A síndrome mielodisplásica (SMD) é uma doença hematológica heterogênea, caracterizada por hematopoese anormal, displasia e instabilidade genômica, portanto, a análise citogenética é determinante no diagnóstico, prognóstico e acompanhamento evolutivo da doença. Considerando que as células hematopoéticas (CHs) e as estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) estão em estreita associação, estudos que visem à caracterização destas poderão contribuir para elucidar os mecanismos que governam a progressão tumoral e identificar novos alvos terapêuticos. Objetivo: Caracterizar e comparar as CHs e CTMs derivadas de pacientes através da citogenética convencional e molecular para os genes aurora cinase A e B. Avaliar as propriedades biológicas das CTMs derivadas de SMD e controles saudáveis. Métodos: o estudo iniciou-se com a avaliação clinica de 25 pacientes e 8 controles saudáveis doo HCFMRP-USP e HAC-Jaú. Em seguida, foi realizada a análise cariótipica das CHs e CTMs da medula óssea pelo bandamento G e por FISH para os genes aurora A e B e o perfil imunofenotípico, bem como potencial de diferenciação em adipócito e osteócito das CTMs de pacientes portadores de SMD e controles saudáveis. Resultados: A avaliação clínica mostrou plaquetopenia (76%), neutropenia (100%), hemoglobina baixa (16%). A análise citogenética das CHs revelou cariótipo alterado em 13 pacientes (52%), com cariótipo complexo resultando em alterações numéricas e estruturais. Ao contrário, nas CTMs, o cariótipo se mostrou alterado em sete pacientes (28%) e um padrão de menor complexidade, apenas quatro pacientes apresentaram alterações nas duas populações celulares, porém, diferentes. Foram encontradas apenas alterações numéricas (sendo 86% monossomia e 14% ganho de cromossomo). As CHs e CTMs dos controles apresentaram cariótipos 100% normais. Na análise de FISH não foi evidenciada amplificação dos genes AURKA e AURKB. As CTMs dos pacientes e controles apresentaram-se semelhantes quanto à morfologia e potencial de diferenciação. Entretanto, as CTMs de pacientes mostraram-se alteradas para dois antígenos de superfície, CD90 e CD146, os quais mostraram níveis de expressão mais elevados nas amostras dos pacientes (p= 0,04, p = 0,001 respectivamente). Conclusão: Observou-se que as CTMs se encontram alteradas embora em menor frequência e diferindo das alterações encontradas nas CHs. Esses dados sugerem que as CTMs devem exercer importante papel na progressão tumoral e devem ser consideradas como alvos na busca de novas terapias e melhor esclarecimento dos mecanismos que governam a progressão tumoral. Apesar de não ter evidenciado amplificação dos genes AURKA e AURKB em SMD, estudos futuros que visem avaliar o nível de expressão dessas enzimas em pacientes portadores ou não de alterações citogenéticas poderão contribuir para a compreensão do envolvimento ou não desse gene com a evolução da doença. Além disso, não foi evidenciada associação de anemia profunda e citogenética alterada. / The myelodysplastic syndrome (MDS) is a heterogeneous hematologic disease characterized by abnormal hematopoiesis, dysplasia and genomic instability, therefore, cytogenetic analysis is crucial in the diagnosis, prognosis and monitoring of disease evolution. Whereas hematopoietic cells (CHs) and stromal multipotent mesenchymal (MSCs) are in close association studies aimed at the characterization of these may help to elucidate the mechanisms that govern tumor progression and identify novel therapeutic targets. Objective: To characterize and compare the CHs and MSCs derived from patients by conventional cytogenetics and molecular genes aurora kinase A and B. To evaluate the biological properties of MSCs derived from MDS and healthy controls. Methods: The study began with the clinical evaluation of 25 patients and eight healthy controls HCFMRP dooUSP and CH-Jau. Next, we performed a karyotypic analysis of CHs and MSCs from bone marrow by G-banding and FISH for aurora A and B genes and immunophenotypic profile and potential to differentiate into adipocytes and osteocytes of MSCs in patients with MDS and controls healthy. Results: The clinical evaluation showed thrombocytopenia (76%), neutropenia (100%), low hemoglobin (16%). The cytogenetic analysis revealed karyotype of CHs changed in 13 patients (52%), resulting in complex karyotype with numerical and structural changes. In contrast, in MSC, the karyotype was abnormal in seven patients (28%) and a pattern of lower complexity, only four patients had changes in both cell populations, however, different. Were found only numerical changes (monosomy being 86% and 14% gain in chromosome). The CHs and MSCs controls showed 100% normal karyotypes. In FISH analysis there was no evidence of gene amplification and AURKA AURKB. The MSCs of patients and controls were similar regarding the morphology and differentiation potential. However, the CTMs of patients proved to be changed to two surface antigens, CD90 and CD146, which showed higher expression levels in samples of patients (p = 0.04, p = 0.001 respectively). Conclusion: Furthermore, it was observed that the MSCs are changed although less frequently and differing from changes found in CHs. These data suggest that MSCs should play an important role in tumor progression and should be considered as targets in the search for new therapies and better explain the mechanisms that govern tumor progression. Although not shown AURKA amplification of genes in MDS and AURKB, future studies aimed at assessing the level of expression of these enzymes in patients with or without cytogenetic alterations may contribute to the understanding of the involvement or not of this gene with the disease. This study can not associate with profound anemia cytogenetic changes.

