycotoxins (AFB1 and ZEA) in soil, and evaluate the mycotoxins mobility through degradation and sorption/desorption tests in three Brazilian soils. Thus, we developed a method for determination AFB1 and ZEA in soil, using a QuEChERS modified method followed by HPLC-FLD with ethanol as mobile phase. The method validation process showed that were achieved a method with adequate selectivity, recovery (74-120%, for different concentrations of AFB1 and ZEA), precision (RSD below 8%) and the quantification limit (LQ) was 45 ng g-1 . The matrix effect and linearity was studied based in statistical approach. To degradation study, nonlinear Gustafson-Holden model showed the best correlation with experimental data, with half-life (DT50) 5 to 10 days for AFB1 and 1 to 3 days to ZEA. In the studies that defined the kinetics sorption, was noted, an initial phase of rapid sorption (up to 12 hours), followed by a slower phase. The Freundlich isotherms showed the best correlation coefficients. It was noted for both mycotoxins, mixed or individually, the lowest values were found in the Araraquara soil, which is justified by the lower clay and organic matter amounts, proving that the main interactions soil/mycotoxin are hydrophobic. It was also observed synergic effect sorption of mixed mycotoxins, indicating that in the presence of other mycotoxin, sorption is favored. Desorption studies indicated an irreversible process. With respect to the evaluation of the mycotoxins mobility, some models have demonstrated the risk of AFB1 and ZEA environment dispersion.

Dissertação composta por 02 artigos. / CNPq; Capes / O leite é uma das principais fontes de nutrientes da dieta humana e é um alimento que acompanha o ser humano durante toda a vida, tanto como leite de consumo como através de seus derivados. Entretanto, são inúmeras as formas e os tipos de contaminação que acometem o leite, destacando-se, dentre os contaminantes de ordem química, as aflatoxinas. Dentre os métodos de análise de aflatoxinas em leite e derivados, destaca-se a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), principalmente devido a sua versatilidade, rapidez e acuracidade das medidas quantitativas. Entretanto, trata-se de um sistema complexo em que as propriedades dos constituintes da fase móvel são afetadas por mudanças nas condições de processo nas quais são realizados os experimentos. Normalmente as condições de análise por CLAE são determinadas empiricamente, pelo método “tentativa e erro” em que inúmeras tentativas são realizadas sem um estudo mais detalhado do sistema. Diante disso, a primeira etapa deste estudo objetivou a otimização de multirrespostas em CLAE, por meio da seleção das condições ótimas como a composição da fase móvel, sua vazão no sistema cromatográfico e a temperatura da coluna, a fim de identificar, separar e quantificar simultaneamente a aflatoxina M1 (AFM1) e a aflatoxina B1 (AFB1). Para tanto, realizou-se planejamento experimental de misturas para três componentes com restrições combinado com um planejamento fatorial 22 para as variáveis de processo (temperatura da coluna e vazão). Após a definição dos modelos para as variáveis dependentes, foi realizada busca das condições ótimas usando o método simplex sequencial e as funções de desejabilidade de Derringer e Suich. As variáveis avaliadas foram: composição da fase móvel (acetonitrila, metanol e solução aquosa de ácido acético 1%), vazão da fase móvel e temperatura da coluna. Os parâmetros cromatográficos obtidos como respostas foram: tempo e fator de retenção para ambas as aflatoxinas, fator de separação, resolução da coluna e altura dos picos. Após a validação do planejamento, foi realizada a validação analítica do método otimizado através das figuras analíticas de mérito: linearidade, precisão, exatidão e limites de detecção e quantificação. O planejamento realizado foi capaz de produzir modelos confiáveis que possibilitaram a estimativa das melhores condições atendendo aos múltiplos objetivos. Na validação analítica do método cromatográfico, os parâmetros analíticos avaliados ficaram dentro dos intervalos de confiança, podendo o método ser considerado exato e preciso, apresentando limites de quantificação de 0,3 e 0,5 μg L-1 para AFM1 e AFB1, respectivamente e linearidade com R2 > 0,99 para ambas as aflatoxinas. A segunda etapa do estudo objetivou a avaliação da interação entre as AFM1 e AFB1 com proteínas lácteas, tendo em vista que estudos demonstram que aquelas, especialmente a AFM1, localizam-se predominantemente nas frações proteicas. Entretanto, esses estudos não avaliaram a interação entre aflatoxinas e as proteínas