L'entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie inflammatoire affectant le tractus gastro-intestinal de 5 à 10 % des enfants prématurés ayant un poids inférieur à 1500 g à la naissance. Elle se traduit principalement par la perte de tissu de la muqueuse intestinale, ce qui permet l'invasion bactérienne, menant ultimement à une nécrose de l'intestin. Parmi les options pouvant être envisagées pour prévenir la NEC, le lait maternel constitue l'approche la plus efficace. En effet, ce dernier fournit aux nouveau-nés des nutriments essentiels, mais également des substances bioactives pouvant être à l'origine de sa capacité à prévenir l'inflammation, une des caractéristiques principales de l'entérocolite nécrosante. Toutefois, il n'existe pas de test ou de marqueur permettant de prédire le potentiel anti-inflammatoire des dons de lait maternel. Un test fonctionnel in vitro utilisant des cellules épithéliales intestinales a été développé et il a été possible d'identifier certains dons de lait maternel pouvant prévenir l'inflammation de façon significative, via la réduction de l'expression du signal NF-κB (nuclear factor kappa-B), à l'intérieur des cellules. À partir de ces données, un profil de certains facteurs bioactifs clés contenus dans le lait, tels que le facteur de croissance épidermique, les cytokines inflammatoires et les oligosaccharides, a été dressé pour différents dons de lait. Il fut possible de comparer la composition de ces dons en fonction de leur potentiel anti-inflammatoire et de tenter d'identifier une ou plusieurs molécules pouvant être à l'origine de la prévention de l'inflammation. / Necrotizing enterocolitis (NEC) is an inflammatory disease affecting the gastrointestinal tract in 5-10 % of premature infants weighing less than 1500 g at birth. It mainly results in the loss of tissue from the intestinal lining, which allows bacterial invasion, ultimately leading to necrosis of the intestine. Of the treatment options that may likely be able to prevent NEC, breast milk is the most effective approach. Indeed, the latter provides newborns with essential nutrients, but also bioactive substances that may be the origin of its ability to prevent inflammation, one of the main characteristics of NEC. However, there is no assay or marker to predict anti-inflammatory potential of breast milk samples. A functional in vitro test using intestinal epithelial cells has been developed and showed ability to identify certain donated breast milk that can significantly prevent inflammation, via the reduction of the expression of the NF-κB signal (nuclear kappa-B factor), inside cells. From these data, a profile of some key bioactive factors contained in milk, such as epidermal growth factor, inflammatory cytokines, and oligosaccharides, was dressed in different milk donations. It was possible to compare the composition of these donations according to their anti-inflammatory potential and to try to identify one or more molecules which could be the origin of the prevention of inflammation.

Les myopathies auto-immunes (MAI), classiquement appelées myosites ou myopathies inflammatoires idiopathiques, représentent un groupe de maladies définies par des caractéristiques cliniques, histopathologiques et biologiques. Une des caractéristiques les plus notables est la présence d’auto-anticorps (aAc) chez environ 60% des patients. Les MAI regroupent : les dermatomyosites, les polymyosites, les myosites à inclusion, les myosites de chevauchement incluant le syndrome des anti-synthétases et les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI). Les MNAI ont été récemment individualisées parmi les MAI comme des maladies graves fréquemment associées à la présence d’aAc dirigés contre la Signal Recognition Particle (SRP) ou la 3-Hydroxy-3-MéthylGlutaryl-CoA Réductase (HMGCR). La localisation de SRP et HMGCR étant intracellulaire, le rôle des aAc dans la physiopathologie des MNAI