Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-02-16T03:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337514.pdf: 3562491 bytes, checksum: 171ae47ad0c0497bc60ce3ef9488738e (MD5) Previous issue date: 2015 / O objetivo deste trabalho é contribuir para o avanço do processo tecnológico de extração de P(3HB), obtido a partir de Cupriavidus necator DSM 545, com o desenvolvimento de um processo que combina a aplicação de método mecânico com o solvente carbonato de propileno. Este estudo está dividido em quatro partes. A primeira parte consiste no estudo da influência das variáveis de processo dos métodos mecânicos, ultrassom e homogeneizador à alta pressão, na recuperação e pureza do polímero extraído com carbonato de propileno (150 °C e tempo de contato células solvente de 45 min). Neste estudo as variáveis para aplicação de ultrassonificação foram potência e tempo do ciclo de aplicação e, na homogeneização à alta pressão foram pressão de operação e número de passagens da suspensão celular pelo equipamento. Os resultados demonstraram que, no método de extração que combina aplicação de homogeneizador à alta pressão e solvente, a melhor condição foi obtida com a pressão de 1300 bar e duas passagens pelo equipamento, pois foram obtidos os melhores resultados de recuperação de P(3HB) (97,7 %) com elevada pureza (97,8 %) e menor degradação da massa molar em relação às outras condições testadas. A extração com ultrassom e solvente também mostrou-se eficaz pois, na melhor condição de tratamento da biomassa com ultrassom, potência de 200 W e três ciclos de aplicação de 59 s, foi possível obter elevada recuperação polimérica (92,0 %) com pureza de 99,0 %. Com base nas condições de aplicação de ultrassom e homogeneização à alta pressão definidas anteriormente, na segunda parte deste estudo foi realizada a avaliação cinética da influência de variáveis do processo de extração: tratamento da biomassa (homogeneizador à alta pressão e ultrassom) para efeito comparativo realizaram-se também ensaios a partir de biomassas sem tratamento e tratadas termicamente, temperatura de extração (130 e 150 °C) e tempo de contato células/solvente (5, 15, 30 e 45 min) sobre a porcentagem de recuperação e porcentagem de pureza do polímero extraído. Uma vez definido o melhor tratamento da biomassa a ser aplicado em conjunto com carbonato de propileno como método de extração de P(3HB) e, foi verificada a influência deste processo na massa molar do polímero extraído. O método de extração de P(3HB), que associa o tratamento da biomassa com homogeneizador à alta pressão e recuperação polimérica com carbonato de propileno a 150 °C por 5 min, foi definido como o mais eficiente para obtenção de elevadas porcentagens de recuperação de P(3HB) (93,6 %) e pureza (99,0 %) emum menor tempo de contato das células com o solvente, além da menor degradação da massa molar do polímero extraído. A terceira parte é referente ao estudo das variáveis do processo de homogeneização à alta pressão e carbonato de propileno na recuperação, pureza e características do polímero extraído. Para este estudo, foram variadas as pressões de operação (500, 900, 1300 e 1500 bar), número de passagens (1, 2 e 3) e o tempo de contato das células com solvente (5 e 15 min). A melhor condição de extração foi obtida com a pressão de 900 bar e 5 min de contato das células com carbonato de propileno aquecido a 150 °C, pois foram obtidos elevados percentuais de recuperação de P(3HB) (97,8 %) com apenas uma passagem da biomassa pelo homogeneizador. Através da caracterização do polímero extraído na melhor condição, verificou-se que o mesmo apresentou características térmicas e de massa molar semelhantes aos polímeros (P(3HB)) comerciais. Por fim, a última parte desse trabalho está relacionada com o efeito da reutilização do carbonato de propileno, recuperado do processo de extração de P(3HB) sobre a porcentagem de recuperação e porcentagem de pureza do biopolímero extraído e com a avaliação das perdas de solvente nas etapas do processo de extração. Foi observada a possibilidade de recuperar 80 % do carbonato de propileno no processo de extração do P(3HB). Sendo que dos 20 % de carbonato de propileno não recuperado, 5 % é referente à perda de solvente no processo de separação deste da água, sendo o restante proveniente de perdas nas etapas de filtração (11 %) e nos resíduos celulares (4 %). O solvente recuperado foi reutilizado por onze vezes sem perder a eficiência no rendimento e na pureza do polímero obtido. Assim, o conjunto de dados obtidos neste estudo é relevante para a melhoria do processo de extração de P(3HB) produzido por C. necator, pois propõe o desenvolvimento de um método de extração eficaz que combina homogeneização à alta pressão e carbonato de propileno, solvente de baixa toxidade que pode ser reutilizado no processo de extração, contribuindo para a redução dos custos de produção deste biopolímero, o que torna a extração de P(3HB) com este solvente mais competitiva no que se refere à economicidade do processo.