do leite, mas apenas baseiam-se na sua quantificação nas frações proteicas do leite. Portanto, buscou-se por meio deste estudo avaliar a possível interação entre as AFM1 e AFB1 com as frações proteicas do leite. Análises por Espectroscopia na região de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foram realizadas para avaliação de possíveis modificações na estrutura secundária das proteínas lácteas quando fortificadas com as aflatoxinas e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC). Para tanto, preliminarmente foram avaliados os espectros obtidos com padrões de caseína e β-lactoglobulina em solução tampão fosfato-salino (PBS) e em solução modelo, assim como no leite propriamente dito, integral e desnatado. Na segunda etapa, regiões espectrais específicas foram avaliadas por meio de técnicas de deconvolução e curve-fitting. Os resultados indicam que a solução PBS foi mais adequada para o estudo da interação entre as AFB1 e AFM1 e proteínas lácteas avaliadas, β-lactoglobulina e caseína. Foram observadas alterações nas estruturas secundárias e essas sugerem que, embora possivelmente ocorram interações de caráter hidrofílico entre β-lactoglobulina e as aflatoxinas (especialmente com AFM1), ocorram também interações de caráter hidrofóbico (especialmente de AFB1) com os pacotes hidrofóbicos da β-lactoglobulina. Já com a caseína, as alterações promovidas nas estruturas secundárias proteicas foram mais discretas, porém deslocamentos de picos foram observados indicando alterações estruturais da proteína, especialmente na presença de AFB1, o que sugere que ocorram interações químicas entre os componentes avaliados. As alterações espectrais, mais evidentes com a fração β-lactoglobulina, do que com a fração caseína sugerem que, embora a quantificação de aflatoxinas seja comumente superior na fração caseína, não se pode afirmar que por esse motivo ocorram interações mais tangíveis entre aflatoxinas e caseína do que entre aflatoxinas e β-lactoglobulina. Possivelmente a quantificação em maior percentual de aflatoxinas na fração caseína é atribuída ao fato dessa proteína encontrar-se, no leite, em percentual superior às proteínas do soro. Outra hipótese levantada pelo estudo é a possibilidade das aflatoxinas avaliadas encontrarem-se “mascaradas” por estarem conjugadas com a β-lactoglobulina e não sendo, portanto, detectadas pelos métodos analíticos convencionais ocasionando sua subestimação nessa fração. / Milk is one of the main sources of nutrients in the human diet and is a food that accompanies the human being throughout life, both as drinking milk as through its derivatives. However, there are countless forms and types of contamination that affect milk, especially among the contaminants of chemical order, aflatoxins. Among the methods of analysis of aflatoxins in milk and dairy products, the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) stands out mainly due to its versatility, speed and accuracy of quantitative measurements. However, it is a complex system in which the properties of the constituents of the mobile phase are affected by changes in process conditions under which the experiments are performed. Typically the HPLC analysis conditions are determined empirically, using the "trial and error" in which numerous attempts are made without a more detailed study of the system. Therefore, the first step of this aimed to optimize multiresponses in HPLC, by selecting the optimal conditions as the mobile phase composition, its flow into the chromatographic system and the column temperature in order to identify, separate and quantify aflatoxin M1 (AFM1) and aflatoxin B1 (AFB1) simultaneously. Therefore, it was carried out experimental a mixture design for three components with restrictions combined with a 22 factorial design to the process variables (flow and column temperature). After defining the models for the dependent variables, a search of the optimum conditions was made using the sequential simplex method and the Derringer and Suich desirability functions. The variables evaluated were: mobile phase composition (acetonitrile, methanol and aqueous solution of acetic acid 1%), the mobile phase flow rate and column temperature. The chromatographic parameters obtained as responses were time and factor of retention for both aflatoxins, separation factor, column resolution and height of the peaks. After the design validation, analytical validation was performed through the analytical figures of merit: linearity, precision, accuracy and limits of detection and quantification. The experimental design carried out was able to produce reliable