Orientador: Fabíola Traina / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T22:39:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scopim-Ribeiro_Renata_M.pdf: 3643524 bytes, checksum: fec865c6ccea452efda050e40c6f1aa1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As neoplasias mieloides compreendem um grupo heterogêneo de doenças hematológicas que se originam de um precursor mieloide comum, em diferentes fases de diferenciação. As alterações celulares que levam ao desenvolvimento de neoplasias podem ocorrer através de mecanismos epigenéticos ou de alterações genéticas. DNMT3A codifica metiltransferases que adicionam grupamentos metil a resíduos de citosina do DNA e TET2 promove a hidroxilação da citosina metilada, o que os caracteriza como elementos importantes no controle epigenético. DNMT3A e TET2 encontram-se frequentemente mutados em neoplasias mieloides, mas o impacto prognóstico destas mutações ainda é controverso. A consequência funcional da mutação de DNMT3A em neoplasias mieloides ainda não foi definida, mas o silenciamento da proteína em células progenitoras murinas favorece a autorrenovação e compromete a diferenciação celular. A mutação de TET2 tem como consequência a perda de função do gene e participa da transformação neoplásica das células mieloides, favorecendo a proliferação da série mielomonocítica. Entretanto, a expressão de TET2 e DNMT3A nestas doenças ainda é pouco elucidada. Assim, os objetivos deste estudo foram (1) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A em células hematopoéticas de indivíduos normais e pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA), (2) correlacionar a expressão de TET2 e DNMT3A com o fenótipo clínico e sobrevida de pacientes com SMD; (3) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A durante a diferenciação celular hematopoética e (4) avaliar o efeito do silenciamento de DNMT3A no fenótipo de linhagens celulares leucêmicas. No presente estudo, verificamos redução na expressão de TET2 em células provenientes de pacientes com SMD e LMA quando comparada à expressão em controles normais (p<.001), e redução em SMD alto risco quando comparada à SMD baixo risco (p=.02). Os resultados em amostras sequenciais de cinco pacientes com SMD indicaram redução da expressão de TET2 no momento da progressão da doença. A análise univariada evidenciou que fatores clínicos tiveram impacto tanto na sobrevida livre de evento como sobrevida global, incluindo a classificação de risco pela OMS 2008 (alto vs. baixo, p<.0001), IPSS (int-2/alto vs. baixo/int-1, p<.0001), hemoglobina (<10 vs. ? 10, p<.05), contagem de leucócitos (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), contagem absoluta de neutrófilos (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) e porcentagem de blastos na medula óssea (? 5 vs. <5 ou ? 10 vs. <10, p<.0004). Além disso, a baixa expressão de TET2 teve impacto negativo na sobrevida livre de evento (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) e na sobrevida global (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). A análise multivariada indicou que a baixa expressão de TET2 (p <.0001), IPSS alto/intermediate-2 (p <.0001), e hemoglobina <10 g/dL (P<.03) são fatores prognósticos para menor sobrevida livre de evento e sobrevida global. Durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD, observamos um aumento significativo da expressão de TET2 (p=. 03). Na avaliação da diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo na expressão de TET2 durante as diferenciações granulocítica (p=.04) e megacariocítica (p=.03); e um aumento não significativo durante a diferenciação eritrocítica. A expressão de DNMT3A foi semelhante entre pacientes com LMA, SMD e controles normais, e não teve impacto significativo na sobrevida dos pacientes com SMD. A expressão de DNMT3A não foi modulada durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD. Nos modelos de diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo da expressão de DNMT3A durante a diferenciação granulocítica, mas não durante a diferenciação eritrocítica e megacariocítica. A redução na expressão de DNMT3A não resultou em alteração significativa na apoptose, na proliferação e no ciclo celular em linhagens leucêmicas HL60 e U937. A expressão gênica e proteica de PTEN não foi modulada em células leucêmicas submetidas à inibição de DNMT3A. Os achados aqui descritos sugerem que, similarmente à presença de mutação no TET2, a baixa expressão de TET2 pode participar do processo de transformação celular em SMD de alto risco e LMA; estudos clínicos deveriam considerar a investigação da expressão gênica de TET2 em conjunto com a pesquisa de mutação TET2 na definição de prognóstico. Os resultados de expressão e função de DNMT3A sugerem que a mutação, e não a expressão, deva ser o principal mecanismo pelo qual o DNMT3A participa da transformação neoplásica e que a função de DNMT3A pode depender da linhagem celular estudada / Abstract: Myeloid neoplasms comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies that originate from a common myeloid precursor at different stages of differentiation. Cellular changes that lead to development of malignancies may occur through epigenetic mechanisms or genetic alterations. DNMT3A encodes methyltransferases that add methyl groups to cytosine residues in DNA, TET2 promotes hydroxylation of methylated cytosine, and both proteins are important elements in epigenetic control. TET2 and DNMT3A are recurrently mutated in myeloid malignancies, but the prognostic consequence of TET2 and DNMT3A mutation is still controversial. The functional consequences