<br> / Abstract : The aim of this work was to contribute to the advancement on the technological process of P(3HB) extraction by Cupriavidus necator DSM 545, with the development of a process with the combination of a mechanical method and the solvent propylene carbonate. This study is divided into four parts. The first one was the study of the influence of the mechanical process variables using ultrasound and high pressure homogenizer, on the recovery and purity of the extracted polymer with propylene carbonate (150 °C during 45 min). In this study the variables were the power of applying ultrassonification and application time and in the high pressure homogenization method, the variables were the operating pressure and the cell suspension number of passages through the device. The results showed that, in the method that combines the homogenizer at high pressure and solvent, the best condition was obtained with 1300 bar and two passages, with the best recovery results of P (3HB) (97.7 %) with high purity (97.8 %) and lower molecular weight degradation against other conditions tested. The method with solvent and ultrasound was also effective, because using ultrasound with 200 W of potency and three 59 s application cycles, it was possible to obtain high polymer recovery (92 %) with purity of 99.0 %. Based on ultrasound application conditions and high pressure homogenization previously defined, the second part of this study was performed to evaluate the influence of kinetic extraction process variables: biomass treatment (homogenizer at high pressure and ultrasound, for comparison biomass thermally treated and untreated were performed); the extraction temperature (130 to 150 °C) and contact time cells/solvent (5, 15, 30 and 45 min). Once defined the best treatment of the biomass to be used with propylene carbonate, and its influence on the process, the molecular weight of the extracted polymer was verified. The P(3HB) extraction method combining the biomass treatment using high pressure homogenizer and propylene carbonate at 150 °C for 5 min, was the most efficient for achieving high recovery percentages P(3HB) (93.6 %) and purity (99.0 %) in a shorter time of contact of the cells with the solvent, in addition to less degradation of the molecular weight of the polymer. The third part relates the study of the process variables using high pressure homogenization and propylene carbonate on the purity and recovery of P(3HB) and at the characteristics of the extracted polymer. In this part of the work, different operating pressures (500, 900, 1300 and 1500 bar) and number of passages (1, 2 and 3) were tested as wellas the contact time between the cells and the solvent (5 and 15 min). The best performance was obtained by the combination of treatment with high-pressure homogenizer (900 bar) and extraction with propylene carbonate, during 5 min, at 150 ºC, the recovery of P(3HB) was 97.8 % with only one biomass passage through the homogenizer. The characterization of the polymer extracted in the best condition, showed that it had thermal characteristics and molecular weight similar to the comercial P(3HB). The last part of this work related the effect of propylene carbonate reutilization on the percentage of recovery and purity of the extracted biopolymer and the evaluation of the solvent loss during the steps of the process. The ability to recover 80 % of propylene carbonate in the extraction process P(3HB) was observed. Since 20 % of unrecovered propylene carbonate, 5 % is related to the loss of solvent in the separation process of this water, the remainder being losses from filtration steps (11 %) and cellular debris (4 %). The recovered solvent was reused eleven times without losses in the yield and purity of the obtained polymer. Thus, the set of data from this study is relevant to improve the P(3HB) extraction process produced by C. necator, it proposes the development of an efficient extraction method that combines high pressure homogenization and propylene carbonate, a low toxicity solvent which can be reused in the extraction process, contributing to reduction of production costs of this biopolymer, which makes the extraction of P(3HB) with this solvent more competitive in respect to economy of the process.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320324.pdf: 4531539 bytes, checksum: 687157b7d5c30ecd557ae206ed694ba4 (MD5) / O poli(3-hidroxibutirato) - P(3HB), é um poliéster natural e biodegradável, produzido por cultura bacteriana, sendo considerado um atrativo substituto para os polímeros petroquímicos. O glicerol, por sua vez, que teve sua disponibilidade no mercado ampliada em decorrência da política nacional de estímulo à adição de biodiesel nos combustíveis fósseis, pode ser utilizado para diversas finalidades. Dentre elas, destaca-se seu uso como fonte de carbono no cultivo de micro-organismos. Diante da disponibilidade de glicerol, objetivou-se neste trabalho utilizá-lo como fonte de carbono adicional na produção de P(3HB). Foram realizados ensaios preliminares nos quais foi avaliada a possibilidade do uso do glicerol proveniente da produção do biodiesel na biossíntese