models that allowed better conditions estimation regarding multiple objectives. In the analytical validation of the chromatographic method, the analytical parameters evaluated were within the confidence interval, the method can be considered accurate and precise showing quantitation limits of 0.3 and 0.5 μg L-1 for AFB1 and AFM1, respectively, and linearity with R2> 0.99 for both aflatoxins. The second stage of the study aimed to evaluate the interaction between the AFB1 and AFM1 with dairy proteins, considering that studies show that those, especially AFM1, are located predominantly in the protein fractions. However, these studies did not evaluate the possibility of interaction between aflatoxins and dairy proteins, but only based on its quantification in the dairy protein fractions. Therefore, we sought through this study to evaluate a possible interaction between AFM1 and AFB1 with dairy protein fractions. Analyzes were performed by Fourier transformation infrared spectroscopy (FTIR) to assess possible changes in the secondary structure of dairy proteins when spiked with aflatoxins and Differential Scanning Calorimetry (DSC). For this purpose, preliminarily the spectra obtained were evaluated with standard casein and β-lactoglobulin in phosphate buffer saline solution (PBS) and a bovine milk model solution as well as in actual milk, whole and skim. In the second step, specific spectra bands were assessed through deconvolution and curve-fitting techniques. The results show that PBS was more suitable for the interaction study between aflatoxins B1 and M1 and the dairy proteins evaluated, β-lactoglobulin and casein. Changes in secondary structures suggest that although possibly occurring interactions with hydrophilic characters between β-lactoglobulin and aflatoxins were observed (especially with AFM1) also occur interactions with hydrophobic character (especially AFB1) with the hydrophobic β-lactoglobulin packages. Already with the casein, the changes introduced in protein secondary structure were more discreet but peak shifts were observed indicating structural changes of the protein, especially in the presence of AFB1, which suggests that chemical interactions occur between the components evaluated. The spectral changes, more evident with the β-lactoglobulin fraction than the casein fraction, suggests that although the quantification of aflatoxins is commonly higher in the casein fraction, it’s not possible to ensure that for this reason occur more tangible interactions between aflatoxins and casein than between aflatoxins and whey proteins (β-lactoglobulin). The greater quantify percentage of aflatoxins in the casein fraction, apparently, is attributed to the fact that this protein is found, in milk, in superior percentage to the whey proteins. Another hypothesis is the possibility of the aflatoxins evaluated are "masked" by being combined with β-lactoglobulin and not, therefore, being detected by conventional analytical methods leading to their underestimation in this fraction. / 5000

Fungos filamentosos com capacidade de produzir micotoxinas podem estar presentes em alimentos, desde o cultivo até o produto após industrialização. Devido a isso, estratégias para controlar o crescimento fúngico devem ser investigadas, a fim de evitar o desenvolvimento desses microrganismos, bem como a produção de suas toxinas nos alimentos. Neste trabalho, duas abordagens para o controle de fungos toxigênicos foram avaliadas. A primeira estratégia foi a utilização de bactérias provenientes de diferentes ambientes aquáticos, sendo que 10 linhagens de Bacillus spp. e a linhagem Pseudomonas sp. 4B foram testadas quanto à influência sobre os parâmetros de crescimento (taxas de crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos) de fungos toxigênicos (Aspergillus e Penicillium) e formação de micotoxinas. Todas as bactérias foram capazes de inibir o crescimento dos fungos em meio de cultura, apresentando halos de inibição variando de 1,0 até 15,7 mm. Bacillus sp. P11 apresentou resultados mais expressivos em relação às demais linhagens do gênero Bacillus com maiores valores de redução na maioria dos parâmetros de crescimento. Além disso, Bacillus sp. P11 e Pseudomonas sp. 4B apresentaram efeito sobre as taxas de crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos, com níveis de redução acima de 43,3, 32,1 e 84,1% respectivamente. Mesmo assim, as demais linhagens também apresentaram resultados satisfatórios sobre esses parâmetros. Estas bactérias também reduziram a síntese de aflatoxina B1 e ocratoxina A em mais de 94 e 63%, respectivamente, quando cultivadas