reste mal compris. La pathogénicité des aAc anti-SRP et anti-HMGCR envers des cellules musculaires cultivées in vitro a récemment été mise en évidence mais leurs effets in vivo demeurent inconnus.Au cours de cette thèse, j’ai étudié le rôle physiopathologique des aAc anti-SRP et anti-HMGCR in vivo chez la souris. Le transfert passif d’IgG de patients atteints de MNAI, positifs pour les aAc anti-SRP ou anti-HMGCR, à la souris sauvage entraîne un déficit musculaire. Ce déficit était prolongé chez la souris immunodéficiente Rag2-/-, et limité chez la souris déficiente pour la fraction C3 du complément. Chez les souris recevant les IgG anti-SRP+, le déficit musculaire était important et accompagné de quelques signes de nécrose myocytaire. Les IgG anti-HMGCR+ induisaient une faiblesse musculaire moindre, et des signes histopathologiques rares ou absents. Ces résultats sont en accord avec l’observation chez l’homme d’une maladie plus grave chez les patients anti-SRP+ par rapport aux patients anti-HMGCR+. La supplémentation en complément humain des souris augmentait le déficit musculaire induit par les IgG anti-HMGCR+ et de façon moindre pour les IgG anti-SRP+. En collaboration avec l’INSERM UMRS974, nous avons montré que les cibles SRP et HMGCR peuvent être détectées à la surface des fibres musculaires in vitro, suggérant qu’elles puissent être accessibles aux aAc in vivo.Ces résultats démontrent pour la première fois le rôle pathogène des aAc anti-SRP et anti-HMGCR in vivo et l’implication du complément, contribuant à une avancée dans la compréhension de la physiopathologie des MNAI. / Autoimmune myopathies (AIM), classically called myositis or idiopathic inflammatory myopathies, represent a group of diseases characterized by clinical, histopathologic and biologic properties. One of the most notable properties is the presence of autoantibodies (aAb) in approximately 60% of patients. AIM includes five principal entities: dermatomyositis, polymyositis, inclusion body myositis, overlap myositis including the anti-synthetase syndrome and immune-mediated necrotizing myopathies (IMNM). IMNM have recently been individualized among AIM as severe diseases frequently associated with aAb directed against Signal Recognition Particle (SRP) or 3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl-CoA Reductase (HMGCR). Since SRP and HMGCR have an intracellular localization, the role of anti-SRP and anti-HMGCR aAb in the pathophysiology of IMNM remains unclear. Anti-SRP and anti-HMGCR aAb were recently shown to be pathogenic to muscle cells in vitro but in vivo effects remain unknown.During this thesis, I studied the pathophysiological role of anti-SRP and anti-HMGCR aAb in vivo in mice. Passive transfer of IgG purified from plasma of IMNM patients positive for anti-SRP and anti-HMGCR aAb to wild-type mice elicited a muscle weakness. Immune-deficient Rag2-/- mice presented a prolonged muscle deficit, whereas complement component C3 deficient mice had limited signs. Mice injected with anti-SRP+ IgG displayed a strong muscle weakness with mild myocytic necrosis. The muscle deficit was milder and histopathologic findings were not always present in mice receiving anti-HMGCR+ IgG. This is in accordance with clinical findings in anti-SRP+ patients which present a more severe disease than anti-HMGCR+ patients. When supplemented with human complement, mice receiving anti-HMGCR+ IgG showed a more severe muscle deficit. This supplementation increased the deficit induced by anti-SRP IgG in a milder way. In collaboration with INSERM UMRS974, we showed that the targets SRP and HMGCR can be detected on the surface of myofibres in vitro, suggesting that they could be accessible to aAb in vivo.Together, these results demonstrate for the first time the pathogenic role of anti-SRP and anti-HMGCR aAb in vivo and the implication of complement, contributing to a progress in the comprehension of MNAI pathophysiology.

