Remyelination is a regenerative process that occurs through the formation of myelin sheaths by oligodendrocytes, which are recruited as oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) after demyelination in diseases such as Multiple Sclerosis (MS).A key environmental factor regulating OPC differentiation is the fate of myelin debris generated during demyelination. Myelin debris contains inhibitors of OPC differentiation and thus its clearance by phagocytic macrophages is an important component of creating a lesion environment conducive to remyelination. The efficiency of debris clearance declines with age, contributing to the age-associated decline in remyelination. Therefore, understanding the mechanisms of the age-related decline in myelin debris phagocytosis is important for devising means to therapeutically reverse the decline in remyelination. The aim of this study was to determine the functional/molecular differences between young and old phagocytes involved in myelin debris clearance, thereby identifying therapeutically modifiable pathways associated with efficient myelin debris phagocytosis. In this study, we show that expression of genes involved in the retinoid X receptor (RXR) and peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) pathways are decreased with ageing in both myelin-phagocytosing human monocytes and mouse macrophages. Disruption of RXR and PPAR using synthetic antagonists in young macrophages mimics ageing by reducing myelin debris uptake. Macrophage-specific RXR? knockout mice revealed that loss of RXR function in young mice caused delayed myelin debris uptake and slowed remyelination. Alternatively, receptor agonists partially restored myelin debris phagocytosis in aged macrophages. The FDA-approved agonists bexarotene and pioglitazone, when used in concentrations achievable in human subjects, caused a reversion of the gene expression profiles in MS patient monocytes to a more youthful profile and enhanced myelin debris phagocytosis by patient cells. Activation of these pathways also enhances immunoregulatory markers on monocytes from MS patients, further suggesting the regeneration-promoting capacity of activating these pathways in phagocytes. These results reveal the RXR/PPAR pathway as a positive regulator of myelin debris clearance and a key player in the age-related decline in remyelination that may be targeted by available or newly-developed therapeutics.

Les cellules gliales qui forment les segments de myéline du système nerveux périphérique (SNP) sont appelées cellules de Schwann. Elles assurent aux nerfs un soutien fonctionnel et permettent une conduction rapide et efficace de l'influx nerveux. Cette fonction requiert une communication réciproque entre les neurones et les cellules gliales qui les entourent. Une perturbation de cette interaction entraine le plus souvent une situation pathologique comme les neuropathies périphériques dont la plus connue est la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Cependant, les mécanismes qui conduisent à ces pathologies sont encore peu connus et leur compréhension demande au préalable l'élucidation des mécanismes physiologiques qui contrôlent le développement du SNP. Ce travail a consisté en l'analyse de nouvelles fonctions des gènes ndrg4 et elmo1, dans le développement du système nerveux périphérique, chez le poisson zèbre. Nous avons montré que ndrg4 (n-myc downstream regulated gene) est un facteur neuronal qui régule le développement de la myéline périphérique en contrôlant le regroupement des canaux sodiques aux nœuds de Ranvier et l'expression de la mbp. Ndrg4 semble moduler l'échange vésiculaire entre les axones et les cellules de Schwann, en contrôlant l'expression de certaines protéines de relargage vésiculaire comme SNAP25, membre du complexe SNARE.Ce travail décrit par ailleurs une nouvelle fonction de elmo1 (engulfment and cell motility 1) dans le développement du SNP du poisson zèbre, où il favorise la survie des neurones dans lesquels il est exprimé. Nous avons montré qu'elmo1 protège les neurones de l'apoptose et que cette fonction est contrôlée par la voie nétrine1/unc5b en amont de Rac1. De ce fait, elmo1 est requis pour le développement du ganglion de la ligne latérale postérieure et des axones qui en émergent pour donner un système nerveux fonctionnel. Ainsi, ces travaux contribuent à une meilleure connaissance du développement du SNP et élucident pour la première fois une nouvelle voie de signalisation requise pour la survie des neurones dans le SNP. / The glial cells that form myelin segments in the peripheral nervous system (PNS) are called Schwann cells (SCs). They provide functional support for nerves and allow a fast and efficient conduction of the action potentials. This requires a bilateral communication between axons and the associated glial cells. Disruption of this interaction often leads to peripheral neuropathies e.g. Charcot-Marie-Tooth disease. However, the mechanisms underlying these diseases remain poorly known and their understanding requires, at first, the elucidation of the physiological mechanisms responsible for PNS development. This work consists of a functional analysis of two genes, ndrg4 and elmo1, in the PNS development, using the zebrafish model. We showed that the neuronal factor ndrg4 (n-myc downstream regulated gene 4) regulates nodes of Ranvier organization and mbp expression along the Posterior Lateral Line nerve (PLLn). This is achieved, most likely, by the ability of ndrg4 to modulate vesicular exchange between axons and SCs. Indeed, the expression of some key proteins involved in vesicle docking and release such as SNAP25, a member of the SNARE complex, are significantly dependent on ndrg4.Moreover, this work describes a novel role for neuronal elmo1 (engulfment and cell motility 1) in PNS development by promoting neuronal survival within the PLL ganglion. We showed that elmo1 has protective role against apoptosis and that its function is controlled by the netrin1/unc5b signalling upstream of Rac1 and independently of macrophages role in apoptotic clearance. Therefore, elmo1 is required for the proper development of the PLL ganglion and the axonal development of the PLLn. Thus, this study further contributes to our understanding of PNS development and unravels a novel molecular pathway required for neuronal survival in the PNS.

