Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le diabète insipide néphrogénique (DIN) autosomal peut être causé par les mutations du gène codant pour le canal à eau aquaporine-2 (AQP2). Un modèle couramment utilisé pour l’étude des protéines membranaires telle l’AQP2 est l’expression hétérologue dans les ovocytes de Xenopus laevis. Malheureusement, les techniques déjà existantes de purification de membranes plasmiques sont soit trop longues, trop difficiles ou demandent trop de matériel, ne permettent pas l’analyse adéquate du ciblage des formes sauvage comme mutantes, un élément crucial de ce type d’étude. Nous avons donc dans un premier temps mis au point une technique rapide et efficace de purification de membranes plasmiques qui combine la digestion partielle de la membrane vitelline, sa polymérisation à la membrane plasmique suivi de centrifugations à basse vitesse pour récolter les membranes purifiées. Nous avons utilisé cette technique dans l’étude de deux nouveaux cas familiaux de patients hétérozygotes possédant les mutations V24A et R187C dans un cas et K228E et R187C dans le second cas. Pour chaque mutation, nous avons analysé autant les éléments de fonctionnalité que les paramètres d’expression des protéines mutantes. Les expériences de perméabilité membranaire démontrent que les ovocytes exprimant AQP2-V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) et AQP2- K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) ont des activités similaires à celle exprimant la forme native (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), tandis que AQP2- R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) ne semble avoir aucune activité comme ce qui est observé chez les ovocytes non-injectés (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). Les études de co-expression ont démontré un effet d’additivité lorsque AQP2-V24A et -K228E sont injectées avec la forme native et un effet s’apparentant à la dominance négative lorsque AQP2-R187C est injecté avec la forme native, avec AQP2-V24A ou avec –K228E. Les résultats obtenus par immunobuvardage représente bien ce qui a été démontré précédemment, on remarque la présence des mutations K228E, V24A et la forme sauvage à la membrane plasmique, contrairement à la mutation R187C. Cependant, lorsque les mutations sont exprimées dans des cellules mIMCD-3, il n’y a qu’une faible expression à la membrane de la forme –K228E et une absence totale des formes –V24A et –R187C à la membrane plasmique, contrairement à la forme native. Les résultats de nos études démontrent que tout dépendant du système d’expression les formes –K228E et –V24A peuvent être utiles dans l’étude des problèmes d’adressage à la membrane à l’aide de chaperonne chimique. De plus, la forme –R187C démontre des difficultés d’adressage qui devront être étudiées afin de mieux comprendre la synthèse des formes natives. / The autosomal nephrogenic diabetes insipidus (NDI) is caused by mutations of the gene coding for the water channel aquaporine-2 (AQP2). An oftenly used model for the study of membrane proteins such as AQP2 is the heterogenous expression in Xenopus laevis oocytes. Unfortunately, the existing techniques of plasma membranes purification are either too long, too difficult or require too much material, which does not allow adequate analysis of targeting of the native and mutants forms, which is crucial for this type of study. We developed a fast and effective plasma membrane purification technique which combines partial digestion of the vitellin membrane, its polymerization with the plasma membrane followed by a serie of low speed centrifugations to collect the purified membranes. We used this technique to study of two new family cases of heterozygote patients carrying the V24A and R187C mutations in a case and K228E and R187C in the second case. For each mutation, we analyzed the functionality and the parameters of expression of the mutant proteins. The membrane permeability experiments show that the oocytes expressing AQP2- V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) and AQP2-K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) have similar activities to the oocytes expressing the native form (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), while AQP2-R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) doesn’t seem to have any activity like the un-injected oocytes (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). The coexpression studies showed an additive effect when AQP2-V24A and -K228E are injected with the native form and an effect being associated with negative dominance when AQP2-R187C was injected with AQP2-V24A, -K228E and the native form. Western blot results confirmed what was observed in the functionality studies. However, when the mutations were expressed in mIMCD-3 cells, there was a slight expression of the K228E mutation to the plasma membrane and a total absence of the mutations –V24A and R187C at the plasma membrane. The results of our studies showed that depending on the expression system the mutations –K228E and -V24A can be used in targeting studies using chemical chaperones.

