FREITAS, Daniel Domingues. Avaliação in vitro da curcumina frente às cepas de Candida spp. e Cryptococcus neo¬formans resistentes ao fluconazol. 2015. 70 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T16:23:45Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_ddfreitas.pdf: 967080 bytes, checksum: acc93633be99ddf77a8f153781912efc (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T16:32:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_ddfreitas.pdf: 967080 bytes, checksum: acc93633be99ddf77a8f153781912efc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T16:32:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_ddfreitas.pdf: 967080 bytes, checksum: acc93633be99ddf77a8f153781912efc (MD5) Previous issue date: 2015 / Considering that some therapeutic properties of curcumin are well described, so the present study points to an antifungal effect of curcumin against strains of pathogenic yeasts resistant to fluconazole, strains of Candida spp. and Cryptococcus neoformans. All strains studied were inhibited by curcumin with different degrees of inhibition among species with MICs ranging from 8-64 mg / ml. After exposure strains of C. albicans, curcumin a decrease in the number of viable cells was observed, thus indicating damage to cell membranes, with possible compromise of their functions. Our results showed that after treatment with curcumin, found in more intense staining with PI (Propidium iodide), indicating changes in cell membranes. In this study, the mitochondrial function of C. albicans cells appears to have been affected after exposure to curcumin. The collapse in Δψm (Mitochondrial Transmembrane Potential) can lead to openings of transient pores in the mitochondrial membranes. In relation to the different mechanisms of action described for curcumin, there is evidence that DNA is one of the celular targets of this molecule. Our data suggest that after exposure to curcumin, cells of C. albicans showed total breaks in DNA strands. In conclusion, the compound curcumin has antifungal activity in vitro against strains of Candida spp. and Cryptococcus neoformans resistant to fluconazole. In addition to promoting DNA damage and externalization of phosphatidylserine, the respective compound seem to act at specific sites near mitochondria of C. albicans cells, leading to death by apoptosis. / Tendo em vista que algumas propriedades terapêuticas da curcumina já são bem descritas, dessa forma o presente estudo aponta para um efeito antifúngico da curcumina frente a cepas de leveduras patogênicas resistentes ao fluconazol, cepas de Candida spp. e Cryptococcus neoformans. Todas as cepas estudadas foram inibidas pela curcumina, com diferentes graus de inibição entre as espécies com CIMs variando entre 8-64 μg/mL. Após a exposição das cepas de C. albicans a curcumina, foi observado uma diminuição no número de células viáveis, indicando assim danos às membranas celulares, com possível comprometimento de suas funções. Os nossos resultados revelaram que após o tratamento com a curcumina, constatamos uma intensificação na marcação com PI (Iodeto de propídio), indicando alterações nas membranas celulares. No presente trabalho, a função mitocondrial das células de C. albicans parece ter sido afetada após exposição à curcumina. O colapso no Δψm (Potencial Transmembrana Mitocondrial) pode conduzir a aberturas de poros transientes nas membranas mitocondriais. Em relação aos diversos mecanismos de ação descritos para a curcumina, existem evidências de que o DNA é um dos alvos celulares desta molécula. Nossos dados sugerem que após a exposição à curcumina, as células de C. albicans, apresentaram quebras totais nas cadeias de DNA. Em conclusão, o composto curcumina apresenta atividade antifúngica in vitro contra cepas de Candida spp. e Cryptococcus neo-formans resistentes ao fluconazol. Além de promover danos ao DNA e externalização da fosfatidilserina, o respectivo composto parecem atuar em sítios específicos próximos a mitocôndria das células de C. albicans, levando à morte por apoptose.

