Le syndrome de Prader-Willi est une maladie génétique rare. Les gènes candidats au SPW, dont le gène Necdin, sont régulés par l'empreinte génomique parentale : seul l'allèle paternel de ces gènes est exprimé, l'allèle maternel étant silencieux. Notre équipe a généré un modèle murin pour lequel l'allèle paternel de Necdin a été désactivé (+m/-p) et qui présente des similarités phénotypiques avec les patients PW. Ce phénotype est plus drastique chez les animaux -/-. Nous avons alors émis l'hypothèse que l'allèle maternel puisse avoir un rôle fonctionnel dans la survie des souris (+m/-p). L'expression de l'allèle maternel de Necdin est présente dans le système nerveux des souris (+m/-p). Cette expression, bien que faible au niveau transcriptionnel, est suffisante pour produire la protéine Necdin, ce qui a des conséquences cellulaires et physiologiques qui in fine permettent une amélioration du phénotype. Cette perte de silence de l'allèle maternel est également détectée dans l'hypothalamus de patients PW. Ces résultats révèlent une plasticité épigénétique inattendue qui permet d'envisager des perspectives thérapeutiques. / The Prader-Willi Syndrome (PWS) is a rare genetic disorder. Several genes, including NECDIN gene, are involved in the PWS. These genes are regulated by the genomic imprinting mechanism: only the paternal allele of these genes is expressed, their maternal allele being silenced. Our team has generated a mouse model in which the paternal allele of the Necdin gene has been deactivated (+m/-p). This model presents phenotypical similarities with PWS patients. We observed that mortality affects more -/- pups than +m/-p mice. Therefore we venture the hypothesis of a functional role of the maternal allele in mutant mice survival. We showed an expression of this allele in the nervous system of +m/-p mice. Though transcriptionnally low, that is sufficient to produce the Necdin protein and provoke cellular as well as physiological consequences that actively improve the phenotype. Importantly, a specific expression of the maternal NECDIN allele is also detected in hypothalamic brain sections of PWS patients. These results reveal an unexpected epigenetic flexibility that allow to contemplate a therapeutic pharmacological prospect.

Prader-Willi syndrome (PWS) is a rare, neurodevelopmental disorder with multiple features caused by hypothalamic deficiency, including infantile failure to thrive, hyperphagia leading to obesity, growth hormone deficiency, hypogonadism, and central adrenal insufficiency. Other features of PWS including global developmental delay, hypotonia, pain insensitivity, gastrointestinal dysfunction, and psychiatric disorders are caused by deficits in other regions of the nervous system. PWS is caused by the loss of a subset of paternally-expressed genes on chromosome 15, which includes NDN and MAGEL2. Necdin and Magel2 are both members of the melanoma antigen (MAGE) family of proteins and are expressed throughout development, particularly in the nervous system. This thesis describes experiments that examine the loss of function of necdin and Magel2 in mice and their potential roles in the pathogenesis of PWS. Targeted inactivation of Ndn and Magel2 in mice has aided in determining how loss of function of these proteins affects the development and function of the nervous system. Loss of necdin causes reduced axonal outgrowth and neuronal differentiation in the central and peripheral sensory nervous systems. I examined the autonomic nervous system in Ndn-null embryos and identified a defect in the migration of the most rostral sympathetic chain ganglion and consequently increased neuronal cell death and reduced innervation of target tissues supplied by this ganglion. Reduced axonal outgrowth was observed throughout the sympathetic nervous system in Ndn-null embryos although no gross deficits in the parasympathetic and enteric nervous systems were identified. Loss of Magel2 causes reduced fertility and abnormal circadian rhythm patterns in mice. I further identified an altered response to stress, a delayed response to insulin-induced hypoglycemia, a reduced stimulated growth hormone response, and lower thyroid hormone levels in Magel2-null mice, indicative of deficits in multiple hypothalamic-pituitary axes. The findings presented in this thesis support a role for necdin and Magel2 in the development and function of the nervous system. The data also indicates that these MAGE proteins play a key role in multiple features of PWS, including endocrine deficiencies and autonomic dysfunction

No description available.