do P(3HB). Em seguida, foram realizados ensaios planejados por meio de um delineamento composto central rotacional (DCCR) 23 com 3 pontos centrais no qual foram avaliadas a influência da temperatura e das concentrações de açúcar invertido e glicerol no crescimento de Cupriavidus necator, bem como na produção e acúmulo do polímero pela célula, ensaio este que foi em seguida validado em triplicata avaliando sua cinética. A melhor condição validada teve sua escala ampliada para biorreator de 2 L, também com avaliação cinética e extração dos filmes para a sua caracterização físico-química, térmica e mecânica. E, finalmente, foram realizados os ensaios de biodegradação em solo e exposição em câmara de envelhecimento acelerado, com avaliação do material degradado. Nos ensaios preliminares constatou-se que o glicerol bruto poderia ser utilizado como fonte de carbono adicional ao meio de cultivo de C. necator. Os resultados do DCCR revelaram que o aumento da temperatura levou a um incremento na produção e no acúmulo de P(3HB) e que, quando foram utilizados 15 g L-1 de glicerol, chegou-se a resultados de acúmulo 15 % superiores, porém não considerados como estatisticamente significativos. O modelo obtido no DCCR foi validado para todas as condições para o acúmulo percentual de P(3HB) e para a produção de polímero diferiu em 3 % do valor experimental obtido para a condição a 38 °C, 15 g L-1 de açúcar invertido e 15 g L-1 de glicerol, para as demais condições testadas o modelo foi validado. Em biorreator, foram realizados cinco ensaios, sendo que para os ensaios com adição de glicerol bruto como substrado ou cosubstrato não houve crescimento ou produção de P(3HB) viável para extração. Na caracterização dos polímeros sintetizados em biorreator com e sem adição de glicerol puro, verificou-se que o uso do glicerol não modificou as propriedades dos filmes, mas foi possível afirmar que os polímeros obtidos e extraídos nesse trabalho eram mesmo o P(3HB). Em solo, as amostra degradaram em 35 dias, enquanto na exposição dos filmes à câmara de envelhecimento acelerado notou-se maior estabilidade das amostras o que permitiria a aplicação do polímero no ambiente, sem que ele se degradasse <br> / Abstract: Poly(3-hydroxybutyrate) - P(3HB) is a natural, biodegradable polyester, produced by bacterial fermentation, and considered an attractive replacement for petrochemical polymers. Glycerol had expanded its availability in the market due to the national policy of encouraging the addition of biodiesel in fossil fuels, the glycerol can be used for several purposes. Among them, its use as a carbon source for the cultivation of microorganisms has been highlighted. Through the availability of glycerol, this study aimed to use it as an additional carbon source on the production of P(3HB). First of all, preliminary tests were conducted to evaluate the possibility of the use of glycerol from the biodiesel production in the biosynthesis of P(3HB). Then, tests were conducted planned by a central composite rotatable design (CCRD) 23 with three central points in order to evaluate the influence of the temperature and the concentrations of inverted sugar and glycerol on Cupriavidus necator growth, as well as the production and accumulation of the polymer into the cell. The experiments were made in triplicate and the kinetics were evaluated. The best condition of the process had their range expanded to 2 L bioreactor. The kinetic were evaluated and the films obtained had its physical-chemical, thermal and mechanical properties evaluated. Finally, biodegradation in soil assays were performed and exposure chamber accelerated aging was performed, with evaluation of the degraded material. In preliminary tests it was found that crude glycerol could be used as an additional carbon source to the culture medium of C. necator. The results of the CCRD revealed that the increase of the temperature led to an increase in the production and accumulation of P(3HB) and when 15 g L-1 of glycerol were added to the medium, an accumulation of 15% was reached, but not considered as statistically significant. The model obtained in CCRD was validated for all conditions for the accumulation percentage of P (3HB) and the polymer production differed in 3 % of the value obtained for the experimental condition at 38 °C, 15 g L-1 of inverted sugar and 15 g L-1 of glycerol, for the other conditions tested the model was validated. Five tests were performed in bioreactor, and no growth or production of P (3HB) viable for extraction was identified for assays with crude glycerol as substrate or co-substrate. In the characterization of the polymers synthesized in bioreactor with and without addition of pure glycerol, it was found that the use of glycerol did not modify the film properties, but it was possible to say that the polymers extracted were P(3HB). In soil, the samples degraded in 35 days, while the films that was exposed at the accelerated aging chamber presented greater stability of the samples which would allow the application of the polymer in the environment without degradation.