A criptococose acomete pacientes imunocomprometidos, principalmente pacientes com a resposta imune mediada por células T debilitada, sendo portanto, suscetíveis a patógenos oportunistas. C. neoformans possui um repertório de fatores de virulência que permitem o estabelecimento da infecção e sua disseminação para o sistema nervoso central, causando meningoencefalite. O tratamento da criptococose é baseado apenas na utilização prolongada de antifúngicos e provoca muitos efeitos colaterais nos pacientes. Por estes motivos, novas terapias estão sendo abordadas, com o intuito de promover a ativação do sistema imune do hospedeiro para debelar a infecção. Para que tais terapias possam ser desenvolvidas se faz necessário identificar moléculas que estimulem a resposta imune celular. Proteínas de choque térmico de patógenos têm sido utilizadas como alvo no tratamento de muitas doenças infecciosas em seres humanos. Estas proteínas estimulam a resposta imune mediada por células T e apresentam resultados promissores em tratamentos contra infecções fúngicas. Da mesma forma, proteínas que fazem parte do sistema de defesa antioxidante, como as catalases, por exemplo, desempenham um papel importante no combate a radicais livres produzidos pelo hospedeiro e parecem ter outras funções no processo da infecção. O entendimento da biologia destas proteínas bem como a sua participação na interação com células do sistema imune do hospedeiro é fundamental para a validação da sua aplicabilidade no tratamento da criptococose. Nesse contexto, apresentamos aqui um estudo das funções biológicas de uma das proteínas de choque térmico (Hsp70) e de uma das enzimas envolvidas na detoxificação de espécies reativas de oxigênio (catalase 2) do fungo C. neoformans. Também foram avaliados os efeitos terapêuticos destas proteínas no tratamento da criptococose. Demonstramos que a proteína Hsp70 de C. neoformans está localizada na cápsula polissacarídica, sendo importante no processo de adesão da levedura a células epiteliais A549. Demonstramos também que Cn_rHsp70 co-localiza com o principal componente da cápsula polissacarídica a glucuronoxilomanana (GXM) na superfície de macrófagos. A Cn_rHsp70 quando em contato com células do fungo, diminui sua viabilidade celular e não altera o tamanho da cápsula, mas interfere na secreção de GXM. Em relação à catalase 2, foi demonstrado que a proteína é localizada na parede celular do fungo e possui atividade de degradação de peróxido de hidrogênio quando associada à superfície celular. Em ensaios de infecção experimental em animais imunizados com construções de DNA contendo as sequências de Hsp70 e catalase 2, nenhuma das proteínas conferiu proteção, mas ocorreu estímulo da resposta mediada por células Th1 e Th2. O mecanismo pelo qual estas proteínas estimulam o sistema imune ainda precisa ser elucidado. / Cryptococcus neoformans affects immunocompromised patients, especially patients with impaired T cell-mediated immune response, and therefore are susceptible to opportunistic pathogens. C. neoformans has a repertoire of virulence factors that allows the establishment and dissemination of the infection in the central nervous system, causing meningoencephalitis. The virulence factors of Cryptococcus has been subject of many studies that have showed the involvement of gene products in the infection process. However, the treatment of cryptococcal meningoencephalitis consists of antifungal therapy and displays many side effects. For these reasons, new therapies are being addressed, in order to promote the activation of the host immune system to overcome the infection. To develop these therapies, it is necessary to identify molecules that stimulate cell-mediated immune response. Heat shock proteins from many pathogens have been used as a target for the treatment of many humans infectious diseases. These proteins stimulate the T cell-mediated immune response and show promising results in treatment against fungal infections. Similarly, proteins from antioxidant system such as catalase for example, play an important role against free radicals produced by the host and appear to have other functions in the infection process. The understanding of these proteins biology and their involvement with host immune system cells is essential for the validation of its applicability in the treatment of cryptococcosis. In this context, we present here a study of the biological function of a heat shock protein (Hsp70) and one of the enzymes involved in detoxification of reactive oxygen species (catalase 2) of the fungus C. neoformans. We evaluated the therapeutic effects of these proteins in the treatment of cryptococcosis. We have demonstrated that the protein Hsp70 from C. neoformans is located in the polysaccharide capsule, and it is important in the adhesion process of the yeast to epithelial cells A549. Also demonstrated that Cn_rHsp70 co-localizes with the main component of the polysaccharide capsule, glucuronoxilomanana (GXM), on the surface of macrophages. When Cn_rHsp70 are in contact with fungal cells, the cellular viability decreased and does not change the capsule size however, interferes with the GXM secretion. Catalase 2 is deposited on the fungal cell wall and showed activity by hydrogen peroxide degradation. In vivo experiments using animals infected and treated with Hsp70 DNA vaccines and catalase 2, no protection were observed, but there are immune response mediated by Th1 and Th2 cells. The mechanism by which these proteins stimulate the immune system has yet to be elucidated.

