Cette thèse de doctorat est une étude de la biologie et de la dynamique des microARN circulants, démontrant leur potentiel comme biomarqueurs pour l’amélioration de la surveillance et de l’évaluation pronostique dans le cancer. Il s’agit des ARN non codants simple-brin, d'environ 19-25 nt de longueur. Ils jouent un rôle clé dans la régulation de l'expression génomique au niveau post-transcriptionnel, en ciblant et réprimant la traduction des ARNm par complémentarité partielle avec leur 3'-UTR. Ils sont également libérés dans le milieu extracellulaire, la circulation et les liquides biologiques. Leur stabilité remarquable et leur diversité dans la circulation, ainsi que leur provenance maligne ou normale, en font des candidats biomarqueurs intéressants, reflétant potentiellement l'état et la dynamique d’une tumeur. Nous nous sommes focalisés sur les carcinomes ovariens (OvCa) et nasopharyngés (NPC), essayant d'élucider la relation entre les miARN plasmatiques et le pronostique des OvCa après une première ligne de traitement, ainsi que d’évaluer leur utilité dans la détection d’une réponse précoce des NPC au traitement. Le carcinome ovarien séreux est la malignité gynécologique la plus agressive. L'absence de symptômes précoces et l'insuffisance des moyens modernes pour détecter la maladie résiduelle et évaluer les résultats du traitement signalent le besoin de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques. En utilisant des prélèvements plasmatiques séquentiels OvCa avant et après traitement, nous avons étudié un groupe de miARN, en comparaison à des lésions pelviennes bénignes et des femmes en bonne santé. MiR-200b avait une concentration nettement plus élevée dans les échantillons malins avant traitement par rapport aux deux groupes non cancéreux. L'analyse pré- et post-traitement de miR-200b en parallèle avec le biomarqueur standard CA125 a révélé des variations distinctes et une corrélation significative de la variation de miR-200b avec le temps de rémission (PFS). Nous concluons que miR-200b pourrait éventuellement être utilisé comme biomarqueur supplémentaire pour l'estimation de la rémission à la fin du traitement. Le carcinome nasopharyngé (NPC) d'autre part est une tumeur constamment associée à une infection latente des cellules malignes par le virus d’Epstein-Barr (EBV), présentant une distribution géographique particulière. La position de la tumeur rend difficile l'approche chirurgicale, les biomarqueurs évaluant différentes approches thérapeutiques étant de grande importance. Etudiant une nouvelle forme orale de l'agent démethylant 5-azacytidine, démontrée prometteuse pour un tiers des patients NPC qui l’ont reçue, nous avons essayé d'évaluer son impact sur l'expression des miARN et des protéines virales. Malgré l'infection virale latente, les miARN viraux sont abondamment exprimés. En traitant pendant deux semaines quatre modèles de tumeur NPC développés in vivo, nous avons observé une réponse nette dose-dépendante dans les deux. L'analyse protéique a montré une induction de la protéine activatrice du cycle lytique BZLF1, renforçant les preuves antérieures d'induction partielle du cycle lytique viral par la 5-azacytidine. L'analyse des miARN a confirmé l'expression robuste des miARN BART et l'absence des miARN BHRF1 dans les NPC sans traitement. Lors du traitement, nous avons détecté les miR-BHRF1 à la fois dans la tumeur et le plasma des souris traitées. Cette induction a été validée par un traitement ultérieur d'une semaine qui a aussi mis en évidence l'induction de l’expression de l'ARNm de BHRF1, transcrit par le locus situé parmi les miARN BHRF1. Une induction de ces miARN a été observée après traitement par des agents de chimiothérapie, suggérant une utilité clinique potentielle des miR-BHRF1 comme biomarqueurs pour l’évaluation précoce de l’efficacité du traitement. Notre objectif actuel est de valider cette induction par chimiothérapie et étendre nos études au plasma humain. / This