Cytokine and growth factor signaling pathways involving STAT3 are frequently constitutively activated in many human primary tumors, and are known for the transcriptional role they play in controlling cell growth and cell cycle progression. However, the extent of STAT3's reach on transcriptional control of the genome as a whole remains an important question. We predicted that this persistent STAT3 signaling affects a wide variety of cellular functions, many of which still remain to be characterized. We took a broad approach to identify novel STAT3 regulated genes by examining changes in the genome-wide gene expression profile by microarray, using cells expressing constitutively-activated STAT3. Using computational analysis, we were able to define the gene expression profiles of cells containing activated STAT3 and identify candidate target genes with a wide range of biological functions. Among these genes we identified Necdin, a negative growth regulator, as a novel STAT3 target gene, whose expression is down-regulated at the mRNA and protein levels when STAT3 is constitutively active. This repression is STAT3 dependent, since inhibition of STAT3 using siRNA restores Necdin expression. A STAT3 DNA-binding site was identified in the Necdin promoter and both EMSA and chromatin immunoprecipitation confirm binding of STAT3 to this region. Necdin expression has previously been shown to be down-regulated in a melanoma and a drug-resistant ovarian cancer cell line. Further analysis of Necdin expression demonstrated repression in a STAT3-dependent manner in human melanoma, prostate and breast cancer cell lines. These results suggest that STAT3 coordinates expression of genes involved in multiple metabolic and biosynthetic pathways, integrating signals that lead to global transcriptional changes and oncogenesis. STAT3 may exert its oncogenic effect by up-regulating transcription of genes involved in promoting growth and proliferation, but also by down-regulating expression of negative regulators of the same cellular processes, such as Necdin.

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine. L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés. Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse. Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires. Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques. Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif. Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante. De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53. Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence. La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer. Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence. La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative. Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement. Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain. Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer. D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel. De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie. L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique. La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin. / Viruses have been used extensively in cancer research and have contributed greatly to the advancement of knowledge as well as to the establishment of important concepts still valid in the field today. Currently, one of the challenges in cancer research is to better define the individual steps that contribute to the transition of a normal cell to a transformed cell. To address this important issue, we characterized a model system based on the expression of polyomavirus large-T antigen (PyLT), derived from a virus capable of inducing tumors in rodents. Importantly, PyLT is able to induce tumors in transgenic mice, although only after a latent period, suggesting that additional transforming events are necessary. Hence, the PyLT viral oncogene possesses several interesting properties, which suggest that, beside its role in immortalization, PyLT can contribute to the early events of carcinogenesis. Here, we used a cell culture model to dissect the early changes associated with the presence of PyLT. The establishment of a gene expression profile associated with PyLT expression in a mouse cell line model allowed us to select a number of genes whose levels were modulated by the presence of this viral oncogene. Among candidate genes, we chose to further study Necdin in more details because even if only a limited number of reports existed for this protein, there was evidence suggesting that Necdin displays either tumor suppressor or oncogenic functions within different contexts. We demonstrated that, despite the proposed growth suppressor function of Necdin, its expression was not incompatible with the proliferation in the mouse NIH 3T3 cell line and in human IMR90 primary cells. Nonetheless, the inhibition of Necdin expression by shRNA confered a proliferative advantage. We confirmed that Necdin was a p53 target gene inducible by different genotoxic stresses, although its expression was also regulated in a p53-independent manner. Moreover, Necdin acted negatively on cell cycle arrest in response to p53 activation. These results suggest that Necdin is involved in a negative feedback loop of the p53 pathway and that abnormal elevation of Necdin expression could contribute to the disruption of the p53 tumor suppressor pathway. p53 activation allows transitory cell cycle arrest under stress conditions and it is also involved in the establishment of a permanent growth arrest called senescence. Senescence represents a protective mechanism preventing the accumulation of mutations that could contribute to cancer initiation. As our research supports a role for Necdin in the regulation of p53 activity, we transposed the knowledge acquired from our mouse model to a human model more suitable to study senescence. The characterization of Necdin expression in human primary fibroblasts at different passages revealed that Necdin was expressed in actively proliferating young cells and its expression decreased gradually during the establishment of replicative senescence. The same phenomenon was observed during premature senescence induced by both oncogene expression and ionizing radiation exposure. Moreover, in normal growth conditions, Necdin modulation by gain- and loss-of-function assays did not affect the life span of primary cells. However, in a genotoxic stress conditions caused by irradiation, Necdin overexpressing cells presented an increase radioresistance comparable to when p53 was directly inactivated. These results in human cells supports the effect observed in mouse cells relative to the impact of Necdin levels on a p53 response under stress conditions. We initiated preliminary experiments to address whether our results in cell culture could be translated to human cancer models. We characterized Necdin expression in two types of human cancers. First, in ovarian cancer, we observed elevated levels of Necdin expression in low malignant potential serous ovarian cancers (LMP) when compared to aggressive serous ovarian cancers. Our results suggest that Necdin expression was limited to LMPs, which usually present a wild type p53 gene. Necdin expression was also found in two ovarian cancer cell lines, which were both non-tumorigenic in a mouse xenograft assay, and interestingly one of the cell line had a functional p53. Moreover, the characterization of Necdin expression in four prostate cancer cell lines also suggested a relationship between its expression and the presence of functional p53. In prostate cancer, as in ovarian cancer, Necdin expression seems to be detected in cell lines representing less aggressive forms of the disease. The use of the PyLT viral oncoprotein allowed us to reveal interesting properties for Necdin. We propose that, in some contexts, the constitutive expression of Necdin could contribute to cancer promotion by delaying appropriate p53 responses and possibly promoting genomic instability. The potential oncogenic function of Necdin, and its relationship with p53 as revealed by the research described in this dissertation, requires more investigation. Preliminary results suggest that human ovarian and prostate cancers could be good models to address the role of Necdin in carcinogenesis.

