As interações epitélio-mesênquima podem influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e no linfonodo comprometido de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a taxa de proliferação e perfil gênico de fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos obtidos de pacientes com câncer de mama e determinar a influência de células epiteliais mamárias normais (MCF10A) ou malignas (MDA-MB-231) na expressão gênica destes fibroblastos. Foram estabelecidas culturas primárias de fibroblastos de linfonodos (3 comprometidos e 3 não comprometidos) de 6 diferentes pacientes com câncer de mama e não houve diferença na taxa de proliferação destes fibroblastos. Co-culturas de células MCF10A ou MDA-MB-231 com fibroblastos, separadas fisicamente por membranas porosas, foram realizadas por 72 horas. O RNA total dos fibroblastos foi extraído, amplificado e o perfil gênico foi analisado usando-se uma lâmina de cDNA microarray. Fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos apresentaram perfil gênico similar, pois apenas 13 genes foram modulados, sendo que maior expressão de PGBD3 e PTBP2 em fibroblastos de linfonodos comprometidos foi confirmada em ensaios de RT-PCR em tempo real. Em fibroblastos, a cocultura com células MCF10A alterou a expressão de maior número de genes que a co-cultura com células MDA-MB-231. Em fibroblastos originários de linfonodos não comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 foram modulados 151 genes, em relação aos mesmos fibroblastos cultivados na ausência de células epiteliais, sendo que oito deles apresentaram variação de expressão superior a três vezes (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). As células MDA-MB-231 modularam algumas vias de sinalização em fibroblastos não comprometidos, como vias do cálcio, insulina, hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e da regulação do citoesqueleto de actina, mas o mesmo não ocorreu em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Duzentos e quarenta e nove genes foram diferencialmente expressos em fibroblastos originários de linfonodos comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 e quatro genes apresentaram variação superior a três vezes (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). Nestes fibroblastos, algumas funções biológicas foram reguladas apenas por influência da célula MDA-MB-231, entre as quais metabolismo de aminoácidos, excreção, transporte intra Golgi e regulação da forma celular. As vias de sinalização e funções biológicas reguladas em fibroblastos pela interação com células epiteliais malignas podem estar implicadas no desenvolvimento de metástases regionais no câncer de mama. / Tumor development may be influenced by epithelial-mesenchimal interactions in the primary site as well as in the involved lymph node from breast cancer patients. Our aim was to evaluate the proliferation rate and gene profile of fibroblasts obtained from involved and uninvolved lymph nodes from breast câncer patients and to determine the influence of normal (MCF10A) or malignant (MDA-MB-231) mammary epithelial cells on the gene expression of these fibroblasts. Primary culture from fibroblasts obtained from 3 involved and 3 uninvolved lymph nodes (ILF and NILF) from 6 different breast cancer patients was established and no difference in their proliferation rate was detected. These fibroblasts were co-cultured with MCF10A or MDA-MB-231 cells, physically separated by a porous membrane for 72 hours. Total RNA was extracted from the cells, amplified and the gene profile from fibroblasts cultured alone or with epithelial cells was analyzed by cDNA microarray slides. Fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes present a similar gene profile as only 13 genes were differentially expressed between them, including PGBD3 and PTBP2, which higher expression in fibroblasts from involved lymph nodes was confirmed by real time RT-PCR. In fibroblasts, more genes seem to be regulated upon co-cultured with MCF10A than with MDA-MB-231 cells. In fibroblasts from uninvolved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, 151 genes were modulated as compared with fibroblasts cultured alone, and eight of them, presented an expression variation superior to three times (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). In these fibroblasts, MDA-MB-231 could modulate some signaling pathways as calcium, insulin, gonadotrophin releasing hormone (GnRH) and actin cytoskeleton regulation signaling pathways. Two hundred forty nine genes were differentially expressed by fibroblasts from involved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, four of which with an expression variation superior to three times (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). In the last condition, fibroblasts had some biological functions regulated upon MDA-MB-231 cells influence, among which amino acid metabolism, excretion, intra-Golgi transport and regulation of cell shape. Signaling pathways and biological functions regulated in fibroblasts after interaction with malignant epithelial cells might be implicated in the development of regional metastasis in breast cancer.