doctorate thesis provides an insight into the biology and dynamics of circulating microRNAs, demonstrating their potential to become crucial biomarkers for a better surveillance and prognosis of cancer. MicroRNAs (miRNAs) are small, single-stranded non-coding RNAs, 19-25 nt long, with a key role in the post-transcriptional regulation of gene expression, repressing the translation of target mRNAs through partial base-pair complementarity with their 3’-UTR. They can be released in the extracellular medium, being protected from RNases by association with various transporters and reach body fluids and circulation, participating in intercellular communication. Their remarkable stability and manageable diversity in circulation, as well as the fact that they derive from both malignant and normal cells make them very attractive biomarker candidates, potentially reflecting tumor state and dynamics. We have been focusing on ovarian (OvCa) and nasopharyngeal (NPC) carcinomas, attempting to elucidate the relation between plasma miRNAs and the prognosis of OvCa after first-line treatment, as well as to evaluate their use in the detection of early response of NPC tumors to treatment. Serous epithelial ovarian carcinoma is the most frequent ovarian and the most aggressive gynecologic malignancy. The absence of early symptoms and the insufficiency of modern means to accurately map residual disease and assess treatment outcome highlight the need for new diagnostic and prognostic biomarkers. Using sequential plasma samples from OvCa patients before and after first-line treatment, we studied a pre-selection of miRNAs, comparing them to samples from benign pelvic lesions and healthy women. MiR-200b exhibited a distinct higher concentration in malignant samples before treatment compared to both non-cancerous groups. Pre- and post-treatment assessment of miR-200b in parallel with the standard biomarker CA125 revealed distinct variations and a significant correlation of miR-200b variation with the progression-free survival (PFS) of the patient. We suggest that miR-200b could eventually be used as a supplementary biomarker for estimation of the remission upon treatment completion. Nasopharyngeal carcinoma (NPC) on the other hand is a tumor consistently associated to latent Epstein-Barr virus (EBV) infection of the malignant cells, presenting a unique geographical incidence pattern. The deep position of the tumor makes it tough to access surgically, with biomarkers assessing different therapeutic approaches being greatly needed. Studying a new oral form of the demethylating agent 5-azacytidine, proven to be promising for one third of NPC patients receiving it as a monodrug, we attempted to identify impact of the drug on the expression of viral miRNAs and proteins. Despite the latent viral infection, viral miRNAs are abundantly expressed, attracting interest in EBV-associated malignancies. Treating four in vivo developed NPC tumor models for two weeks, we observed clear response in two of them, in a dose-dependent manner. Protein analysis showed an induction of the immediate-early lytic protein BZLF1, solidifying previous evidence of partial activation of the viral lytic cycle by 5-azacytidine. MiRNA analysis confirmed robust expression of BART and absence of BHRF1 miRNAs at baseline status of NPC. Upon treatment, we observed an induction of BHRF1 miRNAs in both tumor and plasma of treated mice. This induction was successfully validated in a following one-week treatment and completed by a recorder de novo expression of the BHRF1 mRNA, transcribed within the BHRF1 miRNA loci. A weaker induction of BHRF1 miRNAs was also recorded after treatment with standard chemotherapeutic agents, suggesting a potential clinical utility of these miRNAs as circulating biomarkers for detection of early response to treatment. We are further working to confirm this induction by chemotherapy and extend our study to plasma samples derived from treated patients.