Cryptococcus neoformans é um patógeno humano oportunista e uma das principais causas de infecções fúngicas relacionadas à óbitos, especialmente em pacientes imunocomprometidos. O processo de infecção inicia-se com a colonização do tecido pulmonar, e posteriormente a levedura se dissemina pela via hematogênica até alcançar o sistema nervoso central (SNC), provocando meningite. A fim de transmigrar e alcançar o SNC, as células fúngicas devem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). O estabelecimento adequado da doença é dependente de diferentes fatores de virulência como a cápsula polissacarídica, a capacidade de se desenvolver a 37 ºC, e outros fatores diretamente relacionados à transmigração como urease, fosfolipase B1 e ácido hialurônico sintase que são descritas como componentes essenciais para a habilidade de atravessar a BHE. O cálcio (Ca2+) é um segundo mensageiro celular que atua na via de sinalização da calcineurina. Essa via em C. neoformans é necessária e responsável pela virulência e adaptação no hospedeiro. Além disso, a regulação dos níveis intracelulares de Ca2+ é mediada pela ação de transportadores de cálcio como Pmc1 e Vcx1, os quais são foco de nossos estudos. Apesar de grandes avanços no entendimento dos mecanismos moleculares de infecção de C. neoformans, as opções terapêuticas ainda são escassas, por isso a elucidação de fatores que regulam a transmigração e a descoberta de novos alvos para fármacos é importante. Nesta dissertação foi demonstrado que os mutantes nulos para o transportador de cálcio Pmc1 (pmc1) e o duplo mutante pmc1vcx1 são avirulentos em um modelo murino de infecção sistêmica e incapazes de acessar o SNC. Além disto, a deleção do gene PMC1 causa alterações no perfil de expressão gênica da levedura, principalmente nas vias envolvidas com a transmigração e homeostase de Ca2+. Genes relacionados com a atividade de urease, e envolvidos com o mecanismo paracelular de transmigração tiveram alterações no seu perfil de expressão. Considerando os dados obtidos, é comprovada a participação do transportador Pmc1 no processo de transmigração através da BHE e para o estabelecimento adequado da doença criptococose. / Cryptococcus neoformans an opportunistic human pathogen, is the main cause of fungal infections related to death, especially in immunocompromised patients. The infection starts with the colonization of the lung tissue, thereafter the yeast disseminates hematogenously to reach the central nervous system (CNS), causing meningoencephalitis. In order to transmigrate to CNS the fungal cells must cross the blood brain barrier (BBB). For infection establishment, C. neoformans relies on virulence factors, such as polysaccharide capsule, the ability to grow at 37 ºC, and some factors directly related to transmigration. Enzymes as urease, phospholipase B and hyaluronic acid synthase are known as essential components to cross the BBB. The calcium (Ca2+) is a cellular second messenger that participates on calcineurin signaling pathway. This pathway in C. neoformans is crucial and responsible for virulence and host adaptation. Moreover, the regulation of Ca2+ intracellular levels is coordinated by Ca2+ transporters such as Pmc1 and Vcx1, which are the main foccus of our studies. Despite of many advances in understanding the molecular mechanisms of C. neoformans infection the available repertoire of antifungal drugs is still poor, therefore it is necessary to comprise the factors that regulate dissemination to CNS, and also unveil new targets for antifungal therapy. In the present study it was demonstrated through a murine model of systemic infection that the null mutants pmc1 and pmc1vcx1 are avirulent and unable to access the SNC. Besides, the disruption of PMC1 gene leads to alterations on the gene expression profile, mainly in pathways involved with transmigration and calcium homeostasis. Genes related to urease activity, and connected to paracellular mechanism of transmigration had alterations on their expression profile. Taken togheter the result shows the requirement of Pmc1 transporter to transmigration events through BBB and for proper cryptococcosis establishment.

Submitted by FERNANDA PATRICIA GULLO null (nanda_gullo@hotmail.com) on 2016-03-28T14:18:25Z No. of bitstreams: 1 Tese_Fernanda P. Gullo.pdf: 7327179 bytes, checksum: 0393cbeb07198f30f49ab07572fbb16f (MD5) / Rejected by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 12 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 12 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. 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No. of bitstreams: 1 gullo_fp_dr_arafc.pdf: 7327179 bytes, checksum: 0393cbeb07198f30f49ab07572fbb16f (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) / Criptococose é uma importante micose sistêmica que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos e é classificada como a infecção fúngica com maior mortalidade entre indivíduos portadores de HIV. Cryptococcus neoformans é uma levedura capsulada e o principal agente etiológico da criptococose; encontra-se dispersa no meio ambiente na forma de basidiósporos, os quais são responsáveis pela infecção em humanos e animais. As principais manifestações clínicas estão associadas à infecção pulmonar e meningite. A terapia se dá basicamente com a administração de anfotericina B (AMB) na terapia de ataque associada ou não a 5-fluocitosina e como manutenção é indicado ao longo do tratamento o fluconazol (FCZ). Apesar de esta terapêutica ser eficiente, é constatado elevado número de casos de reincidência e desenvolvimento de resistência aos azóis, além de problemas de toxicidade. Diante desta problemática, este estudo propõe o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para o tratamento da criptococose, visando duas abordagens distintas. A primeira, aplicando