Le contrôle de la transcription constitue le principal niveau de la régulation de l'expression des gènes dans les cellules eucaryotes. Le laboratoire a identifié 6 familles indépendantes avec un diabète insipide néphrogénique (DIN) lié à l'X portant de grandes délétions en amont du gène de l'AVPR2. Dans chacune de ces familles, les gènes AVPR2 et AQP2 sont intacts et les hommes sont atteints de DIN lié à l'X dans sa forme rénale « classique ». Le séquençage et l'analyse de 61 kilobases en amont et en aval de l'AVPR2 ont permis l'identification de 6 zones délétées chez 6 familles indépendantes, dont 5 zones de taille supérieure à 7 kilo bases, et une zone, de 102 paires de bases, commune à l'ensemble des délétions. Chez le patient porteur de cette délétion, les récepteurs V2 ne sont pas exprimés dans le tubule collecteur mais le sont au niveau des cellules endothéliales. Notre travail est de tenter de comprendre les mécanismes régulateurs du locus de l'AVPR2, et d'étudier l'expression « tissu spécifique » de ce gène. Les études réalisées dans le système Hprt, confirment le rôle activateur de la séquence de 102 pb. Les expériences in vitro indiquent que cet effet dépende du contexte extracellulaire, de la nature des cellules, ainsi que du promoteur de l'AVPR2. Les protéines liant potentiellement l'une des extrémités de la délétion a révélé la présence, soit de protéines régulatrices, soit de séquences inconnues, toutes exprimées dans le rein. À terme, ces études, ainsi que celles en découlant, permettront de positionner l'AVPR2 comme une cible de choix dans le traitement des diabètes insipides, centraux et néphrogéniques, par thérapie génique.

Le diabète insipide néphrogénique (DIN) autosomal peut être causé par les mutations du gène codant pour le canal à eau aquaporine-2 (AQP2). Un modèle couramment utilisé pour l’étude des protéines membranaires telle l’AQP2 est l’expression hétérologue dans les ovocytes de Xenopus laevis. Malheureusement, les techniques déjà existantes de purification de membranes plasmiques sont soit trop longues, trop difficiles ou demandent trop de matériel, ne permettent pas l’analyse adéquate du ciblage des formes sauvage comme mutantes, un élément crucial de ce type d’étude. Nous avons donc dans un premier temps mis au point une technique rapide et efficace de purification de membranes plasmiques qui combine la digestion partielle de la membrane vitelline, sa polymérisation à la membrane plasmique suivi de centrifugations à basse vitesse pour récolter les membranes purifiées. Nous avons utilisé cette technique dans l’étude de deux nouveaux cas familiaux de patients hétérozygotes possédant les mutations V24A et R187C dans un cas et K228E et R187C dans le second cas. Pour chaque mutation, nous avons analysé autant les éléments de fonctionnalité que les paramètres d’expression des protéines mutantes. Les expériences de perméabilité membranaire démontrent que les ovocytes exprimant AQP2-V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) et AQP2- K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) ont des activités similaires à celle exprimant la forme native (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), tandis que AQP2- R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) ne semble avoir aucune activité comme ce qui est observé chez les ovocytes non-injectés (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). Les études de co-expression ont démontré un effet d’additivité lorsque AQP2-V24A et -K228E sont injectées avec la forme native et un effet s’apparentant à la dominance négative lorsque AQP2-R187C est injecté avec la forme native, avec AQP2-V24A ou avec –K228E. Les résultats obtenus par immunobuvardage représente bien ce qui a été démontré précédemment, on remarque la présence des mutations K228E, V24A et la forme sauvage à la membrane plasmique, contrairement à la mutation R187C. Cependant, lorsque les mutations sont exprimées dans des cellules mIMCD-3, il n’y a qu’une faible expression à la membrane de la forme –K228E et une absence totale des formes –V24A et –R187C à la membrane plasmique, contrairement à la forme native. Les résultats de nos études démontrent que tout dépendant du système d’expression les formes –K228E et –V24A peuvent être utiles dans l’étude des problèmes d’adressage à la membrane à l’aide de chaperonne chimique. De plus, la forme –R187C démontre des difficultés d’adressage qui devront être étudiées afin de mieux comprendre la synthèse des formes natives. / The autosomal nephrogenic diabetes insipidus (NDI) is caused by mutations of the gene coding for the water channel aquaporine-2 (AQP2). An oftenly used model for the study of membrane proteins such as AQP2 is the heterogenous expression in Xenopus laevis oocytes. Unfortunately, the existing techniques of plasma membranes purification are either too long, too difficult or require too much material, which does not allow adequate analysis of targeting of the native and mutants forms, which is crucial for this type of study. We developed a fast and effective plasma membrane purification technique which combines partial digestion of the vitellin membrane, its polymerization with the plasma membrane followed by a serie of low speed centrifugations to collect the purified membranes. We used this technique to study of two new family cases of heterozygote patients carrying the V24A and R187C mutations in a case and K228E and R187C in the second case. For each mutation, we analyzed the functionality and the parameters of expression of the mutant proteins. The membrane permeability experiments show that the oocytes expressing AQP2- V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) and AQP2-K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) have similar activities to the oocytes expressing the native form (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), while AQP2-R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) doesn’t seem to have any activity like the un-injected oocytes (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). The coexpression studies showed an additive effect when AQP2-V24A and -K228E are injected with the native form and an effect being associated with negative dominance when AQP2-R187C was injected with AQP2-V24A, -K228E and the native form. Western blot results confirmed what was observed in the functionality studies. However, when the mutations were expressed in mIMCD-3 cells, there was a slight expression of the K228E mutation to the plasma membrane and a total absence of the mutations –V24A and R187C at the plasma membrane. The results of our studies showed that depending on the expression system the mutations –K228E and -V24A can be used in targeting studies using chemical chaperones.