simultaneamente com os fungos produtores de cada micotoxina. Adicionalmente, a capacidade de Bacillus sp. P11 em produzir os lipopeptídeos iturina A (167,9 mg/mL de extrato butanólico) e surfactina (361,9 mg/mL de extrato butanólico) foi confirmada. Estes compostos podem ter contribuído para a atividade antifúngica desta bactéria. A segunda estratégia investigada neste estudo para controlar o desenvolvimento de fungos toxigênicos foi o emprego de nanofibras de poli-ɛ-caprolactona (PCL) incorporadas com cetoconazol e natamicina como material antimicrobiano. Nesta abordagem, as nanofibras foram produzidas pela técnica de eletrofiação e posteriormente caracterizadas e avaliadas quanto ao seu potencial antifúngico. Nanofibras funcionalizadas com cetoconazol ou natamicina apresentaram atividade antifúngica contra os isolados toxigênicos uma vez que zonas de inibição variando de 6 a 44 mm foram observadas. Além disso, as análises de microscopia eletrônica e espectroscopia demonstraram que a incorporação dos antifúngicos não altera de forma expressiva as principais características das nanofibras. Também foi possível verificar a capacidade de liberação controlada dos antifúngicos durante 72 h de contato das nanofibras com diferentes soluções simulantes. Valores próximos a 80 e 45 μg/mL de cetoconazol e natamicina, respectivamente, foram observados em solução de Tween 20 (5%). Portanto, o processo de eletrofiação foi capaz de agregar propriedades antifúngicas às nanofibras de PCL. Os resultados demonstraram que as bactérias e os nanomateriais investigados neste estudo são promissores para o controle de fungos toxigênicos e produção de micotoxinas. / Filamentous fungi that have the potential to produce mycotoxins may be present in food, from cultivation to after industrialization. Therefore, several strategies to control fungal growth must be investigated in order to avoid the development of these microorganisms and the production of their toxins in food. In this work, two approaches to toxigenic fungi control were evaluated. The first one was the use of bacteria from different aquatic environments as biocontrol agents in which 10 Bacillus spp. strains and the Pseudomonas sp. 4B strain were tested in relation to the effect on growth parameters (mycelial growth, sporulation and spore germination rates) of toxigenic fungi (Aspergillus and Penicillium) and mycotoxin formation. All bacteria were able to inhibit the fungal growth in culture medium with inhibition zones ranging from 1.0 to 15.7 mm. It was also observed that Bacillus sp. P11 had better results compared to other Bacillus strains with larger reduction values in most of growth parameters. Furthermore, Bacillus sp. P11 and Pseudomonas sp. 4B exhibited effect on mycelial growth, sporulation and spore germination rates with reduction values above of 43.3, 32.1 and 84.1%, respectively. Even so, the other strains also showed satisfactory results on these parameters. Finally, these bacteria reduced the synthesis of aflatoxin B1 and ochratoxin A at levels above 94 and 63%, respectively, when co-cultivated with each mycotoxin producing fungi. Additionally, the ability of Bacillus sp. P11 to produce lipopeptides such as iturin A (167.9 mg/ml of butanolic extract) and surfactin (361.9 mg/ml of butanolic extract) was confirmed. These compounds may have contributed to antifungal activity of this bacterium. The second investigation of this work in order to control the growth of toxigenic fungi was the use of poly-ε-caprolactone nanofibers incorporated with ketoconazole and natamycin as antimicrobial material. In this approach, nanofibers were produced by the electrospinning technique and subsequently characterized and evaluated for their antifungal potential. Both nanofibers functionalized with ketoconazole and natamycin showed antifungal activity against toxigenic isolates since inhibitory zones ranging from 6 to 44 mm were observed. In addition, scanning electron microscopy and infrared spectroscopy analysis showed that the antifungals incorporation does not change the characteristics of nanofibers. It was also possible to verify the ability of controlled drug release during 72 h of nanofibers contact with different simulants solutions. Values near 80 and 45 μg/ml of ketoconazole and natamycin, respectively, were observed in the solution containing 5% Tween 20. Therefore, the electrospinning process was able to provide antifungal properties to the nanofibers. The results showed that bacteria and nanomaterials investigated in this study are promising for developing control strategies of toxigenic fungi and mycotoxin production.