of DNMT3A mutation has not been defined, but the protein silencing in murine progenitor cells promotes self-renewal and reduces cell differentiation. TET2 mutation results in loss of function and participates in the neoplastic transformation of myeloid cells, favoring the proliferation of granulomonocytic cells. However, the expression of TET2 and DNMT3A in these diseases has been rarely addressed. Then, the aims of this study were (1) to evaluate TET2 and DNMT3A gene expression in hematopoietic cells from healthy individuals and from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and acute myeloid leukemia (AML); (2) to correlate TET2 and DNMT3A expression with clinical phenotype and outcomes of MDS patients; (3) to investigate TET2 and DNMT3A expression during hematopoietic cell differentiation; and (4) to evaluate the effect of DNMT3A silencing in the phenotype of leukemia cell lines. In this study, the expression of TET2 was decreased in cells from patients with MDS and AML compared to healthy donors (p<.001) and reduced high-risk MDS compared to low risk MDS (p=.02). The results in sequential samples from five patients with MDS indicate reduced expression of TET2 at the time of disease progression. By univariate analysis, clinical factors that significantly affected both event free survival (EFS) and overall survival (OS) included risk stratification by WHO 2008 (high vs. low, p<.0001), IPSS (int-2/high vs. low/int-1, p <.0001), hemoglobin (<10 vs. ? 10, p<.05), white blood cell counts (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), absolute neutrophil counts (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) and bone marrow blast percentage (? 5 vs. <5 or ? 10 vs. <10, p<.0004). Furthermore, low TET2 expression negatively impacted both EFS (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) and OS (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). Multivariate analyses indicated that low TET2 expression (p <.0001), along with IPSS high/intermediate-2 risk group (p <.0001), and hemoglobin <10 g/dL (p<.03) were independently prognostic for worse EFS and OS. During erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with low-risk MDS, we observed an increased expression of TET2 (p=.03). During cell differentiation of leukemic cell lines, we observed a significantly increase in the expression of TET2 during granulocytic and megakaryocytic differentiation (p=.04 and p=.03, respectively); there was also an increased expression during erythrocytic differentiation, but this was not statistically significant. The expression of DNMT3A was similar between patients with AML, MDS and healthy donors, and it did not impact survival outcomes in MDS patients. DNMT3A expression was not modulated during erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with MDS. In leukemic cell lines models of differentiation, we observed a significantly increase in the DNMT3A expression during granulocytic differentiation, but not in erythrocytic and megakaryocytic differentiation. The DNMT3A silencing did not result in significant changes in apoptosis, proliferation and cell cycle in leukemic cell lines HL60 and U937. PTEN gene and protein expression was not modulated in leukemic cell lines submitted to inhibition of DNMT3A. The findings reported here suggest that, similarly to the presence of TET2 mutations, the low expression of TET2 can participate in the process of cell transformation in high risk MDS and AML. Clinical studies should consider the investigation of TET2 expression together with the studies of TET2 mutation to defining prognosis. Our results of expression and function suggest that DNMT3A mutation, instead of the expression, should be the main mechanism by which DNMT3A participates in neoplastic transformation and that DNMT3A function may vary according to the cell line studied / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

Orientador: Irene Gyongyver Heidemarie Lorand Metze / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis-Alves_SuiellenCarvalho_D.pdf: 1989355 bytes, checksum: c49ffc9bdc49263faef580e3f36d751a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A imunofenotipagem é reconhecida como uma importante ferramenta para o diagnóstico das síndromes mielodisplásicas (SMD). O sistema de pontuação por citometria de fluxo descrito recentemente (FCSS) é útil para o diagnóstico diferencial, bem como para o prognóstico de SMD. Avaliamos se a inclusão de valores quantitativos de expressões anormais em células CD34+ e monócitos nesta pontuação poderia melhorar o seu valor diagnóstico. O FCSS modificado (FCSS -R) abrange 9 alterações granulocíticas, 8 monocíticas e 6 de células CD34+. A análise imunofenotípica foi realizada em células de medula óssea (MO) de 56 pacientes com SMD (76% com blastos na medula óssea <5%), 33 casos de citopenias reacionais e 41 doadores de medula óssea saudáveis de transplante alogênico (controles normais). As duas pontuações foram aplicadas em todos os casos. Embora tenhamos encontrado o desvio à esquerda assíncrono na maturação dos granulócitos, a diminuição das hematogônias e o aumento de monócitos CD16+, bem como casos isolados de co-expressões anormais no amadurecimento de precursores mielomonocíticos em citopenias reacionais, alterações qualitativas e quantitativas nos sub tipos de células mielóides CD34+ foram mais específicas de SMD. Ambas as pontuações permitiram discriminar SMD de citopenias reacionais, mas, de acordo com a área sob a curva ROC, o FCSS -R foi mais sensível (53% para FCSS e 94% para FCSS -R). Ambas as pontuações apresentaram especificidade de 100%. A inclusão