This diploma thesis deals with the use of thermal analysis in the study on effects of microbial inhibitors. The main aim of this work was to determine the utilization of the method, which is mainly used in different fields of science and research. Three bacterial strains: Cupriavidus necator H16, its mutant strain Cupriavidus necator PHB-4 and Halomonas halophila, were used as model microorganisms. The inhibitory effect of levulinic acid on growth and metabolic activity was monitored by microcalorimetry. It was found that bacteria were able to adapt to levulinic acid to a certain concentration - Cupriavidus necator to 5 g/l and Halomonas halophila to 2 g/l. The thermal analysis results were compared to a conventional method, which is commonly used to study the growth of microorganisms.

This diploma thesis deals with the applicability of thermal analysis in the influence of stress factors on microorganisms. The main aim of the presented work was to design and implement a series of experiments to thest the usability of advanced methods of thermal analysis in the characterization of microorganisms. Two bacterial strains were used as model organisms: Cupriavidus necator H16 and its mutant strain Cupriavidus necator PHB-4, which differs in the ability to produce polyhydroxyalkanoates. The basic technique used thermogravimetric analysis (TGA), which was optimized and applied in the study of water transport, behavior and determination of intracellular water content with respect to the influence of the presence of intracellular PHB granules. The results of this method were subsequently supported by TEM photos.

This thesis deals with the effect of magnetic field and organic substances, namely benzene and p-nitrophenol, on cell of PHA producing bacteria Cupriavidus necator H16 and mutant strain Cupriavidus necator PHB4, which does not produce polyhydroxyalkanoates. Static magnetic field was generated by both permanent magnet and electromagnet. The effect of magnetic field on the growth of bacterial cells was studied using growth curves. It was found that cultivation in magnetic field and mineral medium mostly inhibits bacterial growth. Also the amount of polyhydroxyalkanoates was observed using FT-IR, flow cytometry and microscopy with fluorescent dye. Growth curves and flow cytometry were also used to study the influence of organic substances on bacterial cells. It was found that while benzene does not affect either C. necator H16 or C. necator PHB4, p-nitrophenol acts as the inhibitor of bacterial growth for both cultures. Finally the impact of p-nitrophenol on the accumulation of PHA was studied using gas chromatography.

The aim of the master thesis was to study the effect of the accumulation of polyhydroxyalkanoates (PHA) for bacterial resistance to selected stress factors. In the theoretical part the selected stress factors, polyhydroxyalkanoates and the involvement of polyhydroxyalkanoates into stress response of bacteria were reviewed. In the experimental part we used bacteria Cupriavidus necator H16 and its mutant strain Cupriavidus necator H16/PHB-4 unable of polyhydroxybutyrate (PHB) accumulation. The resistance of above-mentioned bacterial strains against thermal and osmotic stress was tested. According to the results of the experiment, when the bacteria were exposed to three different concentrations of NaCl (50, 100 and 200 g/l) PHB accumulating strain showed a higer resistance to hyperosmotic stress than the strain unable of PHB accumulation. There was demonstrated with Raman spectroscopy that in the hyperosmotic environment induced crystallization of the intracellular PHB granules. Transmission electron microscopy indicated that strain Cupriavidus necator H16/PHB-4 is subject to plasmolysis during hyperosmotic stress. As a consequence the hyperosmomotic stress occurs to the aggregation intracellular PHB granules in strain Cupriavidus necator H16 but there is no plasmolysis or is much less intensive.