A ocratoxina (OTA) é uma micotoxina que possui propriedades nefrotóxicas, hepatotóxicas, teratogênicas e carcinogênicas. No Brasil, o limite máximo permitido de OTA em vinhos foi estabelecido em 2011 e é 2 μg/L. A ocorrência desta toxina em vinhos está relacionada principalmente à presença de fungos do gênero Aspergillus nas uvas usadas para a vinificação. Deste modo, o objetivo deste estudo foi verificar a influência das etapas de elaboração de vinho Cabernet Sauvignon sobre os níveis de OTA, através de dois diferentes experimentos: (A) vinho elaborado a partir de uvas inoculadas com fungo ocratoxigênico e (B) vinho elaborado com uvas naturalmente contaminadas com OTA. Para os dois experimentos, amostras das etapas mosto, fermentação/maceração, descuba, pós-fermentação, trasfega e maturação foram coletadas em triplicata, durante um período de 5 meses. A OTA foi detectada através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência (CLAE-FL) e o limite de detecção e quantificação foi de 0,06 μg/L e 0,6 μg/L, respectivamente. Durante a vinificação, as etapas que apresentaram maior percentual de redução da toxina foram descuba, pós-fermentação e trasfega. Reduções significativas nos níveis de OTA foram observadas após a conclusão da vinificação. No vinho elaborado com uvas inoculadas com fungo ocratoxigênico observou-se uma redução de 92,6%. Valor similar (92%) foi verificado no vinho produzido com uvas naturalmente contaminadas por OTA. Considerando todo o processo de vinificação, pode-se sugerir que a diminuição dos níveis de OTA foi observada principalmente, devido à adsorção da toxina à parede celular das leveduras. Além disso, a adsorção da toxina aos sólidos em suspensão presentes no vinho durante a elaboração pode ter ocorrido. / The ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin with nephrotoxic, hepatotoxic, teratogenic and carcinogenic properties. In Brazil, the permitted maximum limits for the OTA in wines was established in 2011 and is 2 μg/L. The occurence of this toxin in wines is due mainly for presence of fungi from Aspergillus genera in grapes used for winemaking. In this way, the aim of this study was to check the influence of stages of the winemaking process of Cabernet Sauvignon grape on the OTA levels through two different experiments: (A) wine made from grapes inoculated with ochratoxigenic fungi and (B) wine made from grapes naturally contaminated with OTA. For the two experiments, samples of must, fermentation/maceration, drawn-off wine, after fermentation, racking and maturation stages were collected in triplicate, during 5 months. The OTA was detected using high-performance liquid chromatography with fluorecence detector (HPLC-FL) and the limit of detection and limit of quantitation were 0.06 and 0.6 μg/L, respectively. During the winemaking, the stages that show higher toxin reduction were drawn-off wine, after alcoholic fermentation and racking. Significant reductions in OTA levels were observed when winemaking was finished. A reduction of 92.6% was observed in wine made from grapes inoculated with ochratoxigenic fungi. Similar value (92%) was verified in wine made from grapes naturally contaminated with OTA. Considering all winemaking process, we may suggest that the decreasing of OTA levels was observed mainly due to adsorption of the toxin in cell wall of yeast. Furthermore, the adsorption of the toxin in suspended solids present in wine during the winemaking may be occurred.

Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Masters in Technology in Chemistry, M.L. Sultan Technikon, 2000. / Mycotoxins are a group of natural poisons produced by certain strains of fungal species when they grow under favourable conditions on a wide variety of different substrates. These toxins have been implicated in a wide range of acute diseases in man and animals. Their toxic effects include oesophageal cancer and liver diseases in humans, and carcinogenic effects in experimental rats and poultry. Hence, there is a need to monitor toxin levels in food commodities. / M