de valores quantitativos de expressões anormais nas células CD34+ e monócitos em FCSS melhorou a sensibilidade de FCSS-R para o diagnóstico diferencial entre SMD e citopenias periféricas reacionias / Abstract: Immunophenotyping has been recognized as an important tool for diagnosis of myelodysplastic syndromes (MDS). The recently described flow cytometry scoring system (FCSS) is useful for the differential diagnosis as well as prognosis of MDS. We examined if the inclusion of quantitative values of abnormal expressions in CD34+ cells and monocytes in this score could improve its diagnostic value. The modified FCSS (FCSS-R) covers 9 granulocytic, 8 monocytic and 6 CD34+ cell abnormalities. Immunophenotypic analyzes were performed on bone marrow (BM) cells of 56 patients with MDS (76% with bone marrow blasts <5%), 33 cases of reactive cytopenias and 41 healthy bone marrow donors for allogeneic BM transplantation (normal controls). The two scores were applied in all cases. Although asynchronous shift to the left in the maturing granulocytes, decrease in hematogones and increase in CD16+ monocytes as well as isolated cases of abnormal co-expressions in maturing myelomonocytic precursors could be found in reactive PB cytopenias, the most important differences with MDS were seen in the subsets of myeloid CD34+ cells. Both scores allowed to discriminate MDS from reactive cytopenias, but, according to the area under the ROC curve FCSS-R was more sensitive (53% for FCSS and 94% for FCSS-R). Both scores had a specificity of 100%. The inclusion of quantitative values of abnormal expressions in CD34+ cells and monocytes in FCSS improved the sensibility of FCSS for the differential diagnosis between MDS and reactive peripheral cytopenias / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T16:46:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Palodetto_Bruna_M.pdf: 1523635 bytes, checksum: 0dc5f0194b2dd973ee8eaeac9a384983 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo heterogêneo de doenças hematopoiéticas caracterizadas pela hematopoiese ineficaz resultando em citopenia no sangue periférico; cerca de 30% das SMDs evolui para leucemia mielóide aguda secundária. Leucemias agudas (LA) são doenças malignas do sangue caracterizadas por acúmulo de blastos podendo ser classificadas em mielóide agudas (LMA), quando há envolvimento de mieloblastos, ou linfóides agudas (LLA), quando há envolvimento de linfoblastos. A sobrevida média dos pacientes com leucemia aguda ainda é muito baixa e muitos deles são resistentes ao tratamento ou apresentam recaída. O melhor entendimento sobre os mecanismos de progressão da mielodisplasia e da resposta ao tratamento em leucemias agudas poderia melhorar a taxa de resposta ao tratamento e aumentar a sobrevida dos pacientes. O metabolismo e o efluxo de drogas são mecanismos de defesa responsáveis pela proteção contra agentes tóxicos e estão envolvidos na biotransformação de diversos xenobióticos. O metabolismo de drogas pode ser divido em duas fases (Fase I: Oxidação; Fase II: Conjugação), sendo ambas mediadas por enzimas metabolizadoras de drogas. O efluxo de drogas é outro mecanismo de proteção contra tóxicos, similar ao metabolismo de drogas, porém mediado por proteínas de membrana. Essas proteínas são polimórficas e esses polimorfismos alteram a atividade enzimática, podendo modificar a resposta ao tratamento e a sua resistência. O gene CYP2B6 codifica uma enzima da fase I do metabolismo responsável pela ativação dos fármacos. Esse gene possui o polimorfismo G15631T onde há troca do aminoácido (Gln172His) resultando em perda da atividade enzimática. Os genes GSTM1, GSTT1 e NQO1 codificam enzimas da fase II do metabolismo, responsáveis pela conjugação com outras substâncias para facilitar a excreção. Os genes GSTM1 e GSTT1 possuem um polimorfismo que causa deleção homozigota do gene; e o gene NQO1 possui o polimorfismo C609T que resulta em troca do aminoácido codificado (Pro187Ser). Esses polimorfismos levam a perda da atividade enzimática. O gene MDR-1 codifica a P-glicoproteína que é uma proteína de membrana responsável pelo efluxo de drogas. Esse gene possui o polimorfismo C3435T que apesar de ser silencioso (Ile1142Ile) diminui a expressão de P-glicoproteína. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar a influência dos polimorfismos CYP2B6 G15631T, GSTT1, GSTM1, NQO1 C609T e MDR-1 C3435T no risco de leucemias agudas e SMD, na progressão de SMD e resposta ao tratamento de leucemia aguda. Foram analisados 90 pacientes com leucemia aguda (66 LMA e 24 LLA), 68 pacientes com SMD e 100 controles normais utilizando os métodos de PCR-RFLP e Multiplex. Não houve diferença estatística na freqüência dos polimorfismos entre pacientes e grupo controle. Em SMD encontramos maior frequência de deleções de GST em pacientes que progrediram comparados aos pacientes que não progrediram: 50% e 21% (P=0,019). Também encontramos menor frequência do alelo polimórfico T do polimorfismo MDR-1 C3435T em pacientes que progrediram comparada a dos pacientes que não progrediram: 50% e 81% (P=0,012). Na resposta ao tratamento de leucemias agudas, encontramos uma tendência à maior frequência do polimorfismo NQO1 C609T em pacientes com falha de indução quando comparados a pacientes com remissão em leucemias agudas, em geral, (P=0,093) e pacientes somente com LMA (P=0,125); e quando comparamos falha de indução com o grupo controle em leucemias agudas, em geral, (P=0,101) e somente em LMA (P=0,08). Observamos a mesma tendência quando comparamos a frequência do polimorfismo NQO1 C609T em pacientes com óbito precoce versus a população normal (P=0,058). Em conclusão, estes resultados sugerem que os polimorfismos não estão relacionados ao risco de leucemia aguda e SMD, embora a amostra aqui analisada possa ter sido insuficiente; as deleções GST e o polimorfismo MDR-1 C3435T estão envolvidos na progressão de SMD e o polimorfismo NQO1 C609T tem uma tendência a estar relacionado à falha de indução e ao óbito precoce em pacientes com leucemias agudas, em geral, e somente LMA / Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of hematopoietic disorders characterized by ineffective hematopoiesis resulting in peripheral blood cytopenia, about 30% of MDS patients progresses to acute myeloid leukemia. Acute leukemia (AL) are malignant blood diseases characterized by accumulation of blasts and they can be classified into acute myeloid (AML), when there is myeloblasts involvement or acute lymphoid (ALL), when there is lymphoblasts involvement. The median survival of acute leukemia patients is very low and many of them are resistant to treatment or relapsed. The better understanding of the myelodysplasia progression mechanisms and the acute leukemia response to treatment could improve the treatment response rate and patients survival. The metabolism and drug efflux are defense mechanisms responsible for protection against toxic agents and are involved in the biotransformation of various xenobiotics. The drug metabolism can be divided into two phases (Phase I: Oxidation; Phase II: Conjugation), both being mediated by drug metabolizing enzymes. The drug efflux is a similar mechanism of protection but is mediated by membrane proteins. These enzymes are polymorphic and these polymorphisms alter the enzyme activity and may modify treatment response and resistance. The CYP2B6 gene encodes a phase I enzyme responsible for drug activation. This gene has the G15631T polymorphism where there is exchange of the amino acid (Gln172His) resulting in loss of enzyme activity. The GSTM1, GSTT1 and NQO1 genes encoding phase II metabolizing enzymes that are responsible for combining with other substances to facilitate drug excretion. GSTM1 and GSTT1 genes have a polymorphism that causes homozygous deletion of the gene; and the NQO1 gene has the C609T polymorphism that results in amino acid changes (Pro187Ser). These polymorphisms lead to loss of enzyme activity. The MDR-1 gene encodes P-glycoprotein (P-gp) which is a membrane protein responsible for drug efflux. This gene has the C3435T polymorphism that despite being silent (Ile1142Ile) leads to lower P-gp expression. The aim of this study was to identify the influence of CYP2B6 G15631T, GSTT1, GSTM1, NQO1 C609T and MDR-1 C3435T polymorphisms in acute leukemia and MDS risk, MDS progression and acute leukemia response to treatment. We analyzed 90 patients with acute leukemia (66 AML and 24 ALL), 68 MDS patients and 100 normal controls using the PCRRFLP and Multiplex methods. There was no statistical difference in the frequency of polymorphisms between patients and control group. In MDS we found higher frequency of GST deletions in patients who progressed compared to patients who did not progress: 50% and 21% (P = 0.019). We also found less frequently polymorphic allele T of MDR-1 C3435T polymorphism in patients who progressed compared to patients who did not progress: 50% and 81% (P = 0.012). In acute leukemia response to the treatment, we found a trend toward a higher frequency of NQO1 C609T polymorphism in patients with induction failure compared to patients in remission, with acute leukemia in general, (P = 0.093) and AML patients only (P = 0.125); and induction failure when compared with the control group in acute leukemia in general (P = 0.101) and only in AML patients (P = 0.08). We observed the same trend when comparing the frequency of NQO1 C609T polymorphism in patients with early death versus normal population (P = 0.058). In conclusion, these results suggest that theses polymorphisms are not related to acute leukemia and MDS risk, although the sample analyzed here may have been insufficient; GST deletions and MDR-1 C3435T polymorphism are involved in MDS progression and NQO1 C609T polymorphism has a tendency to be related to induction failure and early death in patients with acute leukemia, in general, and AML only / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Myelodysplastic syndrome (MDS) is a heterogeneous group of diseases characterized by ineffective hematopoiesis which is caused by damage of differentiation of pluripotent haematopoietic stem cells. TP53 gene mutations are identified approximately in 10% of MDS and represent a negative prognostic factor. Altered TP53 gene expression may have similar effect as the mutation. Mutations or deregulated expression of this gene have an impact on many cellular processes including apoptosis, DNA repair, cell growth and angiogenesis. In this work, the expression mRNA levels of genes involved in p53 signalling pathway were studied in CD34+ pluripotent haematopoietic cells from bone marrow of patients with low- risk MDS. MDS patients showed increased expression of genes involved in apoptosis induction, regulation of cell cycle and DNA repair (BAX, BBC3, CCNE1, CDC25A, CDKN1A, FAS, GADD45A) as compared to healthy subjects. The patients with TP53 mutation had decreased expression of apoptotic genes (BAX, PIDD, TRAF2) and increased gene expression of apoptotic inhibitor (BCL2A1), indicating a reduced activity of apoptotic pathways and that way the pathological cell clone may gain a growth advantage. Deregulation of 21 genes (BAX, BBC3, EGR1, KAT2B, MDM2 etc.) was observed in patients with del (5q) compared to...