S. aureus est un pathogène humain qui produit une grande variété de facteurs de virulence, dont la leucocidine de Panton Valentine. Cette toxine est à l’origine de symptomatologies potentiellement sévères telles que la pneumonie nécrosante et l’ostéomyélite compliquée récidivante. Malgré la faible prévalence des gènes de la PVL au sein de souches de S. aureus, nous assistons à une émergence et à une diffusion de souches S. aureus résistantes à la méticilline d’origine communautaire (SARM-C) produisant la PVL. Bien que hautement conservée au sein de différents génomes, la PVL produite par les souches SARM-C américaines USA300 porte une substitution His176Arg avec un impact potentiel sur la fonctionnalité de la PVL. Nous avons étudié la distribution de ce polymorphisme au sein d’une sélection de souches SARM-C isolées de divers continents et nous avons confirmé le rôle leucotoxique de la PVL envers les neutrophiles humains quel que soit le fond génétique de la souche d’origine. Nous avons mis au point un modèle expérimental de lapin afin d’étudier le rôle de la PVL secrétée par la souche USA300 dans la pathogenèse de l’ostéomyélite. La PVL s’est révélée être un déterminant de la gravité de la maladie en termes de persistance et extension de l’infection, ainsi que d’amplitude de la réaction inflammatoire. Dès lors que nous avons conforté le rôle pathogène de la PVL, nous avons exploré l’effet des antibiotiques sur l’expression de la leucocidine. Nous avons observé après traitement avec l’oxacilline et l’imipénème une augmentation de la production de PVL. Cette augmentation est le résultat d’une activation transcriptionnelle des gènes de la PVL, activation médiée par les protéines liant la pénicilline et des régulateurs de la virulence staphylococcique, sarA et rot. D’autres antibiotiques la clindamycine, le linézolide et la rifampicine exercent un effet inhibiteur sur la production de PVL et bloquent l’induction de toxine par les bêta-lactamines. Sur la base de ces observations, nous recommandons pour le traitement des infections sévères à S. aureus producteur de PVL l’utilisation de l’oxacilline en association avec la clindamycine ou la rifampicine pour S. aureus sensible à la méticilline et du linézolide pour le SARM. / S. aureus is a human pathogen producing a large variety of virulence factors such as the Panton Valentine leukocidin (PVL). This toxin has been epidemiologically related to severe diseases such as necrotising pneumonia and recurrent osteomyelitis. The world wide spreading of PVL producing community acquired methicillin resistant S. aureus (CA-MRSA) has been reported. Although highly preserved within various genomes, the sequence of PVL produced by the american CA-MRSA strain USA300 carries a His176Arg substitution with a potential impact on the functionality of the leukocidin. We studied the distribution of this polymorphism within a selection of CA-MRSA strains isolated from various continents and we confirmed PVL toxicity towards human neutrophiles regardless to the genetic background of the harboring strain. We used an experimental rabbit model in order to study the relevancy of USA300 secreted PVL in the pathogenesis of osteomyelitis. We showed that PVL is a determinant of disease severity in terms of persistence and extension of the infection, as well as amplitude of the inflammatory reaction. We investigated the effect of antibiotics on the expression of the leukocidin. We observed increase PVL production after oxacilline and imipenem treatment. This was the consequence of trascriptional activation of PVL genes, mediated by penicillin binding proteins and S. aureus virulence regulators sarA and rot. Other antibiotics such as clindamycin, linezolid and rifampicin decreased PVL production and suppressed the inductor effect of beta-lactams. Based on these observations, we recommend for the treatment of the severe PVL induced diseases the use of oxacillin associated with either clindamycin or rifampicin for methicillin susceptible S. aureus or linezolid for MRSA.

Les virus sont les causes principales d’encéphalites et plus d’une centaine d’entre eux sont impliquées dans ces pathologies. Cependant, plus de 50% des encéphalites restent sans étiologie, dû en partie à des techniques de diagnostic mal adaptées ou à une méconnaissance de l’agent infectieux impliqué. Nous rapportons les cas de deux enfants d’une même famille qui ont développé une encéphalite nécrosante aiguë (ANE) conduisant à une hospitalisation de plusieurs semaines en soin intensif. Les virus communément recherchés dans les cas d’encéphalites n’ont pas été retrouvés chez ces patients. Par contre, la culture réalisée à partir des prélèvements d’urine des enfants et d’un prélèvement de gorge pour l’un des deux, a permis d’isoler un nouveau réovirus nommé MRV2Tou05. L’analyse moléculaire des 10 segments du génome viral a indiqué qu’un nouveau réovirus de sérotype 2 avait été isolé chez ces patients et qu’il s’agissait d’un virus réassortant entre une souche isolée de porc et une souche humaine. Le virus se réplique dans des cellules neuronales humaines et a été retrouvé par amplification de gène dans les prélèvements d’urine et