Au cours des dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans la prévention des épisodes de démyélinisation qui surviennent au cours de la sclérose en plaques, mais beaucoup moins dans le domaine de la régénération de la myéline détruite. Notre équipe a précédemment démontré que la protéine Sonic Hedgehog (Shh) est un régulateur positif des progéniteurs oligodendrocytaires favorisant la réparation de la myéline dans un modèle de démyélinisation induite par injection focale de lysolécithine dans le corps calleux chez la souris. Cependant, les mécanismes moléculaires mis en jeu restent encore largement méconnus. Mon projet de thèse consiste à explorer le rôle d'un co-récepteur de Shh, Boc, une glycoprotéine reliée aux molécules d'adhésion cellulaire (CAM) et fortement induite à l’issue d’une démyélinisation. Dans un premier temps, nous avons focalisé nos investigations sur la caractérisation du mutant Boc knockout au cours de la myélinisation développementale. Nos résultats révèlent des activités région et temps spécifiques de Boc sur les mécanismes de prolifération et de maturation des progéniteurs oligodendrocytaires. De plus, les souris Boc knockout présentent un phénotype d’hypermyélinisation qui apparaît au cours des premières semaines post-natales et persiste à l’âge adulte.Dans un second temps, nous avons déterminé l'effet de l'absence de Boc sur les processus de démyélinisation et de réparation de la myéline. En utilisant le modèle d’injection focale de lysolécithine dans le corps calleux, nous avons démontré un retard dans la maturation des progéniteurs oligodendrocytaires et une réduction de la régression des lésions chez les souris dépourvues de Boc.Nos résultats indiquent ainsi un rôle positif de Boc dans le processus de régénération faisant suite à une démyélinisation. Par ailleurs, l’absence de Boc diminue la réaction gliale inflammatoire étroitement associée au mécanisme de régénération de la myéline. L’ensemble de nos résultats indique une activité différente du récepteur au cours des processus de myélinisation et de remyélinisation du système nerveux central. Ces données originales contribuent à la caractérisation d’une composante de la signalisation Hedgehog impliquée dans le processus régénératif associé aux pathologies démyélinisantes. Ces résultats seront importants à considérer dans le cadre de l’approche thérapeutique des maladies démyélinisantes. / During the last years, significant progress have been made in preventing demyelinating events that occur during multiple sclerosis, but much less in the field of regeneration of the lost myelin. Our team has previously demonstrated that the Sonic Hedgehog (Shh) protein is a positive regulator of oligodendrocyte progenitors enhancing myelin repair in a demyelination model relying on the focal injection of lysolecithin into the corpus callosum. However, the molecular mechanisms that are involved are still largely unknown. My thesis project was aimed at exploring the role of a co-receptor of Shh, Boc, a glycoprotein linked to the cell adhesion molecules (CAM) and strongly induced during myelin repair. First, we focused our investigations on the characterization of the Boc knockout mutant during developmental myelination. Our results reveal region and time specific activities for Boc in the mechanisms of proliferation and maturation of oligodendrocyte progenitors. In addition, Boc knockout mice exhibit hypermyelination that occurs in the firstpostnatal weeks and persists until adulthood In a second step, we determined the effect of the absence of Boc in the processes of demyelination and myelin repair. Using the model of focal injection of lysolecithin into the corpus callosum, we demonstrated a delay in oligodendrocyte maturation and a decrease in lesion regression in the Boc knockout mice. Thus, our results indicate a positive role for Boc in the regeneration process following demyelination.Furthermore, the absence of Boc decreases the inflammatory glial reaction closely associated with myelin repair. Altogether, our results indicate a different activity of the receptor during the processes of myelination and remyelination in the central nervous system. These original data contribute to the characterization of a component of the Hedgehog signaling pathway involved in the regenerative process associated with demyelinating pathologies.Those results will be important to consider in the context of the therapeutic approach of the demyelinating diseases.