O aproveitamento da energia luminosa por bactérias que produzem hidrogenases poderia aumentar a eficiência do processo de produção de biohidrogênio. Neste trabalho, foi realizada a clonagem do gene que codifica a proteorrodopsina (PR) do isolado metagenômico SAR86 num plasmídeo de expressão para bactérias Gram-negativas. PR é uma proteína ligada ao cromóforo retinal, que, sob iluminação, promove o efluxo de prótons através da membrana celular. O excesso de prótons na face externa da membrana pode servir como substrato para a hidrogenase, resultando em maior eficiência na produção de hidrogênio (2H+ + 2e&rarr; H2). O plasmídeo contendo o gene da PR foi utilizado na transformação genética das bactérias Cupriavidus necator e Escherichia coli, que produzem diversas hidrogenases. Enquanto a PR não se mostrou funcional em C. necator, na linhagem recombinante de E. coli, cultivada em presença de luz e retinal, foi obtido um aumento de até 2,17 vezes na produção de H2 em relação ao cultivo no escuro, desde que a linhagem estivesse produzindo a hidrogenase endógena HYD-4. / The utilization of light energy by hydrogenase producing bacteria could increase the efficiency of the biohydrogen production process. In the present work, the gene coding for proteorhodopsin (PR) of the SAR86 metagenomic lineage was cloned in an expression plasmid for Gram-negative bacteria. PR is an apoprotein linked to the chromophore retinal, which, upon illumination, promotes proton efflux across the cell membrane. The excess of protons on the plasma membrane surface may serve as a substrate for hydrogenases, resulting in a higher efficiency of hydrogen production (2H+ + 2e&rarr; H2). The plasmid containing the PR gene was used to transform the Gram-negative bacteria Cupriavidus necator and Escherichia coli which produce several hydrogenases. Whereas PR did not display functionality in C. necator, in the recombinant E. coli cells, grown under illumination in the presence of retinal, an enhancement up to 2.17 fold in H2 production was found, relative to cells grown under darkness, provided that the cells were expressing the endogenous HYD-4 hydrogenase.

O aproveitamento da energia luminosa por bactérias que produzem hidrogenases poderia aumentar a eficiência do processo de produção de biohidrogênio. Neste trabalho, foi realizada a clonagem do gene que codifica a proteorrodopsina (PR) do isolado metagenômico SAR86 num plasmídeo de expressão para bactérias Gram-negativas. PR é uma proteína ligada ao cromóforo retinal, que, sob iluminação, promove o efluxo de prótons através da membrana celular. O excesso de prótons na face externa da membrana pode servir como substrato para a hidrogenase, resultando em maior eficiência na produção de hidrogênio (2H+ + 2e&rarr; H2). O plasmídeo contendo o gene da PR foi utilizado na transformação genética das bactérias Cupriavidus necator e Escherichia coli, que produzem diversas hidrogenases. Enquanto a PR não se mostrou funcional em C. necator, na linhagem recombinante de E. coli, cultivada em presença de luz e retinal, foi obtido um aumento de até 2,17 vezes na produção de H2 em relação ao cultivo no escuro, desde que a linhagem estivesse produzindo a hidrogenase endógena HYD-4. / The utilization of light energy by hydrogenase producing bacteria could increase the efficiency of the biohydrogen production process. In the present work, the gene coding for proteorhodopsin (PR) of the SAR86 metagenomic lineage was cloned in an expression plasmid for Gram-negative bacteria. PR is an apoprotein linked to the chromophore retinal, which, upon illumination, promotes proton efflux across the cell membrane. The excess of protons on the plasma membrane surface may serve as a substrate for hydrogenases, resulting in a higher efficiency of hydrogen production (2H+ + 2e&rarr; H2). The plasmid containing the PR gene was used to transform the Gram-negative bacteria Cupriavidus necator and Escherichia coli which produce several hydrogenases. Whereas PR did not display functionality in C. necator, in the recombinant E. coli cells, grown under illumination in the presence of retinal, an enhancement up to 2.17 fold in H2 production was found, relative to cells grown under darkness, provided that the cells were expressing the endogenous HYD-4 hydrogenase.