dans certains prélèvements de sérum des deux enfants. De plus, une réponse anticorps spécifique dirigée contre MRV2Tou05 a été détectée dans les sérums des patients de l’étude alors qu’aucune réponse anticorps n’a été observée dans 40 sérums de donneurs sains. Toutes ces données sont en faveur de l’implication du nouveau réovirus isolé dans l’encéphalopathie observée. Des études supplémentaires réalisées in vivo dans un modèle animal permettront de mieux comprendre le rôle étiologique de ce nouveau réovirus dans les cas d’encéphalites / Viruses remain the main cause of Acute Encephalitis and more hundred of them are implicated in these pathologies. However, the etiologic agent is not determined in approximately 50% of cases, owed partially to not well adapted techniques of diagnosis or to misunderstanding of the involved infectious agent. We report the cases of two children in a same family who developed an acute necrotizing encephalopathy (ANE) leading to hospitalization in intensive care unit. Viruses commonly found in encephalitis were not detected in cerebrospinal fluid of these patients. However, a new reovirus strain of serotype 2, MRV2Tou05 was isolated from urine and throat swab samples on epithelium cells and was identified by electron microscopy and genome sequencing. Molecular characterization of its segmented genome indicates that MRV2Tou05 is a reassortant issued from swine and human strains. This new reovirus strain was directly detected by a specific sensitive molecular test in urine and serum samples from the two children. A specific antibody response directed against this new reovirus strain was detected in patient sera, whereas no response was observed in 38 healthy adult sera. Both its isolation and molecular detection from samples of the patients and the specific immune response toward this strain suggest an etiologic role of this reovirus in the ANE cases described herein. The reproduction of symptoms in an animal model will help understanding the exact role of this strain in ANE cases

Le microbiote digestif humain joue un rôle essentiel et bénéfique pour son hôte mais il est également impliqué dans un nombre croissant de pathologies. Les connaissances sur la composition de cet écosystème ont récemment été révolutionnées grâce à l’utilisation de techniques moléculaires. Cependant, ces techniques comportent des limites importantes. C’est ainsi que le concept de « culturomique » a été introduit ; il consiste en la multiplication de milieux et conditions de culture et l’identification rapide de colonies bactériennes par spectrométrie de masse (MALDITOF) ou par amplification et séquençage du gène de l’ARN ribosomal 16S. Dans la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence une association entre la présence de Clostridium butyricum dans les selles et la survenue d’entérocolite ulcéro-nécrosante que ce soit par méthodes de pyroséquençage et culture ou par PCR quantitative en temps réel spécifique de C. butyricum; identifié après séquençage du génome complet de toutes nos souches de C. butyricum, la présence du gène de la β-hémolysine (toxine). Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons montré par cuturomique que les bactéries à Gram-négatif (BGN) étaient fréquemment disséminées au sein du microbiote cutané transitoire des patients hospitalisés en réanimation ; le réservoir serait essentiellement digestif. En conclusion, le microbiote digestif constitue un réservoir sousestimé de bactéries pathogènes. La microbiologie moderne incluant les nouvelles méthodes de culture permet d’étendre de manière considérable les connaissances sur la composition de cet écosystème et son implication en pathologie humaine. / He human gut microbiota plays an important and beneficial role in its host but it is also involved in a growing number of diseases. Knowledge of the composition of this ecosystem have recently been revolutionized by the use of molecular techniques. However, these techniques have significant limitations. Thus, the concept of "culturomics" has been introduced; it consists of the multiplication of culture conditions and the rapid identification of bacterial colonies by mass spectrometry (MALDI-TOF) or by PCR 16S RNA gene sequencing. In the first part of this work, we have demonstrated an association between the presence of Clostridium butyricum in the stool and the occurrence of necrotizing enterocolitis whether by pyrosequencing methods and Culture or by quantitative PCR specific real time C. butyricum; identified after sequencing the complete genome of all our strains of C. butyricum, the presence of the gene of β-hemolysin (toxin). In the second part of this work, we showed by cuturomics that Gram-negative bacteria (BGN) were frequently spread out over the transitional skin microbiota of patients hospitalized in intensive care; the reservoir would essentially digestive. In conclusion, the gut microbiota is an underestimated reservoir of pathogenic bacteria. Modern microbiology including new culture-based methods is currently extending exponentially our knowledge on gut microbiota giving rise to new insights into the pathogenesis or the transmission of infectious diseases.