Contexte. Les carcinomes des voies aérodigestives supérieures (VADS) arrivent en 6ème position parmi les cancers les plus fréquents au niveau mondial. La fonction du récepteur TLR3 dans les cellules de carcinomes des VADS est encore très mal comprise. Objectifs et méthodes. 1) Déterminer le niveau d’expression du récepteur TLR3 dans les lignées et les biopsies de carcinomes des VADS par western blot et par immunohistochimie. 2) Etudier le rôle de TLR3 dans la croissance tumorale de ces tumeurs, en utilisant notamment des lignées invalidées de façon conditionnelle pour TLR3. 3) Evaluer in vitro les effets cytotoxiques de ligands artificiels de TLR3 soit seuls, soit utilisés en combinaisons avec un inhibiteur d’IAP (inhibitor of apoptosis protein).Résultats. La protéine TLR3 est détectée à un niveau élevé en western blot dans les lignées de carcinomes des VADS étudiées, comparativement à un panel d’autres tumeurs épithéliales humaines. TLR3 est également constamment détecté en immunohistochimie dans les biopsies. TLR3 semble jouer un rôle dans la croissance tumorale des carcinomes des VADS : dans certaines conditions de culture (culture en hypoxie ou en milieu pauvre en SVF et en nutriments), la stimulation de TLR3 par un ligand exogène, le poly(A:U), favorise la croissance des cellules tumorales. Nous avons étudié l’effet de la stimulation de TLR3 sur le métabolisme glucidique dans ces mêmes cellules en utilisant un appareil de type Seahorse® qui mesure la consommation d’oxygène et la production de protons à partir de cellules cultivées en microplaques. Ces expériences montrent que la stimulation de TLR3 fait augmenter l’activité des voies du métabolisme cellulaire anaérobie (glycolyse extra-mitochondriale). Une étude métabolomique a mis en évidence des différences significatives dans le profil métabolique des cellules tumorales stimulées par le poly(A:U) comparativement aux cellules non traitées. Par ailleurs, nous avons montré que la stimulation de TLR3 permettait de détecter le facteur de transcription HIF1 en Western blot, même en conditions normoxiques. Sachant que des ARN libérés par des cellules en état de nécrose peuvent stimuler TLR3, il est tentant de penser que ce récepteur pourrait favoriser la survie des cellules malignes en zone hypoxique au voisinage de cellules nécrotiques. Néanmoins, l’expression de TLR3 représente aussi un facteur de vulnérabilité pour les cellules de carcinome des VADS : en effet les ligands artificiels de TLR3 utilisés en combinaison avec un inhibiteur d’IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) produisent des effets cytotoxiques sur les lignées de carcinomes des VADS étudiées. / Background. Head and Neck (HN) carcinomas are the 6th most frequent type of cancer worldwide. The role of the TLR3 receptor in HN carcinomas remains poorly understood.Objectives and Methods. 1) To assess the expression level of TLR3 in HN carcinoma cell lines and biopsies by Western blot and immunohistochemistry, respectively. 2) To study the role of TLR3 in tumour growth using specific cell lines with conditional knock-down of TLR3. 3). To assess in vitro the cytotoxic effects of artificial ligands of TLR3 used either alone or in combination with an IAP (inhibitor of apoptosis protein) inhibitor.Results. TLR3 protein was detected at a high level by Western blot analysis in HN carcinoma cell lines, by comparison with a panel of other human epithelial cancer cell lines. TLR3 was also consistently detected by immunohistochemistry in tumour biopsies. TLR3 seem to play a role in HN carcinoma cell growth: under certain culture conditions (hypoxic or low fetal calf serum/low nutrient culture conditions), TLR3 stimulation by a synthetic ligand, the poly(A:U), favours tumour cell growth. We investigated the effects of TLR3 stimulation on glucose metabolism using a Seahorse® analyzer, which measures the oxygen consumption and the proton production in living cells. Our results indicate that TLR3 stimulation induces an increase in anaerobic metabolism (extra-mitochondrial glycolysis). A metabolomic study revealed significant changes in the metabolic profile of cancer cells treated by poly(A:U) by comparison with untreated cells. We also showed that under TLR3 stimulation, HIF1 became detectable by Western blot analysis, even in normoxia. Given the fact that RNA fragments released by dying cells are able to trigger TLR3, one can assume that TLR3 might favour cancer cell survival in hypoxic areas located near the necrotic core of the tumour. However, TLR3 expression is also a factor of vulnerability for HN carcinoma cells: indeed, the combination of TLR3 artificial ligands with an IAP inhibitor has a strong cytotoxic effect on HN carcinoma cells in vitro.