CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera (moringa) à uma espÃcie pertencente à famÃlia Moringaceae que se caracteriza por ser muito resistente a insetos e fungos. Trabalhos prÃvios realizados por nosso grupo de pesquisa revelaram a presenÃa de proteÃnas ligantes à quitina em sementes de moringa, dentre elas a Mo-CBP3, sugerindo uma correlaÃÃo positiva entre essa proteÃna e a resistÃncia da planta. No inÃcio do desenvolvimento da planta, para que ocorra a germinaÃÃo, deve haver a embebiÃÃo da semente, um processo seguido pela exsudaÃÃo. Na exsudaÃÃo, compostos do metabolismo primÃrio e secundÃrio sÃo externalizados da semente, alguns deles exercendo aÃÃo de defesa da nova planta ao impedirem o ataque de herbÃvoros e/ou patÃgenos. O presente trabalho teve como objetivos caracterizar o exsudato de sementes de moringa quanto à composiÃÃo bioquÃmica e atividade biolÃgica e investigar a presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato, visando contribuir para o estabelecimento de seu papel fisiolÃgico. Inicialmente, foram estabelecidas as condiÃÃes de exsudaÃÃo, dando Ãnfase ao tempo e solvente. Uma maior exsudaÃÃo de proteÃnas foi observada em sementes embebidas com Ãgua destilada por 24 horas. Esse exsudato mostrou a presenÃa de atividades inerentes a metabÃlitos primÃrios (protease, β-1,3-glucanase, quitinase, inibidor de tripsina e inibidor de papaÃna) e secundÃrios (saponinas e esteroides). Mo-CBP3 foi tambÃm detectada no exsudato, usando anticorpos policlonais anti-Mo-CBP3. A presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato de sementes de moringa foi confirmada apÃs este ter sido submetido à cromatografia em matriz de quitina, procedida pela anÃlise atravÃs de dot bloting e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os dados obtidos mostraram que o material retido na matriz de quitina corresponde a 0,26% do total de proteÃnas exsudadas, à reconhecido pelo anticorpo anti-Mo-CBP3 e apresenta perfil eletroforÃtico similar ao da Mo-CBP3 purificada de sementes de moringa. Na avaliaÃÃo da atividade deste exsudato frente à fitopatÃgenos, aÃÃo contra fungos nÃo foi detectada, nas condiÃÃes de ensaio empregadas, exceto para Candida parapsilosis que mostrou uma discreta reduÃÃo na taxa de crescimento. Contrariamente, uma potente atividade contra nematoide foi verificada, tendo sido o exsudato de sementes capaz de causar atà 100% de mortalidade para indivÃduos de Meloidogyne incognita em estÃgio de J2. Quando investigada a presenÃa de Mo-CBP3 em raiz, um ÃrgÃo vegetal que apresenta o fenÃmeno de exsudaÃÃo e, tambÃm, à capaz de interagir diretamente com o nematoide, resultados positivos foram encontrados. De fato, Mo- CBP3 està presente em raÃzes de moringa, jà nos estÃgios iniciais do desenvolvimento, conforme resultados mostrados por ELISA e atravÃs da tÃcnica de RT-PCR. Os dados, em conjunto, sugerem que no fenÃmeno da exsudaÃÃo, proteÃnas devem desempenhar funÃÃes essenciais e que, no caso da moringa, Mo- CBP3 jà participa nos estÃgios iniciais do desenvolvimento dessa planta arbÃrea, papel este que pode estar relacionado com a proteÃÃo contra patÃgenos. / Moringa oleifera (moringa) is a species belonging to the family Moringaceae which is characterized as having high resistance to insects and fungi. Previous work carried out by our research group revealed the presence of chitin-binding proteins in moringa seeds, among them Mo-CBP3, suggesting a positive correlation between this protein and the plant resistance. At the onset of the new plant development, for germination to occur, seed imbibition is required, a process followed by exudation. In exudation process, primary and secondary metabolites are released in the medium outside the seeds, some of them protecting the new plant against herbivores and/or pathogens. This study aimed to characterize the chemical composition and biological activities of moringa seed exudate and to investigate the presence of Mo-CBP3 in the exudate, in order to contribute to the establishment of its physiological role. Initially, the best conditions for exudation were established, emphasizing the time and solvent. A higher exudation of seed proteins was observed in distilled water after 24 hours. This exudate showed the presence of activities related to primary (protease, β-1,3- glucanase, chitinase, trypsin inhibitor and papain inhibitor) and secondary (steroid and saponins) metabolites. Mo-CBP3 was also detected in the exudate, using polyclonal antibodies anti-Mo-CBP3. The presence of Mo-CBP3 in the moringa seed exudate was confirmed after chromatography on chitin matrix and analyses by dot blotting and polyacrylamide gel electrophoresis. The data obtained showed that the retained material on the chitin matrix corresponds to 0.26% of the total protein, it is recognized by anti-Mo-CBP3 and has electrophoretic profile similar to that of Mo- CBP3 which was purified from moringa seeds. In the activity tests to pathogens, the seed exudate showed no antifungal activity, under the conditions used, except for Candida parapsilosis which had a slight reduction in its growth rate. In contrast, a potent activity against nematode was found as the seed exudate was able to cause a mortality rate up to 100% of Meloidogyne incognita in J2 stage. When investigated the presence of Mo-CBP3 in moringa hoots, a plant organ that shows the exudation phenomen and is also able to interact directly with the nematode, positive results were found. In fact, Mo-CBP3 is present in moringa hoots, in the initial stages of the plant development, according to the results shown by ELISA and RT-PCR. The data, taken together, suggest that in the exudation phenomen, proteins must play essential roles. In the case of moringa, Mo-CBP3 already participates in the initial stages of development of this tree species, playing a role that must be related to protection against pathogens.