Les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) appartiennent au groupe des myopathies inflammatoires idiopathiques. Les MNAI sont des maladies musculaires sévères pouvant conduire à un déficit musculaire définitif et handicapant. Pour rétablir une force normale et prévenir le handicap, des traitements prolongés associant corticothérapie et immunosuppresseurs sont nécessaires. Les MNAI sont définies histologiquement par la prédominance de fibres musculaires en nécrose qui contraste avec l’absence ou la faible abondance d'inflammation musculaire. Les mécanismes impliqués dans la nécrose comme ceux impliqués dans les séquelles atrophiques sont en revanche inconnus. Les MNAI peuvent être associées à des auto-anticorps (aAc) soit anti-SRP, soit anti-HMGCR. Ces aAc ciblent des protéines cytoplasmiques ubiquitaires. Leurs titres sont corrélés avec l'activité de la maladie, suggérant ainsi le rôle pathogène de ces aAc. Dans ce travail de thèse, nous avons émis l’hypothèse que les aAc pouvaient être impliqués dans les lésions musculaires observées aux cours des MNAI anti-SRP+ et anti-HMGCR+. Durant cette étude, nous avons eu pour objectifs : (i) de caractériser et de quantifier la nécrose musculaire et l’inflammation associée, ainsi que les mécanismes physiopathologiques impliqués (rôle des aAc) ; (ii) d’analyser la régénération et l’atrophie musculaire et l’effet des aAc sur ces phénomènes. L'analyse histologique des biopsies musculaires des patients MNAI a montré que la proportion des fibres musculaires en nécrose était plus importante chez les patients anti-SRP+. Les taux sériques de créatine phosphokinase étaient corrélés avec la proportion de fibres nécrotiques, montrant ainsi que ce taux est un bon marqueur de l’activité de la maladie. De façon inattendue, une inflammation musculaire était régulièrement observée. En particulier, la densité lymphocytaire T était dans un quart des cas comparable à celle des autres myopathies inflammatoires. Cette densité cellulaire était de plus corrélée au pourcentage de fibres en nécrose. L’infiltrat inflammatoire était néanmoins composé principalement de macrophages. Des macrophages CD68+ iNOS+, impliqués dans des phénomènes de myophagocytoses dans un environnement Th-1 étaient régulièrement observés. Des macrophages avec un phénotype suggérant une activation alternative par l’immunité humorale ont aussi été observés. Dans ce sens, la présence de dépôts de complexe d’attaque membranaire à la surface des fibres musculaires, mais aussi des dépôts de C1q et d’IgG montraient l’activation de la voie classique du complément au cours des MNAI. De plus, la détection des protéines SRP et HMGCR sur certaines fibres musculaires immatures (in vitro et in vivo) suggérait le rôle pathogène des aAc. Concernant les mécanismes de régénération et les phénomènes d’atrophie musculaire, l’analyse des biopsies musculaires a révélé l’importance de l’irrégularité du diamètre des fibres avec une prédominance de petites fibres. Ces petites fibres correspondaient à la fois à des fibres en régénération et à des fibres en nécrose. In vitro, les Ac anti-SRP et anti-HMGCR induisent une atrophie musculaire en augmentant la transcription de MAFbx et Trim63. En outre, l'atrophie des fibres musculaires a été associée à un niveau élevé de cytokines inflammatoires comme TNF, IL-6 et ROS. Concernant l’étude de la régénération musculaire, in vitro, la présence des aAc réduisait la fusion des myoblastes. Ce défaut était associé à une diminution de la production de cytokines anti-inflammatoires IL-4 et IL-13. L’ajout d'IL-4 et/ou d’IL-13 permettait de corriger la fusion des myoblastes. Dans ce travail, les données recueillies convergent pour suggérer le rôle pathogène des aAc anti-SRP et anti-HMGCR dans les lésions musculaires nécrotiques mais aussi dans la régénération musculaire et l’atrophie. Ces données nouvelles soulignent l’importance de traitements ciblés au cours des MNAI. / Immune mediated necrotizing myopathy (IMNM) is recognized as a separate entity among inflammatory myopathies. IMNM is a severe disabling muscle disease requiring prolonged combination of corticosteroid and immunosuppressive drugs. IMNM is morphologically defined by predominant muscle fiber necrosis and no or little inflammation, and is associated with important variation of the size of the fiber. However pathogenic mechanisms involved in muscle necrosis and muscle atrophy are largely unknown. IMNM may be associated with either anti-SRP or anti-HMGCR auto-antibodies (aAbs). The titer of these aAbs, targeting ubiquitous cytoplasmic proteins, is correlated with the disease activity suggesting their pathogenic role. In this thesis, we described the morphology of skeletal muscle alterations occurring in both conditions of anti-SRP+ or anti-HMGCR+ patients, studied the role of the Abs in (i) the necrosis mechanisms and the associated inflammation; (ii) by analyzing the atrophy and the regeneration mechanisms. Muscle histological