This diploma thesis deals with the study of the utilization of Raman spectroscopy and Raman tweezers for analysis and isolation of polyhydroxyalkanoates (PHA) producing bacteria. Using gas chromatography with FID detection, we determined the polyhydroxybutyrate (P(3HB)) content of the PHA biomass of bacterial strains Burkholderia cepacia, Halomonas halophila, Cupriavidus necator H16 and its mutant strain Cupriavidus necator H16/PHB-4 and Lactobacillus delbrueckii, which is not a producer of polyhydroxyalkanoates but this bactrea was selected as representative of Gram-positive bacteria. Subsequently, thanks to Raman microspectroscopy, Raman tweezers and FT-IR spectrometer in combination with Raman FT-module, we were able to confirm or disprove the presence of P(3HB) in bacteria. Furthermore, the thesis describes Cupriavidus necator H16, which is a model organism for the production of P(3HB), and his mutant strain Cupriavidus necator H16/PHB-4. The bacterial strain Cupriavidus necator H16 was cultivated in a production mineral medium of various nitrogen contents, while cultivation was also carried out in liquid Nutrient Broth. By this cultivation we were able to reach various P(3HB) content in bacterial biomass, the spectra were subsequently compared with the spectrum of the bacterial strain Cupriavidus necator H16/PHB-4. Raman spectroscopy is well used to characterize the composition of individual bacterial cells, is a fast, versatile, and virtually non-invasive tool for studying cells.

In questo lavoro si intende indagare l'effetto degli anti-oidici più diffusi al fine di individuare nuovi approcci per la ricerca sui fungicidi. Le analisi statistiche mostrano che meptildinocap, zolfo, metrafenone e penconazolo, somministrati a dosi di etichetta, prevengono le infezioni di Erysiphe necator qualora applicati fino a 12 giorni prima dell'inoculazione. Meptildinocap e zolfo conservano una buona efficacia anche se applicati fino a 9 e 6 giorni dopo l'inoculazione. Meptildinocap neutralizza il massimo numero di conidi entro 6 giorni dal trattamento. La meta-analisi multivariata eseguita su prove di campo dimostra che tutti i fungicidi riducono la gravità delle infezioni su grappolo oltre l'80%, qualora applicati da 3 a 13 volte a dosi di etichette secondo il criterio fenologico. Nonostante cyflufenamid, quinoxyfen, fenarimol, fenarimol+zolfo, propiconazolo e kresoxim-metil+boscalid siano significativamente più efficaci dello zolfo, la loro applicazione ripetuta rappresenta una condizione favorevole all’insorgenza di resistenze. L’ approccio chemio-metrico all’ analisi dei dati ottenuti da microanalisi in microscopia SEM a raggi X mostra che meptildinocap induce modificazioni nei rapporti tra Ca e Al e P e S sulla parete dei Chasmoteci trattati. Tali modificazioni sono probabilmente dovute al dissolvimento della membrana plasmatica. Questi nuovi approcci possono rappresentare un'utile integrazione ai metodi già noti. / In this work the effect of the most widespread fungicides used for Erysiphe necator management is investigated in order to test new approaches to fungicide research. ANCOVA and Tukey’s post hoc tests showed that meptyldinocap, sulfur, metrafenone and penconazole administrated at label rates prevent E. necator infections when applied up to 12 days before inoculation. Meptyldinocap and sulfur preserve a good efficacy even when applied until 9 and 6 days after inoculation. Meptyldinocap significantly increases E. necator conidia mortality within 6 days exposure. The multi-treatment meta-analysis performed on field trials shows that all fungicides reduce disease severity over 80% on vine bunches when applied from 3 to 13 times at label rates with the phenological criterion. Although cyflufenamid, quinoxyfen, fenarimol, fenarimol+sulfur, propiconazole and kresoxim-methyl+boscalid are significantly more effective than sulfur their repeated application in vineyard represents an important E. necator resistance risk. The application of chemo-metric approach to data earned by SEM X-ray microanalysis shows that meptyldinocap leads to modifications in the relationships between Ca and Al and P and S in treated Chasmothecia wall. Such modifications are probably due to the plasma membrane disruption. The new approaches tested here may represent a useful integration of already known methods.