To investigate nematicidal activity against the root-lesion nematode, Pratylenchus coffeae, the methanolic extracts were obtained from 5 medicinal plants in Vietnam. Methanol extracts of the 5 samples were screened for nematicidal activity against Pratylenchus coffeae in vitro. Of the plant extracts tested, a 5 mg/ml concentration of Terminalia nigrovenulosa extract showed the highest level (95.0%) of nematicidal activity against Pratylenchus coffeae at 9 h after treatment. The remainder of the plant extracts was followed by Cinnamomum camphora (66.7%), Jasminum suptriplinerve (30.8%), Premna integrifolia (6.7%), and Treptocaulon juventas (5.8%). A 2.0 mg/ml concentration of T. nigrovenulosa resulted in 13.3, 42.5, 62.5 and 86.7% at 1, 3, 5 and 7 h after treatment, respectively against Pratylenchus coffeae. Concentration of 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mg/ml of T. nigrovenulosa resulted in 26.7, 71.7, 78.3 and 86.7% effectiveness respectively, at 7 h after treatment. Also, at 3 days after exposure to T. nigrovenulosa, hatch was inhibited by 60.0, 45.8, 17.5 and 5.8% at 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mg/ml, respectively. Hatch was inhibited by 65.0, 50.8, 21.7 and 6.7% at 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mg/ml respectvely, at 6 days after exposure to T. nigrovenulosa. The mortality rate and hatch inhibition increased with increasing incubation time for crude extract of T. nigrovenulosa. / Trong nghiên cứu này, 5 cây thuốc (Cinnamomum camphora, Jasminum suptriplinerve, Premna integrifolia, Terminalia nigrovenulosa, Treptocaulon juventas) đã được sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất bằng methanol để thử hoạt tính kháng tuyến trùng Pratylenchus coffeae. Kết quả cho thấy chiết xuất từ cây Terminalia nigrovenulosa biểu hiện hoạt tính kháng tuyến trùng cao nhất (95,0%) sau 9 giờ xử lý với nồng độ 5 mg/ml. Hoạt tính kháng tuyến trùng của các chất chiết xuất được biểu hiện theo thứ tự giảm dần lần lượt là C. camphora (66,7%), J. suptriplinerve (30,8%), P. integrifolia (6,7%) và T. juventas (5,8%). Với nồng độ 2 mg/ml của chất chiết xuất từ T. nigrovenulossa biểu hiện hoạt tính gây chết tuyến trùng Pratylenchuss coffeae là 13,3; 42,5; 62,5 và 86,7% sau 1, 3, 5 và 7 giờ xử lý theo thứ tự. Ở cùng thời điểm sau xử lý 7 giờ, các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/ml chiết xuất của T. nigrovenulossa có hoạt tính gây chết tuyến trùng Pratylenchus coffeae lần lượt là 26,7; 71,7; 78,3 và 86,7%. Bên cạnh đó, chất chiết xuất của T. nigrovenulossa cũng cho thấy tỷ lệ ức chế trứng nở cao. Cụ thể là sau 3 ngày xử lý với chất chiết xuất của T. nigrovenulossa, tỷ lệ ức chế trứng không nở là 60,0; 45,8; 17,5 và 5,8% at 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/ml theo thứ tự. Sau 6 ngày xử lý với chất chiết xuất của T. nigrovenulossa, tỷ lệ ức chế trứng nở là 65,0; 50,8; 21,7 và 6,7% tại nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/ml theo thứ tự. Tỷ lệ gây chết và tỷ lệ ức chế của chất chiết xuất phụ thuộc vào cả thời gian và nồng độ xử lý.