analysis of anti-SRP+ and anti-HMGCR+ patients showed a random distribution of necrotic fibers that was more pronounced in anti-SRP+ patients. Creatine Phosphokinase levels; myolysis indicator, and muscle regeneration were correlated with the proportion of necrotic fibers. Inflammation was regularly observed in IMNM muscle patients. Macrophages were the most abundant but T cells densities were in a quarter of cases in the same range as myositis controls. CD68+iNOS+ macrophages and a Th-1 immune environment were also observed and involved in ongoing myophagocytosis. Of note, macrophages with alternative activation were also detected. Humoral immunity with activation of the classical pathway of the complement cascade was observed in IMNM. Positive membrane staining for SRP and HMGCR proteins, on some muscle fibers, was detected both in vitro and in muscle biopsies of IMNM patients. An important proportion of small fibers corresponding to both atrophic and regenerating fibers was observed in anti-SRP+ and anti-HMGCR+ patients. In vitro, anti-SRP and anti-HMGCR aAbs induced muscle fibers atrophy and increased the transcription of MAFbx and Trim63. In addition, the muscle fiber atrophy was associated with high level of inflammatory cytokines such TNF, IL-6 and ROS. Muscle regeneration in vitro was also affected by impairing the myoblasts fusion in presence of anti-SRP and anti-HMGCR Abs. This default was associated with a decrease production of anti-inflammatory cytokines: IL-4 and IL-13. Of note, the addition of IL-4 and/or IL-13 totally rescued the fusion. Together those data suggest that these aAbs have a pathogenic effect on muscle. Anti-SRP and anti-HMGCR are involved in muscle atrophy and affect the regeneration. The role of these aAbs in muscle damages occurring in IMNM was highlighted and emphasizes the potential interest of targeted therapies.

La recherche en bactériologie et virologie est à la fois de nature cognitive et appliquée. Elle consiste à fédérer et mettre en place une capacité de recherche multidisciplinaire et pouvoir l'intégrer sur un champ très vaste de microorganismes et de maladies. Les nouvelles avancées conceptuelles et technologiques dans le domaine de la génomique, notamment les avancées dans les techniques à haut débit (séquençage, PCR...) permettent actuellement d’avoir rapidement des génomes bactériens et viraux entiers, ou seulement sur quelques gènes d’une grande population. Les progrès dans ce domaine permettent l’accès à ces informations en évitant une combinaison de plusieurs méthodologies, et à moindre coûts. Dans notre travail de thèse, nous avons été porté à analyser et traiter les données de deux études genomiques et métagenomiques, mettant en évidence avantages, limites et attentes liés à ces techniques. La première étude porte sur l'analyse génomique de nouveaux virus géants et chlamydia infectant Vermamoeba vermiformis. La deuxième étude concerne le pyroséquençage 16S de microbiote intestinal de nouveau-nés atteint de l'entérocolite nécrosante. Pour le premier projet du travail de thèse, nous avons analysé les génomes de trois nouvelles espèces de Chlamydiae et onze virus giants (premiers membres de deux probables nouvelles familles) qui se multiplient naturellement dans Vermamoeba vermiformis. L'objectif étant de mettre en évidence les caractéristiques génétiques spécifiques à ces micro-organismes. La deuxième partie a été consacrée à l'analyse des données de pyroséquençage 16S des selles de nouveau-nés atteints de l'entérocolite nécrosante. / Research in bacteriology and virology is both cognitive and applied. It involves federating and developing a multidisciplinary research capacity and being able to integrate it into a very broad field of microorganisms and diseases. New genomic and conceptual advances in genomics, including advances in high-throughput techniques, now permit rapid bacterial and viral genomes, or only a few genes of a large population. Progress in this area allows access to this information by avoiding a combination of several methodologies and at lower costs. In our thesis work, we were led to analyze and process the data of two genomic and metagenomic studies, highlighting advantages, limitations and expectations related to these techniques. The first study focuses on the genomic analysis of new giant viruses and chlamydia infecting Vermamoeba vermiformis. The second study concerns the 16S pyrosequencing of intestinal microbiota of neonates with necrotizing enterocolitis. The first project of the thesis work analyzed the genomes of three new species of Chlamydiae and eleven giant viruses (first members of two probable new families) which naturally multiply in Vermamoeba vermiformis. The objective is to highlight the genetic characteristics specific to these microorganisms. The second part was devoted to the analysis of 16S pyrosequencing data from neonatal enterocolitis neonatal stools. The goal was to identify an agent responsible for this disease.