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:19:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 XavierFerrucio_JulianaMartins_D.pdf: 4222784 bytes, checksum: e2845997ddb128f2d29a2cabc667da17 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A hematopoiese, processo pelo qual a célula-tronco hematopoiética (CTH) dá origem a todas as células do sangue, é regulada através do seu contato com diversos tipos celulares que compõem o estroma da medula óssea, mantendo o balanço entre autorrenovação e diferenciação das CTHs, processos também regulados por vias de sinalização como a via Hedgehog e proteínas reguladoras de citoesqueleto como RhoGTPases. Sendo assim, os objetivos gerais do trabalho foram investigar a via Hedgehog na medula óssea de pacientes com síndromes mielodisplásica (SMD) e a função da ARHGAP21 na autorrenovação das CTH. Através de imunohistoquímica de bióspias de medula óssea de pacientes com SMD em comparação com anemia megaloblástica (usada como controle) observamos o aumento de células marcadas para os ligantes Sonic e Dessert Hedgehog e células positivas para c-Kit nas amostras de SMD. Em seguida, analisamos a expressão gênica dos membros da via Hedgehog em células totais de medula óssea de pacientes SMD e doadores normais. Não houve diferença na expressão de Patched (PTCH) em SMD em comparação com doadores saudáveis, porém quando as amostras são classificadas de acordo com a WHO 2008, observamos aumento significativo de PTCH nos pacientes com <5% de blastos na medula óssea (AR, ARSA e CRDM). As expressões tanto de GLI1 como de SUFU foram reduzidas nos pacientes SMD e no grupo de pacientes com ARSA, CRDM e CRDU quando comparados aos doadores normais. A expressão de SUFU também foi reduzida em grupo de pacientes SMD com > 5% de blastos na medula óssea (AREB-1 e 2). Observamos aumento de 7 vezes na expressão de SMO no grupo de SMD e de 14 vezes no grupo AREB-1 e 2 em comparação com doadores normais. Análises de sobrevida de Cox demonstraram que o aumento na expressão de SMO e a redução na expressão de PTCH são fatores independentes na sobrevida global dos pacientes com SMD. Além disso, confirmamos o aumento da ativação da via Hedgehog em células CD34+ de pacientes com SMD através do aumento da expressão dos alvos da via: GLI1, BMI1 e Nanog. Nossos dados indicam que a via Hedgehog está desregulada na medula óssea dos pacientes com SMD e o possível envolvimento dessa via na progressão da doença. Através do modelo murino Arhgap21+/- estudamos a importância dessa proteína na hematopoiese normal e observamos que esses animais apresentam redução nas diferenciações eritroide e megacariocítica juntamente com aumento da mobilização mielóide. Observamos ainda o aumento na frequência das CTHs de curta e longa duração na medula óssea dos heterozigotos. Esse aumento foi responsável pela maior recuperação no número de neutrófilos após indução de estresse hematopoiético nos animais Arhgap21+/-. Durante o transplante seriado de células de medula óssea observamos menor reconstituição após 4 semanas, juntamente com menor reconstituição a longo prazo nos animais que receberam células dos heterozigotos, sugerindo menor autorrenovação das CTHs nas células com redução da Arhgap21. O nicho medular dos animais Arhgap21+/- demonstrou redução no suporte inicial da hematopoiese o que foi relacionado à maior produção de ROS após irradição subletal dos heterozigotos. Juntos, esses resultados indicam que a ARHGAP21 tem importante papel na hematopoiese normal, pois participa de processos como a diferenciação, mobilização e autorrenovação das CTHs / Abstract: Hematopoiesis is a process by which hematopoietic stem cell (HSC) gives rise to all blood cells and it is regulated by HSC contact with different cell types that compose the bone marrow stroma and maintain the balance between HSC self-renewal and differentiation, processes that are also regulated by signaling pathways such as the Hedgehog and regulatory proteins of the cytoskeleton as RhoGTPases. The overall aims of this work were to investigate the Hedgehog pathway in myelodysplastic syndrome (MDS) bone marrow and the ARHGAP21 role in hematopoiesis. Immunohistochemistry assays revealed that MDS bone marrow biopsies showed increased Sonic and Dessert Hedgehog together with c-kit positive stained cells compared to megaloblastic anemia (used as control).We also analyzed gene expression of the Hedgehog pathway members in total cells from MDS bone marrow and healthy donors. There was no difference in Patched (PTCH) expression in MDS compared to healthy donors, however, when MDS samples were classified according to WHO 2008, we observed a significant increase in PTCH1 expression in MDS patients <5% bone marrow blast (RCUD, RCMD, ARSA). GLI1 and SUFU expressions were significantly reduced in the MDS patients and in the group of patients with RCUD, RCMD, ARSA, when compared to healthy donors. SUFU expression was also decreased in MDS patients > 5% bone marrow blast (RAEB-1 and RAEB-2) compared to controls. We also observed 7-fold increase of SMO transcripts in the MDS group and 14-fold increase in RAEB-1 and RAEB-2. Cox survival analyses showed that increased SMO and decreased PTCH expression were considered as independent factors influencing the survival of these patients. We also confirmed the enhanced Hedgehog activation in CD34+ cells from MDS patients through increased expression of the pathway targets: GLI1, BMI1 and Nanog. Together, our data indicate that the Hedgehog pathway is deregulated in MDS bone marrow and the possible role of that pathway in disease progression. Arhgap21+/- murine model study showed the importance of this protein in normal hematopoiesis as these animals showed alterations in erythroid and megakariocyte differentiation along with increased myeloid mobilization. We also observed increased short and long term HSC frequency in the heterozygous bone marrow. This increase was responsible for enhanced neutrophil reconstitution during induced hematopoietic stress in Arhgap21+/-. Serial bone marrow transplantation assay showed lower chimerism in peripheral blood 4 weeks after the transplant together with lower long term reconstitution in animals who received Arhgap21+/- bone marrow, indicating decreased HSC self-renew from heterozygous cells. Bone marrow niche of Arhgap21+/- animals showed a reduction in initial support hematopoiesis and this result was correlated with the increased ROS production from Arhgap21+/- bone marrow after sublethally irradiation. Taken together, our data indicate that ARHGAP21 has an important role in hematopoiesis regulating process such as differentiation, mobilization and self-renewal of HSC / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutora em Fisiopatologia Médica