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine. L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés. Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse. Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires. Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques. Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif. Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante. De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53. Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence. La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer. Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence. La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative. Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement. Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain. Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer. D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel. De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie. L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique. La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin. / Viruses have been used extensively in cancer research and have contributed greatly to the advancement of knowledge as well as to the establishment of important concepts still valid in the field today. Currently, one of the challenges in cancer research is to better define the individual steps that contribute to the transition of a normal cell to a transformed cell. To address this important issue, we characterized a model system based on the expression of polyomavirus large-T antigen (PyLT), derived from a virus capable of inducing tumors in rodents. Importantly, PyLT is able to induce tumors in transgenic mice, although only after a latent period, suggesting that additional transforming events are necessary. Hence, the PyLT viral oncogene possesses several interesting properties, which suggest that, beside its role in immortalization, PyLT can contribute to the early events of carcinogenesis. Here, we used a cell culture model to dissect the early changes associated with the presence of PyLT. The establishment of a gene expression profile associated with PyLT expression in a mouse cell line model allowed us to select a number of genes whose levels were modulated by the presence of this viral oncogene. Among candidate genes, we chose to further study Necdin in more details because even if only a limited number of reports existed for this protein, there was evidence suggesting that Necdin displays either tumor suppressor or oncogenic functions within different contexts. We demonstrated that, despite the proposed growth suppressor function of Necdin, its expression was not incompatible with the proliferation in the mouse NIH 3T3 cell line and in human IMR90 primary cells. Nonetheless, the inhibition of Necdin expression by shRNA confered a proliferative advantage. We confirmed that Necdin was a p53 target gene inducible by different genotoxic stresses, although its expression was also regulated in a p53-independent manner. Moreover, Necdin acted negatively on cell cycle arrest in response to p53 activation. These results suggest that Necdin is involved in a negative feedback loop of the p53 pathway and that abnormal elevation of Necdin expression could contribute to the disruption of the p53 tumor suppressor pathway. p53 activation allows transitory cell cycle arrest under stress conditions and it is also involved in the establishment of a permanent growth arrest called senescence. Senescence represents a protective mechanism preventing the accumulation of mutations that could contribute to cancer initiation. As our research supports a role for Necdin in the regulation of p53 activity, we transposed the knowledge acquired from our mouse model to a human model more suitable to study senescence. The characterization of Necdin expression in human primary fibroblasts at different passages revealed that Necdin was expressed in actively proliferating young cells and its expression decreased gradually during the establishment of replicative senescence. The same phenomenon was observed during premature senescence induced by both oncogene expression and ionizing radiation exposure. Moreover, in normal growth conditions, Necdin modulation by gain- and loss-of-function assays did not affect the life span of primary cells. However, in a genotoxic stress conditions caused by irradiation, Necdin overexpressing cells presented an increase radioresistance comparable to when p53 was directly inactivated. These results in human cells supports the effect observed in mouse cells relative to the impact of Necdin levels on a p53 response under stress conditions. We initiated preliminary experiments to address whether our results in cell culture could be translated to human cancer models. We characterized Necdin expression in two types of human cancers. First, in ovarian cancer, we observed elevated levels of Necdin expression in low malignant potential serous ovarian cancers (LMP) when compared to aggressive serous ovarian cancers. Our results suggest that Necdin expression was limited to LMPs, which usually present a wild type p53 gene. Necdin expression was also found in two ovarian cancer cell lines, which were both non-tumorigenic in a mouse xenograft assay, and interestingly one of the cell line had a functional p53. Moreover, the characterization of Necdin expression in four prostate cancer cell lines also suggested a relationship between its expression and the presence of functional p53. In prostate cancer, as in ovarian cancer, Necdin expression seems to be detected in cell lines representing less aggressive forms of the disease. The use of the PyLT viral oncoprotein allowed us to reveal interesting properties for Necdin. We propose that, in some contexts, the constitutive expression of Necdin could contribute to cancer promotion by delaying appropriate p53 responses and possibly promoting genomic instability. The potential oncogenic function of Necdin, and its relationship with p53 as revealed by the research described in this dissertation, requires more investigation. Preliminary results suggest that human ovarian and prostate cancers could be good models to address the role of Necdin in carcinogenesis.