La dysbiose est une cause importante dans la survenue de maladies, favorisant la prolifération de pathogènes ou induisant l’inflammation. L’étude de ce phénomène est devenue possible grâce aux approches d’analyse génomique (AG) associé avec d’autres techniques. L’entérocolite nécrosante (ECN) et l’infection du pied diabétique (IPD) demeurent deux maladies associées à la dysbiose dans lesquels différents bactéries ont été décrites, notamment C. butyricum dans l’ECN, E. coli et S. aureus dans l’IPD. Dans le cadre de l’ECN, C. butyricum demeure l’espèce la plus fréquente chez les ECN. L’identification clusters liés géographiquement et en fonction du temps. Le portage asymptomatique est suggéré par une similarité génomique des souches patients et contrôles. La prédiction d’un gène de β-hémolysine ainsi leur effet cytotoxique sur les cellules Jurkat avait été observé. De même, sur les cellules Caco-2 malgré le KO du gène de β-hémolysine. En se basant sur l’analyse physico-chimique du surnageant bactérien, nous avons suggéré que la fraction cytotoxique est protéique. La purification de la fraction cytotoxique a permis de trouver une protéine codant pour PspC family possédant un domain conservé commun avec celui de la toxine A/B. L’inactivation du gène codant pour cette protéine n’a pas supprimé l’effet cytotoxique, suggérant la présence d’une combinaison gènes. En parallèle, nous avons ciblé l’impact de C. neonatale par qRPC spécifique rpoB. Cette espèce était plus fréquente chez les patients, ainsi de clones géographiques ont été identifiées. Enfin, des SNPs ont été observés dans des gènes de virulence dans le cas des E. coli et S. aureus isolés de l’IPD. / Dysbiosis remains a main cause during the establishment of several diseases, by promoting bacterial translocation, leading to inflammation process. Specific microorganisms were involved in the pathogenesis of dysbiosis-associated diseases, notably necrotizing enterocolitis (NEC) and diabetic foot (DF). This was possible by the implication of whole-genome analysis (WGA) in association with other techniques. In case of NEC, C. butyricum was significantly associated with in NEC; tested on a South-East French cohort. Geographical and/or temporal clusters were identified, thus genomic relationship between NEC-associated isolates and controls, suggesting the presence of asymptomatic carriage. Genes encoding for β-hemolysin was detected and C. butyricum supernatant exhibited cytotoxic effect on Jurkat cells. Cytotoxic effect was also presented on Caco-2 cells. Supernatant of β-hemolysin-mutant C. butyricum showed enterotoxic effect. Basing on physico-chemical data, we assumed that the evaluated fraction was a protein. Proteomics analysis revealed that PspC family was the cytotoxic protein. This protein owned a glucan-binding domain, shared by C. difficile toxin A/B. The KO of PspC gene was enterotoxic, suggesting by this the existence of a combination of genes. In parallel, a specific rpoB-based qPCR was developed to identify C. neonatale. We found that, C. neonatale was more prevalent in NEC than in controls. Although co-identified in association with C. butyricum. C. neonatale clones were distinguished especially in strains isolated from the same hospital. Regarding to DF infection, SNPs were identified within S. aureus and E. coli genomes, especially in virulent genes.