novo composto antifúngico e a segunda, o estudo de microRNAs (miRNAs) envolvidos na interação da levedura e células de glioblastoma humano (U87-MG), com a finalidade de usá-los como reguladores da infecção, sendo esta uma estratégia recentemente divulgada em uma variedade de doenças. Para tanto, inicialmente moléculas análogas de resveratrol foram avaliadas quanto a atividade antifúngica e o derivado orto,orto-HDZ (HDZ) mostrou forte atividade fungicida contra isolados de C. neoformans, com valores de concentração fungicida mínima (CFM) variando entre 0,97 a 7,81 µg/mL. A associação entre HDZ e FCZ mostrou sinergia com potencialização do efeito do FCZ em até 64 vezes para um isolado clínico resistente. Baixa toxicidade foi observada em ensaios in vitro e in vivo (Galleria mellonella e camundongos), apesar de mostrar alterações em embriões de Zebrafish. Além disso, este estudo mostrou a capacidade da associação HDZ + FCZ em inibir a interação da levedura e células hospedeiras (pneumócitos, macrófagos e glioblastoma) por citometria de fluxo e imunofluorescência. Ensaios in vivo (modelo murino) da atividade antifúngica de HDZ em combinação com FCZ mostrou que após 15 dias de tratamento houve redução significativa das unidades formadoras de colônias (UFC) no fígado, baço, cérebro, pulmões e lavado broncoalveolar, assim como o aumento da sobrevida dos animais em 198 dias e redução da morbidade, a qual foi avaliada por ensaio de comportamento (SHIRPA). Diante da segunda proposta deste trabalho, foram encontrados 10 miRNAs super-expressos na interação de C. neoformans e células U87-MG e foi observado que os miRNAs regulam principalmente vias de sinalização TGF-β, MAP quinase (MAPK) e interação receptor e matriz extracelular (MEC). Tais dados foram cruzados com transcritos que mostraram diferencialmente expressos na interação fungo-célula e as proteínas GTPase-3 e COP-1 foram selecionadas como importantes nesse processo. Tais proteínas estão associadas à via Rho-GTPase a qual é primordial para a ligação da levedura em células hospedeiras e mostrou aumento da expressão na infecção, assim como ligeira redução após o tratamento com HDZ. A indução da apoptose de células de glioblastoma por C. neoformans, foi observada através da técnica TUNEL e da expressão da proteína pró-apoptótica Bak e o tratamento com HDZ foi capaz de reverter esse processo. Nossos resultados indicam HDZ como uma interessante molécula para avançar nos estudos de desenvolvimento de um protótipo antifúngico contra C. neoformans e a inibição da expressão dos miRNAs durante a interação fungo-célula, pode ser interessante para controle da infecção fúngica, pois acreditamos que uma vez inibidos, podem reduzir a invasão da levedura em células hospedeiras, sendo então os miRNAs interessantes novos alvos terapêuticos e que o tratamento com HDZ são promissores para o desenvolvimento de um novo antifúngico. / Cryptococcosis is an important systemic mycosis that mainly affects immunocompromised patients and is classified as the fungal infection with higher mortality among individuals with HIV. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast and the main etiologic agent of cryptococcosis. This yeast is dispersed into the environment in the form of basidiospores, which are responsible for infection in humans and animals. The main clinical manifestations are associated with pulmonary infection and meningitis. The treatment is basically the administration of amphotericin B (AMB) as therapy consolidation with or without the use of 5-flucytosine and, for the maintenance therapy, fluconazole (FCZ) is indicated. Although this therapy is effective, it is observed high number of cases of relapses, development of resistance to azoles and toxicity problems. In front of these problems, this study proposes the development of new therapies for the treatment of cryptococcosis, targeting two distinct approaches. The first aims a new antifungal compound and the second the study microRNAs (miRNAs) involved in the interaction between yeast and human glioblastoma cells (U87-MG), in order to use them as regulators of infection, since this is a recently disclosed strategy in a variety of diseases. For this purpose, initially, analogs of resveratrol molecule were evaluated for antifungal activity and the derived ortho,ortho-HDZ (HDZ) showed a strong fungicidal activity against isolates of C. neoformans with values of minimum fungicidal concentration (MFC) ranging between 0.97 to 7.81 µg/mL. The association between HDZ and FCZ showed synergy with potentiation of the effect of FCZ in up to 64 times for a resistant clinical isolate to FCZ. Low toxicity was observed in in vitro and in vivo assays (Galleria mellonella and mice), despite showing changes in Zebrafish embryos. In vivo assay (murine model) of the antifungal activity of HDZ in combination with FCZ showed that after 15 days of treatment, a significant reduction in colony forming units (CFU) in the liver, spleen, brain, lungs and bronchoalveolar lavage was observed, as well as, increased survival of the animals in 198 days with the reduction of the morbidity, which was evaluated by behavioral assay (SHIRPA). Considering the second purpose of this study, 10 miRNAs were over-expressed during the interaction of C. neoformans and U87-MG cells and it was noted that these miRNAs regulate the signaling pathway of TGF-β, MAP kinase (MAPK) and the receptor and matrix extracellular components (MEC) interaction. These data was cross with transcripts that showed differentially expressed in fungus-cell interaction and the GTPase-3 and COP-1 protein were selected as important in this process. Such proteins are associated to Rho-GT pathway Rho-GTPase which is essential for the yeast adhesion into host cells and showed increased expression in infection, as well as a slight reduction after treatment with HDZ. Induction of apoptosis in glioblastoma cells by C. neoformans was observed by TUNEL technique and the expression of pro-apoptotic protein Bak and treatment with HDZ was able to reverse this process. Our results indicate HDZ as an interesting molecule to advance the development of studies of a prototype antifungal against C. neoformans and that the inhibition of expression of miRNAs during fungus-cell interaction, may be interesting to control fungal infection, because we believe that once inhibited, the yeast can reduce invasion of host cells, being the miRNAs interesting new therapeutic targets and the treatment with HDZ is promising for the development of a new antifungal drug. / CNPq: 403586/2012-7 / FCT: 345/13