To investigate nematicidal activity against the root-lesion nematode, Pratylenchus coffeae, the methanolic extracts were obtained from 5 medicinal plants in Vietnam. Methanol extracts of the 5 samples were screened for nematicidal activity against Pratylenchus coffeae in vitro. Of the plant extracts tested, a 5 mg/ml concentration of Terminalia nigrovenulosa extract showed the highest level (95.0%) of nematicidal activity against Pratylenchus coffeae at 9 h after treatment. The remainder of the plant extracts was followed by Cinnamomum camphora (66.7%), Jasminum suptriplinerve (30.8%), Premna integrifolia (6.7%), and Treptocaulon juventas (5.8%). A 2.0 mg/ml concentration of T. nigrovenulosa resulted in 13.3, 42.5, 62.5 and 86.7% at 1, 3, 5 and 7 h after treatment, respectively against Pratylenchus coffeae. Concentration of 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mg/ml of T. nigrovenulosa resulted in 26.7, 71.7, 78.3 and 86.7% effectiveness respectively, at 7 h after treatment. Also, at 3 days after exposure to T. nigrovenulosa, hatch was inhibited by 60.0, 45.8, 17.5 and 5.8% at 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mg/ml, respectively. Hatch was inhibited by 65.0, 50.8, 21.7 and 6.7% at 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mg/ml respectvely, at 6 days after exposure to T. nigrovenulosa. The mortality rate and hatch inhibition increased with increasing incubation time for crude extract of T. nigrovenulosa. / Trong nghiên cứu này, 5 cây thuốc (Cinnamomum camphora, Jasminum suptriplinerve, Premna integrifolia, Terminalia nigrovenulosa, Treptocaulon juventas) đã được sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất bằng methanol để thử hoạt tính kháng tuyến trùng Pratylenchus coffeae. Kết quả cho thấy chiết xuất từ cây Terminalia nigrovenulosa biểu hiện hoạt tính kháng tuyến trùng cao nhất (95,0%) sau 9 giờ xử lý với nồng độ 5 mg/ml. Hoạt tính kháng tuyến trùng của các chất chiết xuất được biểu hiện theo thứ tự giảm dần lần lượt là C. camphora (66,7%), J. suptriplinerve (30,8%), P. integrifolia (6,7%) và T. juventas (5,8%). Với nồng độ 2 mg/ml của chất chiết xuất từ T. nigrovenulossa biểu hiện hoạt tính gây chết tuyến trùng Pratylenchuss coffeae là 13,3; 42,5; 62,5 và 86,7% sau 1, 3, 5 và 7 giờ xử lý theo thứ tự. Ở cùng thời điểm sau xử lý 7 giờ, các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/ml chiết xuất của T. nigrovenulossa có hoạt tính gây chết tuyến trùng Pratylenchus coffeae lần lượt là 26,7; 71,7; 78,3 và 86,7%. Bên cạnh đó, chất chiết xuất của T. nigrovenulossa cũng cho thấy tỷ lệ ức chế trứng nở cao. Cụ thể là sau 3 ngày xử lý với chất chiết xuất của T. nigrovenulossa, tỷ lệ ức chế trứng không nở là 60,0; 45,8; 17,5 và 5,8% at 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/ml theo thứ tự. Sau 6 ngày xử lý với chất chiết xuất của T. nigrovenulossa, tỷ lệ ức chế trứng nở là 65,0; 50,8; 21,7 và 6,7% tại nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/ml theo thứ tự. Tỷ lệ gây chết và tỷ lệ ức chế của chất chiết xuất phụ thuộc vào cả thời gian và nồng độ xử lý.