Contexte : Près de 2,5 millions de nouveau-nés meurent chaque année et plus de 80 % d'entre eux ont un petit poids à la naissance (PPN). Le PPN est une entité clinique complexe impliquant le retard de croissance in utero (RCIU) et la naissance prématurée (NPM). Les nouveau-nés survivants sont exposés à un risque élevé de morbidités périnatales graves (telles que la dysplasie broncho-pulmonaire, l'entérocolite nécrosante, l'encéphalopathie néonatale) en raison des effets dévastateurs de l'inflammation utéro-fœtale sur les organes fœtaux vulnérables. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour la protection fœtale ante partum. Parmi les nombreux médiateurs pro-inflammatoires, l'IL-1β se distingue par ses effets délétères. Notre laboratoire a conçu un nouvel antagoniste allostérique du récepteur de l'IL-1, Rytvela, qui s'est avéré efficace contre la NPM lorsqu'il est administré en prophylaxie. Objectif : Cette étude vise à mieux caractériser Rytvela en évaluant son efficacité dans la prévention de la NPM et du RCIU lorsqu'il est administré après l'insulte inflammatoire initiale selon un cadre clinique plus réaliste. Méthodes : Des souris gravides CD-1 ont reçu une injection d'agents pro-inflammatoires/pro-travail, soit l’IL-1β (1 μg i.u.) ou le LPS (10 μg i.p.) aux jours 16-17 de la gestation. Rytvela (2 mg/kg/jour s.c.) a été administré à différents intervalles de temps (0,5h, 2h, 4h, 6h) après l’induction inflammatoire. Le taux de NPM, la survie et le poids des souriceaux ont été évalués. Des analyses histologiques des poumons, intestins et cerveau des nouveau-nés ont été réalisées. Résultats : Toutes les grossesses traitées avec Rytvela ont été menées à terme dans le modèle de l’IL-1β, alors que le taux de NPM était de 57 % dans le groupe non traité. La survie, la croissance et le poids des souriceaux ont été considérablement améliorés avec Rytvela administré 0,5 h post-inflammation (avec une survie presque doublée des portées). L'analyse histologique a révélé dans tous les modèles une morphogenèse fœtale protégée, y compris une alvéolarisation pulmonaire préservée, des villosités intestinales intactes et un arbre cérébrovasculaire protégé associé à une masse cérébrale préservée. Conclusion : Rytvela est efficace dans la prévention de la NPM et du RCIU lorsqu'il est administré en post-inflammatoire. Il présente un effet maximal lorsqu'il était administré rapidement (0,5 h après IL-1β/LPS) et maintenait des effets protecteurs fœtaux significatifs avec une administration retardée (jusqu'à 6 h après IL-1β/LPS). Rytvela améliore la survie et la santé néonatale en préservant l'intégrité et la croissance des tissus fœtaux. Par conséquent, Rytvela est un nouveau prototype thérapeutique prometteur et sécuritaire pour le traitement de la NPM et du RCIU. / Background: Over 2.5 million newborns die yearly and more than 80% of them are of low birthweight (LBW). LBW is a complex clinical entity involving fetal growth restriction (FGR) and preterm birth (PTB). Surviving neonates face a higher risk of serious perinatal morbidities (such as bronchopulmonary dysplasia, necrotizing enterocolitis, neonatal encephalopathy) due to the devastating effects of utero-fetal inflammation on vulnerable fetal organs. There is currently no efficient treatment for fetal antepartum protection. Among the many proinflammatory mediators, IL-1β stands out for its detrimental effects. The host lab has designed a novel allosteric IL-1 receptor antagonist, Rytvela, which has been shown to be effective against PTB when administered prophylactically. Objective: This study aims to further characterize Rytvela by evaluating its efficacy in preventing PTB and FGR when administered after the initial inflammatory insult according to a more realistic clinical setting. Methods: Pregnant CD-1 mice were injected with proinflammatory/prolabour agents, either IL-1β (1 μg i.u.) or LPS (10 μg i.p.) on days 16-17 of gestation. Rytvela (2 mg/kg/day s.c.) was administered at different time intervals (0.5, 2, 4, 6 h) after initial inflammatory insults. PTB rate, neonatal survival, and weight were assessed. Histological analyses of the lungs, intestines, and brain of the neonates were performed. Results: All pregnancies treated with Rytvela were carried to term in the IL-1β model, while the PTB rate was 57% in the untreated group. Pup survival, growth and weight were considerably improved with Rytvela administered 0.5h post-inflammatory insults (with a nearly 2-fold increase in litters survival). Histological analysis revealed in all models a protected morphogenesis of vulnerable fetal organs including preserved lung alveolarization, intact intestinal villi integrity, and protected cerebrovascular tree associated with preserved brain mass. Conclusion: Rytvela is efficient in preventing PTB and FGR when administered post-inflammatory insults. It exhibited maximum effect when administered promptly (0.5h post-IL-1β/LPS) and maintained significant fetal protective effects with delayed administration (up to 6h post- IL-1β/LPS). Rytvela improved birth outcome by preserving fetal tissue integrity and growth. Hence, Rytvela is a promising new and safe therapeutic prototype for treatment of PTB and FGR.