L’aquaporine-2 (AQP2) est le canal responsable de la réabsorption finale d’eau au niveau du tubule collecteur du rein. À la base, contenue dans des vésicules internes, l’AQP2 est acheminée à la membrane apicale des cellules principales du tubule collecteur suite à une stimulation par l’hormone antidiurétique (ADH). L’incapacité à accomplir cette fonction entraîne le diabète insipide néphrogénique (DIN), une maladie caractérisée par l’inhabileté du rein à concentrer l’urine, entraînant une production de volumes urinaires élevés. Alors que les mutations récessives génèrent des protéines mal structurées et incapables de former des tétramères, les mutations dominantes sont capables de s’associer à leurs homologues sauvages, engendrant ainsi un DIN même chez les patients hétérozygotes. Ce mémoire présente l’analyse biochimique et fonctionnelle d’une nouvelle mutation naturelle de l’AQP2, la mutation T179N, aussi responsable du DIN. Cette dernière est particulièrement intéressante de par son génotype qui implique un caractère dominant, et sa position extracellulaire habituellement réservée aux mutations récessives. Les études comparatives de T179N à deux modèles de mutation récessive et dominante démontrent, tant en ovocytes de Xenopus laevis qu’en lignée cellulaire mpkCCDc14, le caractère récessif de cette nouvelle mutation. Les tests d’immunobuvardage de lysats d’ovocytes en membranes totales et membranes plasmiques purifiées ont révélé que seule la forme sauvage atteint la membrane plasmique alors que le mutant T179N est séquestré dans la cellule. En accord avec ce résultat, les analyses de perméabilité fonctionnelle démontrent aussi une absence d’activité pour T179N. En cellule mpkCCDc14, le mutant T179N exprimé seul n’atteint pas la membrane plasmique suite à l’action de la forskoline, contrairement à la forme sauvage. Cependant, ce mutant peut s’associer à son homologue sauvage en coexpression tant dans les ovocytes qu’en lignée mpkCCDc14 sans toutefois engendrer l’effet typique de dominance négative. En fait, dans ce contexte de coexpression, on remarque une augmentation de la Pf de 83±7 % et une récupération d’adressage à la membrane plasmique en cellule (immunofluorescence). En conclusion, T179N serait un mutant récessif fonctionnellement récupérable lorsqu’en présence de l’AQP2 sauvage. / Aquaporin-2 (AQP2) is the channel responsible for the final reabsorption of water in the collecting duct of the kidney. Basically, contained in internal vesicles, the AQP2 is delivered to the apical membrane of the principal cells of the collecting tubule after stimulation by the antidiuretic hormone (ADH). The failure to perform this function causes nephrogenic diabetes insipidus (NDI); a disease characterized by the inability of the kidney to concentrate urine and induces the production of high urinary volumes. While recessive mutations generate poorly structured proteins unable to form tetramers, dominant mutations are capable of associating with their wild counterparts, thus generating a NDI even in heterozygous patients. This paper presents the biochemical and functional analysis of T179N, a new NDI-causing mutation of the human AQP2. The mutant is particularly interesting because of its dominant genotype, despite its extracellular position usually restricted to recessive mutations. Here, we compare T179N against archetypal recessive and dominant mutations using both Xenopus laevis oocytes and in mpkCCDc14 cell model, and show the recessive nature of the mutation. The immunoblot tests on oocytes lysates in purified total and plasma membranes revealed that only the wild type protein reaches the plasma membrane while the T179N mutant is sequestered within cellular stores. Accordingly, functional analyzes indicate that T179N is inactive. In mpkCCDc14 cells, T179N expressed alone does not reach the plasma membrane in response to forskolin stimulation, unlike the wild-type. However, T179N does show the capacity to associate with its wild-type counterpart in both oocytes and in mpkCCDc14 cells, although without displaying the typical dominant negative effect. In fact, when coexpressed along wild-type, T179N gains back the functionality, with a Pf increase of 83±7 % and adequate plasma membrane targeting in cells (immunofluorescence). In conclusion, the mutant T179N is a mild recessive mutation that is susceptible to functional recovery when in presence of wild type AQP2.