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-20T15:07:31Z No. of bitstreams: 1 2015_PedroHenriqueMirandaBurgel.pdf: 2254644 bytes, checksum: d9741ccd569672b51edd5debc891636f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-21T12:58:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_PedroHenriqueMirandaBurgel.pdf: 2254644 bytes, checksum: d9741ccd569672b51edd5debc891636f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-21T12:58:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_PedroHenriqueMirandaBurgel.pdf: 2254644 bytes, checksum: d9741ccd569672b51edd5debc891636f (MD5) / O Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico humano que afeta majoritariamente indivíduos imunossuprimidos. Ele é o agente causador da meningite criptocócica e tem como principal fator de virulência uma cápsula polissacarídica que recobre sua parede celular. Os componentes desta cápsula estão envolvidos em diversos mecanismos de escape e de supressão da resposta imune desenvolvidos pelo fungo, o que leva a uma resposta não adequada da imunidade inata frente à infecção com consequente disseminação do patógeno. Dentre estes componentes, a glucoronoxilomanana (GXM) se destaca devido à grande variedade de modulações que a mesma é capaz de exercer em diversos tipos celulares. Neste trabalho, demonstramos uma nova interação entre estes componentes capsulares secretados e macrófagos: a inibição da secreção de IL-1β e da piroptose em macrófagos previamente ativados. Primeiramente verificamos que estes componentes possuíam a capacidade de inibir a produção de IL-1β, sem interferir na ativação fornecida pelo primeiro sinal – necessária para a produção da dada citocina. Caracterizamos parcialmente a molécula responsável por esta inibição, chegando a uma molécula pequena (menor que 1kDa), resistente ao calor (121 °C) e polar. Também verificamos que a piroptose dos macrófagos estimulados era prevenida por estes componentes capsulares, confirmando a interferência na via do inflamassoma destas células. Posteriormente realizamos ensaios para definir o mecanismo de ação pelo qual esta interferência estava ocorrendo. Verificamos que existiam depósitos da citocina intracelular pró-IL-1β e também que a enzima caspase-1 estava ativada nos macrófagos em contato com os componentes capsulares do C. neoformans. Por último, realizamos ensaios de interação entre os macrófagos e leveduras de C. neoformans, observando uma replicação intracelular exacerbada do fungo nas células tratadas com os componentes capsulares. Estes resultados demonstram a presença de uma molécula com caráter anti-inflamatório, acrescentando mais um mecanismo de modulação ao já extenso arsenal de fatores de virulência expressos pelo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans is a human pathogenic fungus that affects mainly immunocompromised individuals. It is the causative agent of the cryptococcal meningitis and it´s major virulence factor is a polysaccharide capsule that covers it´s cell wall. The components of this capsule are involved in various mechanisms of evasion and suppression of the immune response developed by the fungus, which leads to an inadequate answer of the innate immunity to the infection and consequent dissemination of the pathogen. Among these components, the glucuronoxylomannan (GXM) stands out due to the great variety of modulations that it is able to perform in several cell types. In this study, we demonstrated a novel interaction between these capsular components secreted by the fungus and macrophages: the inhibition of IL-1β secretion and pyroptosis in previously stimulated macrophages. First, we verified that these components had the ability to inhibit the production of IL-1β without interfering in the activation led by the first signal – necessary for the production of this given cytokine. Then we partially characterized the molecule responsible for this inhibition, discovering that it was a small molecule (smaller then 1kDa), heat resistant (121 °C) and polar. We also found that the pyroptosis was being prevented in the stimulated macrophages, confirming the interference in the inflammasome pathway of these cells. Later we performed tests to define the mechanism of action by which these interferences were occurring. We found deposits of the intracellular cytokine pro-IL-1β and also activated caspase-1 enzyme in macrophages that were in contact with C. neoformans capsular components. Ultimately, we performed interaction tests between macrophages and yeast cells of C. neoformans, observing an exacerbated intracellular growth of the fungus inside the cells treated with the capsular components. These results demonstrated the presence of a molecule with anti-inflammatory character, adding another modulatory mechanism into the already extensive arsenal of virulence factors expressed by the C. neoformans.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Apêndices. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-20T15:30:33Z No. of bitstreams: 1 2016_HugoCostaPaes_Parcial.pdf: 3794325 bytes, checksum: 3d01a16ba44758f90caa9750abbd4e47 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-14T21:27:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_HugoCostaPaes_Parcial.pdf: 3794325 bytes, checksum: 3d01a16ba44758f90caa9750abbd4e47 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T21:27:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_HugoCostaPaes_Parcial.pdf: 3794325 bytes, checksum: 3d01a16ba44758f90caa9750abbd4e47 (MD5) / Fatores de transcrição da família Gti1/Pac2 ocorrem exclusivamente em fungos e foram cooptados pela evolução para desempenhar papéis reguladores distintos de acordo com a espécie, papéis esses que vão do controle da transição micélio-levedura e virulência em fungos termodimórficos, à regulação do acasalamento em Candida e do metabolismo secundário em patógenos de plantas. Como essas são funções-chaves para patogênese, levantamos a hipótese de que o homólogo em Cryptococcusneoformans poderia também controlar a virulência, no caso em questão de um importante patógeno fúngico de humanos, que causa uma doença que vitima centenas de milhares de pessoas todo ano. O mutante para o gene que caracterizamos retém a capacidade de secretar diversas substâncias associadas à virulência – melanina, urease e fosfolipase – mas é hipocapsular e tem um defeito de citocinese e de crescimento a 37 °C. É avirulento em camundongos e hipovirulento em Galleria a 30 °C, o que indica que a temperatura do hospedeiro não é a única razão para o fenótipo observado. Além disso, a análise de RNA-Seq mostra que na ausência da proteína correspondente, a expressão da maioria das ORFscodantes do locus MAT é parcial ou completamente reprimida a 37 °C num meio de cultura de células. Entretanto, o mutante não apresenta um defeito na iniciação do acasalamento. Estes resultados dão suporte à idéia de que acasalamento e a resposta a estresses ambientais são mecanismos que evoluíram paralelamente, e é o primeiro relato de um fator de transcrição que controla o locus MAT de um patógeno fúngico num contexto independente do acasalamento. A proteína foi, portanto, nomeada MAT locuscontroller 1 (“controladora do locus MAT 1”, Mlc1). / Gti1/Pac2 transcription factors occur exclusively in fungi and have been co-opted during evolution to perform distinct regulatory roles according to species, ranging from yeast-to-mycelium transition and virulence in dimorphic fungi, to mating in Candida and secondary metabolism in plant pathogens. As these roles are important in causing disease, we hypothesized that the Cryptococcus neoformans homologue could also control virulence in this important fungal pathogen, which causes a disease that kills hundreds of thousands of people each year. The mutant for this gene retains the ability to secrete several substances associated with virulence – melanin, urease and phospholipase – but is hypocapsular and has a cytokinesis and a growth defect at 37 °C. It is avirulent in mice and hypovirulent in Galleria at 30 °C, which indicates that host temperature is not the only reason. Furthermore, RNA-Seq analysis shows that in the absence of the protein, the expression of most protein-coding ORFs of the MAT locus is partial or completely repressed at 37 °C in a cell culture medium. However, the mutant does not have a defect in mating initiation. These results support the idea that mating and the response to environmental stress are co-evolved mechanisms, and is the first report of a transcription factor that controls the MAT locus of a fungal pathogen in a mating-unrelated context. The protein has thus been named MAT locus controller 1 (Mlc1).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-03Bitstream added on 2014-06-13T19:35:16Z : No. of bitstreams: 1 benaducci_t_me_arafcf.pdf: 492292 bytes, checksum: 320fc25ea91902b305de821a5ecc8dfc (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cryptococcus neoformans é o patógeno fúngico mais comumente encontrado em infecções do sistema nervoso central, que desperta interesse devido a sua associação com os pacientes imunocomprometidos, em especial aqueles com AIDS. Embora haja ainda pouco relatados, isolados resistentes têm emergido nos últimos anos, e a disponibilidade de um método de sensibilidade rápido e reprodutível pode contribuir para a escolha do tratamento adequado. Os antifúngicos sintéticos possuem elevada toxicidade e sua disponibilidade na prática médica é relativamente pequena, algumas vezes ineficiente, o que reforça a demanda por novas alternativas terapêuticas. A busca por novos agentes antifúngicos a partir de plantas pode viabilizar o tratamento das principais micoses, diminuindo as reações adversas. Neste âmbito, pretendeuse padronizar a citometria de fluxo para a determinação da sensibilidade de anfotericina B e de substâncias de fontes naturais, comparando-as com o micrométodo. A citometria de fluxo foi utilizada no presente estudo para testar a sensibilidade de C. neoformans baseada na ligação de iodeto de propídeo na célula fúngica. Para tanto, isolados clínicos foram selecionados para análise da sensibilidade em citometria de fluxo depois de realizada a tipagem molecular de 151 isolados de Cryptococcus spp. das regiões de São José do Rio Preto e Rio de Janeiro por RFLP do gene URA5, em que a prevalência segue igual ao quadro mundial, em que o tipo molecular VNI é o mais prevalente, bem como verificou-se que a infecção por uma nova cepa e/ou diferentes espécies pode ocorrer com relativa freqüência. Foram ainda testados 57 extratos brutos, 52 frações e 53 substâncias puras isoladas de plantas do Cerrado e Mata Atlântica contra a cepa ATCC 90012 de C. neoformans... / Cryptococcus neoformans is a fungal pathogen most commonly found in infections of the central nervous system that arouses interest because of its association with immunocompromised patients, especially those with