Au cours des maladies démyélinisantes du système nerveux central (SNC), les gaines de myéline qui entourent les axones et contribuent à la rapidité de la conduction nerveuse, mais aussi les oligodendrocytes qui synthétisent la myéline sont détruits. C’est le cas dans la plus commune de ces pathologies, la sclérose en plaques, qui se caractérise par des épisodes inflammatoires et démyélinisants récurrents évoluant après quelques années vers une forme progressive secondaire. A l’heure actuelle, les traitements disponibles pour les patients sont essentiellement de type immunomodulateurs. Ces molécules sont efficaces pour réduire la fréquence des épisodes démyélinisants, mais elles sont dépourvues d’activité sur la forme progressive de la maladie. Juste avant que ne débute mon travail de thèse, les voies de signalisation respectivement induites par les protéines Hedgehog et les stéroïdes de type androgènes se sont révélées être des régulateurs positifs de la réparation de la myéline vraisemblablement en utilisant des mécanismes différents. A partir de ces découvertes, nous avons émis l’hypothèse que la modulation pharmacologique simultanée des deux voies pourrait être intéressante dans une perspective thérapeutique. En utilisant des cultures de cellules gliales mixtes ou en administrant ces modulateurs à des souriceaux nouveau-nés, nous avons d’abord montré l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les deux voies au cours du développement physiologique de la myéline à la période post-natale précoce. De façon intéressante, le blocage de la signalisation Hedgehog est requis pour que les androgènes puissent jouer leur rôle dans le processus de myélinisation. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la communication entre les deux voies sont apparemment indépendants de la régulation de la transcription du principal effecteur de la signalisation Hedgehog (Gli1), ainsi que de celle du récepteur nucléaire des androgènes (AR). Par ailleurs, l’administration de ces mêmes modulateurs à des animaux ayant subi une démyélinisation du SNC nous a permis de mettre en évidence un effet synergique des deux voies sur la régénération de la myéline, la résolution de l’inflammation et la récupération fonctionnelle. Ces résultats seront importants à considérer dans le contexte d’une nouvelle approche thérapeutique des maladies démyélinisantes. / During demyelinating diseases of the central nervous system (CNS), the myelin sheaths that surround the axons and contribute to nervous conduction velocity, but also the oligodendrocytes that synthesize myelin are lost. This is particularly true in multiple sclerosis, the most common of those pathologies, which is characterized by recurrent inflammatory and demyelinating attacks evolving after several years into a secondary progressive form. Presently, the treatment of patients mostly relies on the use of immunomodulators, which are successful in decreasing the frequency of the attacks. However, these molecules lead to poor results in the progressive form of the disease. Just before the beginning of my PhD, the Hedgehog and androgen signaling pathways have been identified as positive regulators of myelin repair likely by using different mechanisms. On the basis of these findings, we hypothesized that a combination therapy using pharmacological modulators of each of these pathways could be interesting from a therapeutic point of view. By using primary mixed glial cell cultures and in vivo administration of the modulators to early postnatal mice, we have shown that the Hedgehog and androgen signaling pathways functionally interact during the physiological development of myelin at the early postnatal period. Importantly, the blockade of the Hedgehog signaling is required to allow androgen to play their role in the myelination process. The molecular mechanisms implicated in the pathway crosstalk do not involve the transcriptional regulation of the main effector of Hedgehog signaling (Gli1) or the nuclear androgen receptor (AR). Moreover, the same modulators administered into demyelinated animals led us to demonstrate a synergetic effect both on myelin repair, inflammation resolution and functional recovery. These results should be considered in the context of a novel therapeutic approach of demyelinating diseases.