A síndrome mielodisplásica (SMD) é uma doença hematológica heterogênea, caracterizada por hematopoese anormal, displasia e instabilidade genômica, portanto, a análise citogenética é determinante no diagnóstico, prognóstico e acompanhamento evolutivo da doença. Considerando que as células hematopoéticas (CHs) e as estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) estão em estreita associação, estudos que visem à caracterização destas poderão contribuir para elucidar os mecanismos que governam a progressão tumoral e identificar novos alvos terapêuticos. Objetivo: Caracterizar e comparar as CHs e CTMs derivadas de pacientes através da citogenética convencional e molecular para os genes aurora cinase A e B. Avaliar as propriedades biológicas das CTMs derivadas de SMD e controles saudáveis. Métodos: o estudo iniciou-se com a avaliação clinica de 25 pacientes e 8 controles saudáveis doo HCFMRP-USP e HAC-Jaú. Em seguida, foi realizada a análise cariótipica das CHs e CTMs da medula óssea pelo bandamento G e por FISH para os genes aurora A e B e o perfil imunofenotípico, bem como potencial de diferenciação em adipócito e osteócito das CTMs de pacientes portadores de SMD e controles saudáveis. Resultados: A avaliação clínica mostrou plaquetopenia (76%), neutropenia (100%), hemoglobina baixa (16%). A análise citogenética das CHs revelou cariótipo alterado em 13 pacientes (52%), com cariótipo complexo resultando em alterações numéricas e estruturais. Ao contrário, nas CTMs, o cariótipo se mostrou alterado em sete pacientes (28%) e um padrão de menor complexidade, apenas quatro pacientes apresentaram alterações nas duas populações celulares, porém, diferentes. Foram encontradas apenas alterações numéricas (sendo 86% monossomia e 14% ganho de cromossomo). As CHs e CTMs dos controles apresentaram cariótipos 100% normais. Na análise de FISH não foi evidenciada amplificação dos genes AURKA e AURKB. As CTMs dos pacientes e controles apresentaram-se semelhantes quanto à morfologia e potencial de diferenciação. Entretanto, as CTMs de pacientes mostraram-se alteradas para dois antígenos de superfície, CD90 e CD146, os quais mostraram níveis de expressão mais elevados nas amostras dos pacientes (p= 0,04, p = 0,001 respectivamente). Conclusão: Observou-se que as CTMs se encontram alteradas embora em menor frequência e diferindo das alterações encontradas nas CHs. Esses dados sugerem que as CTMs devem exercer importante papel na progressão tumoral e devem ser consideradas como alvos na busca de novas terapias e melhor esclarecimento dos mecanismos que governam a progressão tumoral. Apesar de não ter evidenciado amplificação dos genes AURKA e AURKB em SMD, estudos futuros que visem avaliar o nível de expressão dessas enzimas em pacientes portadores ou não de alterações citogenéticas poderão contribuir para a compreensão do envolvimento ou não desse gene com a evolução da doença. Além disso, não foi evidenciada associação de anemia profunda e citogenética alterada. / The myelodysplastic syndrome (MDS) is a heterogeneous hematologic disease characterized by abnormal hematopoiesis, dysplasia and genomic instability, therefore, cytogenetic analysis is crucial in the diagnosis, prognosis and monitoring of disease evolution. Whereas hematopoietic cells (CHs) and stromal multipotent mesenchymal (MSCs) are in close association studies aimed at the characterization of these may help to elucidate the mechanisms that govern tumor progression and identify novel therapeutic targets. Objective: To characterize and compare the CHs and MSCs derived from patients by conventional cytogenetics and molecular genes aurora kinase A and B. To evaluate the biological properties of MSCs derived from MDS and healthy controls. Methods: The study began with the clinical evaluation of 25 patients and eight healthy controls HCFMRP dooUSP and CH-Jau. Next, we performed a karyotypic analysis of CHs and MSCs from bone marrow by G-banding and FISH for aurora A and B genes and immunophenotypic profile and potential to differentiate into adipocytes and osteocytes of MSCs in patients with MDS and controls healthy. Results: The clinical evaluation showed thrombocytopenia (76%), neutropenia (100%), low hemoglobin (16%). The cytogenetic analysis revealed karyotype of CHs changed in 13 patients (52%), resulting in complex karyotype with numerical and structural changes. In contrast, in MSC, the karyotype was abnormal in seven patients (28%) and a pattern of lower complexity, only four patients had changes in both cell populations, however, different. Were found only numerical changes (monosomy being 86% and 14% gain in chromosome). The CHs and MSCs controls showed 100% normal karyotypes. In FISH analysis there was no evidence of gene amplification and AURKA AURKB. The MSCs of patients and controls were similar regarding the morphology and differentiation potential. However, the CTMs of patients proved to be changed to two surface antigens, CD90 and CD146, which showed higher expression levels in samples of patients (p = 0.04, p = 0.001 respectively). Conclusion: Furthermore, it was observed that the MSCs are changed although less frequently and differing from changes found in CHs. These data suggest that MSCs should play an important role in tumor progression and should be considered as targets in the search for new therapies and better explain the mechanisms that govern tumor progression. Although not shown AURKA amplification of genes in MDS and AURKB, future studies aimed at assessing the level of expression of these enzymes in patients with or without cytogenetic alterations may contribute to the understanding of the involvement or not of this gene with the disease. This study can not associate with profound anemia cytogenetic changes.