AIDS. Although have not been much reported, resistant isolates have emerged in recent years, and the availability of a method for rapid and reproducible susceptibility may contribute to the choice of treatment. The synthetic antifungal agents have high toxicity and its availability in medical practice is relatively small, sometimes inefficient, which reinforces the demand for new therapies. The search for new antifungal agents from natural products may facilitate the treatment of major fungal infections, reducing adverse reactions. In this context, we intended to standardize the flow cytometry to determine the susceptibility of amphotericin B and natural sources substances against C. neoformans, based on binding of propidium iodide (PI) in the fungal cell. For this, clinical isolates were selected for susceptibility analysis in flow cytometry after molecular typing of 151 Cryptococcus spp isolates from São José do Rio Preto and Rio de Janeiro by RFLP of the URA5 gene. The molecular type VNI is the most prevalent, as well as verified that infection by a new strain and / or different species can occur with relative frequency. We also tested 57 crude extracts, 52 fractions and 53 pure compounds isolated from plants of the Cerrado and the Atlantic forest against the C. neoformans ATCC 90012 strain. The pure substances sorbifolin, nitensoside B and isoquercitrin, from the plant Pterogyne nitens, presented MIC of 7.8μg/ml against C. neoformans, These data were confirmed by flow cytometry, after standardizing the method for amphotericin B, whose endpoint was 50% of the PI intensity, corresponding to the... (Complete abstract click electronic access below)

Cryptococcus neoformans é um patógeno humano oportunista e uma das principais causas de infecções fúngicas relacionadas à óbitos, especialmente em pacientes imunocomprometidos. O processo de infecção inicia-se com a colonização do tecido pulmonar, e posteriormente a levedura se dissemina pela via hematogênica até alcançar o sistema nervoso central (SNC), provocando meningite. A fim de transmigrar e alcançar o SNC, as células fúngicas devem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). O estabelecimento adequado da doença é dependente de diferentes fatores de virulência como a cápsula polissacarídica, a capacidade de se desenvolver a 37 ºC, e outros fatores diretamente relacionados à transmigração como urease, fosfolipase B1 e ácido hialurônico sintase que são descritas como componentes essenciais para a habilidade de atravessar a BHE. O cálcio (Ca2+) é um segundo mensageiro celular que atua na via de sinalização da calcineurina. Essa via em C. neoformans é necessária e responsável pela virulência e adaptação no hospedeiro. Além disso, a regulação dos níveis intracelulares de Ca2+ é mediada pela ação de transportadores de cálcio como Pmc1 e Vcx1, os quais são foco de nossos estudos. Apesar de grandes avanços no entendimento dos mecanismos moleculares de infecção de C. neoformans, as opções terapêuticas ainda são escassas, por isso a elucidação de fatores que regulam a transmigração e a descoberta de novos alvos para fármacos é importante. Nesta dissertação foi demonstrado que os mutantes nulos para o transportador de cálcio Pmc1 (pmc1) e o duplo mutante pmc1vcx1 são avirulentos em um modelo murino de infecção sistêmica e incapazes de acessar o SNC. Além disto, a deleção do gene PMC1 causa alterações no perfil de expressão gênica da levedura, principalmente nas vias envolvidas com a transmigração e homeostase de Ca2+. Genes relacionados com a atividade de urease, e envolvidos com o mecanismo paracelular de transmigração tiveram alterações no seu perfil de expressão. Considerando os dados obtidos, é comprovada a participação do transportador Pmc1 no processo de transmigração através da BHE e para o estabelecimento adequado da doença criptococose. / Cryptococcus neoformans an opportunistic human pathogen, is the main cause of fungal infections related to death, especially in immunocompromised patients. The infection starts with the colonization of the lung tissue, thereafter the yeast disseminates hematogenously to reach the central nervous system (CNS), causing meningoencephalitis. In order to transmigrate to CNS the fungal cells must cross the blood brain barrier (BBB). For infection establishment, C. neoformans relies on virulence factors, such as polysaccharide capsule, the ability to grow at 37 ºC, and some factors directly related to transmigration. Enzymes as urease, phospholipase B and hyaluronic acid synthase are known as essential components to cross the BBB. The calcium (Ca2+) is a cellular second messenger that participates on calcineurin signaling pathway. This pathway in C. neoformans is crucial and responsible for virulence and host adaptation. Moreover, the regulation of Ca2+ intracellular levels is coordinated by Ca2+ transporters such as Pmc1 and Vcx1, which are the main foccus of our studies. Despite of many advances in understanding the molecular mechanisms of C. neoformans infection the available repertoire of antifungal drugs is still poor, therefore it is necessary to comprise the factors that regulate dissemination to CNS, and also unveil new targets for antifungal therapy. In the present study it was demonstrated through a murine model of systemic infection that the null mutants pmc1 and pmc1vcx1 are avirulent and unable to access the SNC. Besides, the disruption of PMC1 gene leads to alterations on the gene expression profile, mainly in pathways involved with transmigration and calcium homeostasis. Genes related to urease activity, and connected to paracellular mechanism of transmigration had alterations on their expression profile. Taken togheter the result shows the requirement of Pmc1 transporter to transmigration events through BBB and for proper cryptococcosis establishment.