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La fibrose systémique néphrogénique (FSN) est une maladie rare et relativement récente, observée uniquement chez des patients souffrant d’insuffisance rénale sévère ou terminale. Elle est liée à l’administration d’une certaine catégorie de complexes de gadolinium (CG), les CGs thermodynamiquement moins stables, utilisés comme produits de contraste pour l’imagerie par résonance magnétique. L’hypothèse mécanistique la plus couramment citée concerne les effets profibrosants du Gd3+ « libre » après dissociation in vivo des CGs les moins stables mais il n’en existe pas de démonstration formelle. La physiopathologie de cette maladie reste mal connue, notamment par manque de modèles précliniques pertinents. Les travaux de cette thèse répondent donc à la nécessité d’approfondir nos connaissances concernant les relations entre les propriétés physicochimiques des CGs (structure, stabilité) et le risque de toxicité chronique, afin de mieux comprendre leur rôle dans le mécanisme de la FSN. Nous avons mis aux points plusieurs modèles de FSN chez le Rat. Nous avons aussi comparé les effets de toutes les catégories structurales des CGs sur ces modèles. Une toxicité systémique importante et la survenue de lésions cutanées macroscopiques et d’une fibrose du derme sont notées après administration de gadodiamide (un CG linéaire et ionique de faible stabilité), ce qui est cohérent avec le fait que la grande majorité des cas de FSN sont associés à cet agent. Nous avons aussi montré que cette toxicité dépend du degré d’insuffisance rénale et que l’hyperphosphatémie sensibilise les animaux aux effets profibrosants du gadodiamide. Nos données suggèrent donc que ces facteurs associés sont des facteurs de risque de la FSN. Nous avons observé la dissociation progressive in vivo de deux CGs linéaires présentant une faible stabilité, le gadodiamide et l’acide gadopentétique, après administration chez le Rat insuffisant rénal, avec libération de Gd3+ sous forme libre et soluble. Les CGs macrocycliques sont restés stables. Nous avons confirmé cette stabilité sur du sérum de Rat et du sérum humain alors que le gadodiamide se dissocie in vitro. Nos données suggèrent aussi une interaction entre l’ion Gd3+ dissocié à partir du gadodiamide et les protéines sériques. Cette libération de Gd3+ est accélérée en présence d’une forte concentration de phosphate. Globalement, nos résultats suggèrent ainsi un rôle causal du Gd3+ libre dans les lésions cutanées observées chez les animaux insuffisants rénaux. Enfin, nous avons observé l’implication de la voie de signalisation canonique de TGFβ, le marqueur clé de la fibrose, uniquement chez des rats ayant reçu le gadodiamide et dont l’insuffisance rénale est modérée. Nos travaux sont donc en faveur de l’hypothèse mécanistique d’une dissociation des CGs peu stables. / Nephrogenic systemic fibrosis (NSF) is a rare systemic fibrosing disorder which has been described in patients with severe or end stage renal failure. NSF is associated with prior administration of certain gadolinium complexes (GCs), used as magnetic resonance imaging contrast agents, particularly those which have the lowest thermodynamic stability. The most widely accepted hypothesis regarding the mechanism is based on profibrotic effects of free Gd3+ following in vivo dissociation of the less stable GCs. Nevertheless, there is no conclusive evidence so far. The pathophysiology is not completely understood, especially due to the lack of relevant non-clinical models. The purpose of our thesis was to investigate the relationship between physicochemical properties of GCs (molecular structure, thermodynamic stability) and the risk of chronic toxicity (especially fibrosis), in order to enhance our understanding of their role in the mechanism of NSF. We have set-up various non-clinical models of NSF in renally-impaired rats. We also compared the effects of all categories of GCs on these models. A high systemic toxicity, associated with macroscopic skin lesions and dermal fibrosis, was observed after the administration of gadodiamide (a linear and nonionic GC with a low thermodynamic stability). Whereas more stable, macrocyclic GCs were well tolerated. These findings seem clinically-relevant because the vast majority of NSF cases are associated with gadodiamide. We also showed that systemic and skin toxicities depend on the baseline renal function, and that hyperphosphataemia sensitizes renally-impaired rats to the fibrotic effects of gadodiamide. Our data suggest that these factors are, actually, risk factors for NSF. We observed in vivo dissociation of two linear GCs, gadodiamide and gadopentetic acid, with gradual release of soluble Gd3+, in renally-impaired rats. Macrocyclic agents remained stable. This observation was also confirmed both in rat and human serum by the relaxometry technique. Our results are also consistent with an interaction between dissociated Gd3+ and serum proteins. We also demonstrated that elevated serum phosphate levels accelerates the release of Gd3+. Taken all together, our results suggest a causal role of dissociated Gd3+ in gadodiamide-induced skin lesions in renally-impaired rats. Finally, we identified the involvement of the canonical signaling pathway of TGFβ, the central mediator of the fibrotic response, in gadodiamide-treated rats with a moderate renal failure. Our work is consistent with a causal role of dissociated Gd in the mechanism of NSF.