Les toxines Cry sont des protéines synthétisées sous forme de cristaux par la bactérie bacille de Thuringe pendant la sporulation. Elles sont largement utilisées comme agents de lutte biologique, car elles sont toxiques envers plusieurs espèces d’invertébrées, y compris les nématodes. Les toxines Cry5B sont actives contre certaines espèces de nématodes parasites, y compris Ankylostoma ceylanicum un parasite qui infeste le système gastro-intestinal des humains. Jusqu’au présent, le mode d’action des toxines Cry nématicides reste grandement inconnu, sauf que leurs récepteurs spécifiques sont des glycolipides et qu’elles causent des dommages importants aux cellules intestinales. Dans cette étude, on démontre pour la première fois que la toxine nématicide Cry5Ba, membre de la famille des toxines à trois domaines et produite par la bactérie bacille de Thuringe, forme des pores dans les bicouches lipidiques planes en absence de récepteurs. Les pores formés par cette toxine sont de sélectivité cationique, à pH acide ou alcalin. Les conductances des pores formés sous conditions symétriques de 150 mM de KCl varient entre 17 et 330 pS, à pH 6.0 et 9.0. Les niveaux des conductances les plus fréquemment observés diffèrent les uns des autres par environ 17 à 18 pS, ce qui est compatible avec l’existence d’arrangement d’un nombre différent de pores élémentaires similaires, activés de façon synchronisée, ou avec la présence d’oligomères de tailles variables et de différents diamètres de pores. / Cry toxins are proteins synthetized as crystal inclusions by the Bacillus thuringiensis bacterium upon sporulation. They are used widely as biological control agents, as they exhibit toxicity to a range of invertebrates, including nematodes. The Cry5B toxins are active against a number of parasitic nematode species, such as Ancylostoma ceylanicum a human gastro-intestinal parasite. So far, the mode of action of nematicidal Cry toxins is largely unknown, except for the facts that their specific receptors are glycolipids and that they cause prominent damage to nematode intestinal cells. In this study, we show for the first time that the nematicidal Cry5Ba toxin, a member of the three domain family of toxins produced by the Bacillus thuringiensis forms pores in receptor-free planar lipid bilayers. The pores formed by the toxin were cation selective, both under acid and alkaline pH conditions. Under symmetrical 150 mM KCl conditions, pore activity was characterized by conductances ranging from 17 to 330 pS, at both pH 6.0 and 9.0. The most frequently observed conductance levels differed from each other by approximately 17 to 18 pS consistent with the existence of clusters of different number of elementary, similar, co-operatively gated pores, or with the presence of variable size oligomers with different pore diameters.

Les toxines Cry sont des protéines synthétisées sous forme de cristaux par la bactérie bacille de Thuringe pendant la sporulation. Elles sont largement utilisées comme agents de lutte biologique, car elles sont toxiques envers plusieurs espèces d’invertébrées, y compris les nématodes. Les toxines Cry5B sont actives contre certaines espèces de nématodes parasites, y compris Ankylostoma ceylanicum un parasite qui infeste le système gastro-intestinal des humains. Jusqu’au présent, le mode d’action des toxines Cry nématicides reste grandement inconnu, sauf que leurs récepteurs spécifiques sont des glycolipides et qu’elles causent des dommages importants aux cellules intestinales. Dans cette étude, on démontre pour la première fois que la toxine nématicide Cry5Ba, membre de la famille des toxines à trois domaines et produite par la bactérie bacille de Thuringe, forme des pores dans les bicouches lipidiques planes en absence de récepteurs. Les pores formés par cette toxine sont de sélectivité cationique, à pH acide ou alcalin. Les conductances des pores formés sous conditions symétriques de 150 mM de KCl varient entre 17 et 330 pS, à pH 6.0 et 9.0. Les niveaux des conductances les plus fréquemment observés diffèrent les uns des autres par environ 17 à 18 pS, ce qui est compatible avec l’existence d’arrangement d’un nombre différent de pores élémentaires similaires, activés de façon synchronisée, ou avec la présence d’oligomères de tailles variables et de différents diamètres de pores. / Cry toxins are proteins synthetized as crystal inclusions by the Bacillus thuringiensis bacterium upon sporulation. They are used widely as biological control agents, as they exhibit toxicity to a range of invertebrates, including nematodes. The Cry5B toxins are active against a number of parasitic nematode species, such as Ancylostoma ceylanicum a human gastro-intestinal parasite. So far, the mode of action of nematicidal Cry toxins is largely unknown, except for the facts that their specific receptors are glycolipids and that they cause prominent damage to nematode intestinal cells. In this study, we show for the first time that the nematicidal Cry5Ba toxin, a member of the three domain family of toxins produced by the Bacillus thuringiensis forms pores in receptor-free planar lipid bilayers. The pores formed by the toxin were cation selective, both under acid and alkaline pH conditions. Under symmetrical 150 mM KCl conditions, pore activity was characterized by conductances ranging from 17 to 330 pS, at both pH 6.0 and 9.0. The most frequently observed conductance levels differed from each other by approximately 17 to 18 pS consistent with the existence of clusters of different number of elementary, similar, co-operatively gated pores, or with the presence of variable size oligomers with different pore diameters.