A expressão de determinantes de virulência por um patógeno é amplamente controlada pelo ambiente encontrado no hospedeiro. Neste contexto, a descrição de genes essenciais para o processo de interação patógeno-hospedeiro é fundamental para o melhor entendimento dos mecanismos de virulência utilizados durante a infecção. Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada que causa meningite em pacientes imunocomprometidos. A pandemia de AIDS contribuiu significativamente para o aumento das pesquisas científicas relacionadas à biologia de C. neoformans. Estudos funcionais de três genes deste patógeno, VCX1, GAT1, e GRASP, envolvidos, respectivamente, no transporte de cálcio (Ca2+), no metabolismo de nitrogênio e no processo de secreção não convencional são apresentados e discutidos na presente Tese. A habilidade de desevolvimento a 37°C é um fator de virulência essencial de C. neoformans, o qual é controlado por uma via de sinalização regulada por Ca2+ e calcineurina. O gene VCX1 de C. neoformans codifica um transportador de cálcio vacuolar, requerido para o desenvolvimento intracelular em macrófagos e para a virulência em camundongos. O fator de transcrição Gat1 de C. neoformans regula a expressão de genes sensíveis ao processo de repressão catabólica por nitrogênio (NCR). Genes envolvidos na biossíntese de ergosterol, metabolismo de ferro, integridade da parede celular e síntese da cápsula também são regulados por Gat1. Entretanto, este fator de transcrição não é necessário para a sobrevivência durante a interação com macrófagos e para a virulência em modelo de infecção experimental. Uma estratégia de virulência essencial de C. neoformans é a secreção de glicuronoxilomanana (GXM), um polissacarídeo capsular com propriedades imuno-modulatórias. Nossos resultados demonstram que GRASP (golgi reassembly and stacking protein) está envolvida na secreção de GXM, formação da cápsula e virulência em C. neoformans. É importante ressaltar que o transportador de cálcio Vcx1 e o fator de transcrição Gat1 também participam do processo de secreção deste polissacarídeo, o que representa a sua complexidade em C. neoformans. / The expression of pathogen virulence determinants is highly controlled by the host milieu. In this context, the description of crucial genes for hostpathogen interaction is fundamental to better understand the virulence mechanisms utilized during infection. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast, that causes a life-threatening meningoencephalitis in immunocompromised individuals. The AIDS pandemic has contributed significantly to the increase of scientific research concerning the C. neoformans biology. Functional analyses of three genes, VCX1, GAT1, and GRASP, related to calcium (Ca2+) transport, nitrogen metabolism and unconventional secretion in C. neoformans, respectively, are presented and discussed in this thesis. The ability to survive and proliferate at the human body temperature is an essential virulence attribute of this pathogen. This trait is controlled in part by the Ca2+- calcineurin pathway, which senses and utilizes cytosolic calcium for signaling. C. neoformans VCX1 gene encodes a vacuolar calcium exchanger, which is required for intracellular growth in macrophages and for full virulence in mice. The C. neoformans transcription factor Gat1 regulates the expression of Nitrogen Catabolite Repression (NCR) sensitive genes. Genes involved in ergosterol biosynthesis, iron uptake, cell wall organization and capsule biosynthesis are also Gat1-regulated in C. neoformans. However, Gat1 is not required for survival during macrophage infection and for virulence in a mice model of cryptococcosis. One essential virulence strategy of C. neoformans is the release of glucuronoxylomannan (GXM), a capsular immune-modulatory polysaccharide. Our results demonstrate that GRASP, a golgi reassembly and stacking protein, is involved in GXM secretion, capsule formation and virulence in C. neoformans. Interestingly, the vacuolar calcium exchanger Vcx1 and the transcription factor Gat1 are also involved in GXM secretion, which represents the complexity of this important process in C. neoformans.

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