O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente detectado em mulheres de todo o mundo. Na maioria das pacientes, a causa de morte se deve, principalmente, à doença metastática que pode se desenvolver a partir do tumor primário. O processo metastático envolve uma complexa cascata de eventos, incluindo a quebra organizada dos componentes da matriz extracelular por metaloproteinases de matriz (MMPs). A atividade das MMPs é precisamente regulada por inibidores específicos, os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs). Dado seu papel na progressão tumoral, níveis elevados de MMPs têm sido associados com prognóstico desfavorável para pacientes com câncer. Por outro lado, sendo os TIMPs proteínas multifuncionais, níveis elevados de TlMP-1 e de TIMP-2 correlacionam com agressividade do tumor e prognóstico ruim em diferentes tipos de câncer, incluindo o câncer de mama. O gene supressor de metástase RECK codifica uma glicoproteína de membrana capaz de inibir a invasão e a metástase tumoral através da regulação negativa da atividade de MMPs envolvidas em carcinogênese: MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). A fim de analisar o papel das MMPs e de seus inibidores (TIMPs e RECK) na progressão tumoral do câncer de mama, o perfil de expressão destes genes foi detectado, através de ensaios de Real-Time PCR, em um painel de cinco linhagens celulares de carcinoma de mama humano com diferentes potenciais invasivos e metastáticos e em 72 amostras teciduais de tumores primários de mama e 30 amostras teciduais de borda normal adjacente ao tumor. O perfil de expressão protéica de RECK foi avaliado em 236 amostras de tumores primários de mama através de ensaios de Tissue Microarray. Além disso, a atividade proteolítica das MMPs foi detectada em ensaios de Zimografia. Os resultados obtidos indicam que a progressão do câncer de mama humano está relacionada com um aumento dos níveis de expressão das MMPs e de seus inibidores específicos. O aumento dos níveis de expressão dos TIMPs parece estar relacionado ao seu papel como proteína multifuncional que pode estar funcionando de maneira a promover, mais do que suprimir, a progressão tumoral. Níveis elevados da expressão protéica de RECK estão associados com pior prognóstico. No entanto, para pacientes em estádios clínicos avançados, altos níveis de expressão de RECK podem estar correlacionados com melhor prognóstico, dependendo do balanço MMP/inibidor. Os níveis de expressão das MMPs apresentaram correlação positiva em relação aos níveis de expressão de seus inibidores específicos, sugerindo a existência de fatores e vias de sinalização comuns envolvidas na regulação coordenada destes genes. Além disso, a síntese do inibidor pode estar relacionada a uma resposta celular ao aumento da expressão e atividade de proteases. O balanço transcricional enzima/inibidor favorece a enzima nas amostras tumorais e, de modo contrário, o inibidor específico nas amostras de borda normal, sugerindo o balanço como o principal fator na determinação da degradação da MEC em processos invasivos e metastáticos. Os resultados obtidos podem contribuir para um melhor entendimento da complexidade dos mecanismos envolvidos na metástase do câncer de mama. / Breast cancer is among the most common tumors affecting women. Like most solid tumors, metastatic disease rather than the primary tumor itself is responsible for death. The metastatic process involves a complex cascade of events, including the organized breakdown of the extracellular matrix by matrix metalloproteinases (MMPs). The activity of these proteases is tightly regulated by specific inhibitors, known as tissue inhibitors of MMPs (TIMPs). Consistent with their role in tumor progression, high levels of a number of MMPs have been shown to correlate with poor prognosis in human cancers. On the other hand, TIMPs are multifunctional molecules with high levels of TIMP-1 and TIMP-2 having been shown to predict adverse prognosis and correlate with tumor aggressiveness in several different human cancers, including breast cancer. The RECK metastasis suppressor gene encodes a membrane-associated MMP regulator protein that is able to suppress tumor invasion and metastasis by negatively regulating MMPs involved in carcinogenesis, namely: MMP-2, MMP-9 and MMP-14 (MT1-MMP). In order to analyse the role of these genes in breast cancer progression, the expression levels of MMPs and theirs inhibitors were detected by Real Time PCR in a panel of five human breast cancer cell lines displaying different degrees of invasiveness and metastatic potential and in 72 primary breast cancer and 30 adjacent normal tissue specimens. The RECK protein expression profile was also examined in 236 primary breast cancer tissue specimens by Tissue Microarray technology. The proteolytic activity of MMPs was examined by Zymography. The results suggest that high expression levels of MMPs and their inhibitors are correlated with breast cancer progression. High levels of TIMP transcript may be involved in tumor-promoting activity as a result of their multifunctional role. Increased levels of the RECK protein are correlated with poor prognosis for the patient. However, high levels of RECK would be expected to confer a favorable prognosis to patients with advanced disease. The expression levels of MMPs significantly correlated with the levels of TIMPs and may be explained by coordinate correlation of these molecules or, alternatively, the synthesis of an inhibitor may be a cellular reaction to the presence of the protease. The enzyme/inhibitor balance at the transcriptional level favors the enzyme in tumor tissue and the inhibitor in adjacent normal tissue. It is probably the parameter that will determine the matrix degradation at invasion and metastatic process. Our results are likely to contribute for better understanding of the complex mechanisms involved in breast cancer metastasis.