In recent years there has been a considerable research effort in improving the specificity of magnetic resonance imaging (MRI) techniques by employing quantitative methods. These methods offer greater reproducibility over traditional acquisitions, and hold the potential for obtaining improved information at the microstructural level. However, they typically require a longer duration for the experiments as the quantitative information is often obtained from multiple acquisitions. Here, a multi-echo extension of the MP2RAGE pulse sequence for the simultaneous mapping of T1, T2* (and magnetic susceptibility) is introduced, optimized and validated. This acquisition technique can be faster than the separate acquisition of T1 and T2*, and has the advantage of producing intrinsically co-localized maps. This is helpful in reducing the preprocessing complexity, but most importantly it removes the need for image alignment (registration) which is shown to introduce significant bias in quantitative MRI maps. One of the reasons why the knowledge of T1 and T2* is of relevance in neuroscience is because their reciprocal, R1 and R2*, have been shown to predict quantitatively myelin and iron content in ex vivo experiments using a linear model of relaxation. However, the post-mortem results cannot be applied directly to the in vivo case. Therefore, an adaptation of the linear relaxation model to the in vivo case is proposed. This is capable of predicting (with some limitations) the myelin and iron contents of the brain under in vivo conditions, by using prior knowledge from the literature to calibrate the linear coefficients. The dependence of the relaxation parameters from the biochemical composition in brain tissues is further explored with ex vivo experiments. In particular, the hyaluronan component of the extracellular matrix is investigated. The contribution to T1 and T2* is measured with a sophisticated experiments that allow for a greater control over experimental conditions compared to a typical MRI experiment. The result indicate a small but appreciable contribution of hyaluronan to the relaxation parameters. In conclusion, this work develops a method for measuring T1 and T2* maps simultaneously. These are then used to quantify myelin and iron under in vivo conditions using a linear model of relaxation. In parallel, the hyaluronan-based extracellular matrix was shown to be a marginal but measurable component in T1 and T2* relaxation maps in ex vivo experiments.

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(薬学) / 甲第23147号 / 薬博第847号 / 新制||薬||242(附属図書館) / 京都大学大学院薬学研究科薬学専攻 / (主査)教授 中山 和久, 教授 土居 雅夫, 准教授 中川 貴之 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM

Die schnelle, sog. Saltatorische Erregungsleitung bei den Vertebraten wird durch eine kompakte, um das Axon gewickelte isolierende Schicht, dem Myelin, ermöglicht. Diese Myelinhülle wird von spezialisierten Gliazellen gebildet. Bei der Myelinisisierung wickeln sich deren abgeflachte Membranfortsätze mehrfach konzentrisch um die Axone und bilden nach Verdichtung die typische kompakte, multi-lammelare Struktur des Myelins. Innerhalb dieser Struktur unterscheidet man zwei unterschiedliche Bereiche: Die aus der extrazellulären Apposition gebildete Intraperiod Line und die aus der cytosolischen Apposition gebildete Major Dense Line . Ausschließlich innerhalb der Major Dense Line des ZNS der Fische findet man ein Protein, das nach seinem Molekulargewicht als 36K bezeichnet wird. Es ist nicht glykolisiert und scheint mit der Myelinmembran assoziiert zu sein. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass 36K mit keinem der polyklonalen Antikörper gegen eines der bekannten Myelinproteine reagierte. Ebenso zeigten erste Datenbank-Analysen überraschenderweise keine Homologien zu den Myelinproteinen, sondern zu den NAD(P)(H)-abhängigen Oxidoreduktasen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde versucht über einen Dehydrogenase-Assay sowohl eine entsprechende Aktivität als auch ein mögliches Substrat zu identifizieren. Alternativ wurde für das membranassoziierte 36K, das neben IP1 & 2 und Basischen Myelinprotein (MBP) eines der Hauptmyelinproteine im ZNS der Fische darstellt, eine Funktion als Strukturprotein innerhalb der Major Dense Line vermutet. Aufgrund der Sequenzähnlichkeiten von 36K zu den NAD(P)(H)-abhängigen Oxidoreduktasen wurde dabei auch die Beeinflussbarkeit durch Nukleotide geprüft. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Dissertation erstmals versucht, Protein-Komplexe aus dem ZNS-Myelin nativ aufzutrennen und deren Komponenten zu identifizieren.

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