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont dus à une atteinte oligoclonale de la cellule souche hématopoïétique aboutissant à une dysplasie des lignées myéloïdes, des cytopénies sanguines et une évolution fréquente vers la leucémie aiguë. De nombreuses mutations décrites dans des gènes contrôlant la régulation épigénétique sont responsables de la genèse des SMD. Mais des travaux récents montrent également que des anomalies du microenvironnement médullaire, notamment des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), peuvent induire et propager un SMD suggérant l’idée d’une communication intercellulaire étroite entre la niche et les cellules hématopoïétiques. L’invalidation du gène Dicer1 (RNASE de type III impliquée dans le processing des microARN) dans les progéniteurs ostéoblastiques murins induit un véritable SMD avec dysmyélopoïèse.Nous avons confirmé la sous-expression de Dicer1 dans les CSM SMD à partir de prélèvements primaires de moelle totale et dans les CSM en expansion. La sous-expression de Dicer1 s’accompagne d’une dérégulation du profil des microARN au sein de CSM SMD mise en évidence par étude transcriptomique des CSM SMD vs CSM témoins. Nous avons découvert une possible cible thérapeutique : le miR-486-5p que nous avons retrouvé constamment surexprimé dans les CSM SMD. Un des moyens pour les CSM d’influer sur les cellules souches hématopoïétiques peut se faire par la sécrétion de vésicules extracellulaires (EVs). Ces EVs sont hétérogènes et peuvent être définies par leur taille. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux petites vésicules extracellulaires (sEVs) contenant la fraction exosomale qui est connue comme pouvant transporter des microARN, mARN et des protéines entre les cellules. Nous avons retrouvé ce miR-486-5p transporté comme cargo dans les sEVs sécrétées des CSM, des CSM vers les CD34+. De plus, nous montrons dans un modèle de co-incubation (sEVs avec CD34+ de sujets sains), que sur le plan fonctionnel, les sEVs provenant de CSM SMD induisent plus d’apoptose, plus de stress oxydatif ainsi que plus de dommage à l’ADN.Par ailleurs, la surcharge martiale observée chez les patients SMD est également responsable d’un stress oxydatif. Le déférasirox (DFX), un chélaleur de fer, a montré dans le cadre d’études rétrospectives une amélioration de l’érythropoïèse chez des patients SMD. Grâce à un modèle de différenciation érythroïde avec surcharge martiale, nous avons montré que de faibles doses de DFX induisent une meilleure prolifération des progéniteurs érythroïdes (moins d’apoptose et plus de cellules en cycle) via une activation de NF-κB. Cette activation est due à une diminution du niveau de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) en rapport avec une diminution du fer labile et est contrôlée de manière très fine par le niveau de ROS.Enfin, nous avons utilisé les propriétés du microenvironnement médullaire pour établir un modèle murin de SMD humain. En effet, la relative incapacité des cellules souches myélodysplasiques humaines de greffer et de reconstituer une hématopoïèse pathologique dans des souris immunodéprimées suggère que ces cellules souches SMD doivent avoir besoin d’un support extrinsèque du microenvironnement. Nous avons réalisé un modèle de souris humanisées en co-injectant des CSM et des CD34+ en intratibial. Une prise de greffe a été observée chez toutes les souris injectées et avons pu étudier l’évolution clonale au fil des générations dans les différentes sous-populations de progéniteurs myéloïdes (common myeloid progenitors (CMP), granulocyte macrophage progenitors (GMP) and megakaryocyte–erythroid progenitor (MEP)). Notre modèle est stable au cours des générations avec persistance du clone fondateur initial.En conclusion, ce travail confirme le rôle prépondérant du microenvironnement médullaire dans la genèse et la physiopathologie des syndromes myélodysplasiques et ouvre la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques. / Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematopoietic stem cell (HSC) oligoclonal diseases leading to dysplasia, blood cytopenia and evolution to acute leukemia. Numerous mutations in genes involved in epigenetic regulation are responsible of MDS genesis. But recently, studies show that medullar microenvironment, particularly mesenchymal stromal cells (MSC), could induces and propagates a truly MDS suggesting a narrow communication between HSC and this niche. Dicer1’s (type III RNAse implicating in microRNA processing) invalidation in murine osteoblastic progenitors induces a MDS with sign of dysplasia.In this work, we have confirmed the under expression of Dicer1 in MDS mesenchymal stromal cells from total bone marrow and cultured MSC. Dicer1 down regulation leads to a deregulation of miRNome profile in MDS MSC highlighted by transcriptomic approaches. We found a potential therapeutic target: miR-486-5p which is constantly overexpressed in MDS MSC. Extracellular vesicles (EVs) could be a possible way for MSC to influence HSC fates. Those EVs are heterogeneous are could be characterized by their sight. We mainly focused on small EVs (sEVs) containing the exosomal fraction known to be able to carry miRNA, mRNA and proteins. We found that miR-486-5p is carry from MSC to the HSC. Transcriptomic analyses of HD HSC overexpressing miR-486-5p are ongoing. Moreover, in a co-incubation model (sEVs and healthy donor (HD) HSC), sEVs coming from MDS MSC induced apoptosis, oxidative stress and DNA damages.Moreover, iron overload seen in MDS patients is also able to induce DNA damages and oxidative stress. Deferasirox (DFX), an iron chelator, has shown an erythropoiesis improvement in MDS patients. Using an erythroid differentiation model with iron overload, we have observed that low dose of DFX induce a better proliferation of erythroid progenitors (less apoptosis and more cycling cells) due to NF-κB activation. This activation is due to a decrease of reactive oxygen species level in relation to a decrease of the labile iron pool.Finally, we have used medullar microenvironment properties to establish a murine model of MDS. Indeed, MDS HSC incapacity to reconstitute a pathological hematopoiesis in immunocompromised mice suggests that MDS HSC need an extrinsic support from the microenvironment. We have engineered a MDS patient derived xenograft (PDX) model by intra-tibial co-injection CD34+ cells with MSC. All mice engrafted et we have follow the clonal evolution over mice generation in the different subset of myeloid progenitors. (common myeloid progenitors (CMP), granulocyte macrophage progenitors (GMP) and megakaryocyte–erythroid progenitor (MEP)). Our model is stable over generations with persistence of the initial founding clone.In conclusion, this work confirms the preponderant role of the medullary microenvironment in the genesis and physiopathology of myelodysplastic syndromes and opens the way to new therapeutic possibilities.

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