Les ephrines et leurs récepteurs Eph constituent une famille multigénique de facteurs de guidage cellulaire et axonal. Ces facteurs jouent un rôle-clé dans l’établissement de cartes neurales topographiques, notamment au niveau des connexions thalamocorticales, réseau neuronal majeur du cerveau des mammifères. Notre projet visait initialement à étudier l’implication des ephrines corticales dans la génèse des connexions thalamocorticales par une approche de gain de fonction. Pour ce faire, nous avons généré des souris transgéniques présentant une expression ectopique spécifique de l’ephrine-A5 dans le cortex en développement, en utilisant une technique de transgénèse d’addition par chromosome artificiel de bactéries (BAC). De façon surprenante, l’analyse de ces souris nous a révélé que les ephrines, à côté de leurs rôles classiques de facteurs de guidage, influençaient la taille du cortex cérébral en régulant l’apoptose des progéniteurs neuronaux. En effet, nous avons pu montrer que l’expression ectopique du ligand ephrine-A5 par les progéniteurs corticaux exprimant son récepteur EphA7 résultait en une déplétion précoce en progéniteurs corticaux par apoptose, et une diminution subséquente de la taille du cortex. Cette vague apoptotique est observée en l’absence de toute altération détectable de la prolifération, la différenciation et la migration neurale dans le cortex. Nous avons étayé notre étude in vivo par des expériences in vitro, qui ont montré que l’ephrine-A5 recombinante était capable d’induire rapidement la mort des progéniteurs neuronaux dissociés. Nous avons également montré que cette mort cellulaire impliquait l’activation de la caspase-3, confirmant ainsi l’effet direct des ephrines et de leurs récepteurs sur une ou plusieurs cascades apoptotiques. Par contre, la stimulation des neurones post-mitotiques corticaux par l’ephrine-A5 est accompagnée d’une activation de la caspase-3 sans mort cellulaire apparente. La signalisation ephrine/Eph induirait donc l’activation de la caspase-3 dans différents types cellulaires, sans que celle-ci ne soit systématiquement le reflet d’une mort cellulaire programmée. Parallèlement, afin d’évaluer l’importance physiologique de cette voie pro-apoptotique dépendante des ephrines, nous avons étudié des souris présentant une perte de fonction du récepteur EphA7. L’analyse de ces mutants nous a permis de mettre en évidence une diminution de l’apoptose des progéniteurs corticaux, une augmentation de la taille du cortex, ainsi qu’une hypercroissance exencéphalique de tout le cerveau antérieur dans les cas les plus extrêmes. Ces observations indiquent donc que les ephrines sont nécessaires au contrôle de la mort cellulaire programmée des progéniteurs du cortex cérébral. Nous avons également observé le même phénotype exencéphalique dans des mutants déficients en ephrines-A2, -A3 et -A5, dont l’analyse préliminaire suggère également des défauts de processus apoptotiques. Nos diverses expériences, combinant une approche par gain et perte de fonction, à la fois in vivo et in vitro, ont ainsi permis de proposer un nouveau rôle des ephrines en marge de leur implication dans la guidance axonale, à savoir un rôle dans le contrôle de la taille cérébrale par induction de l’apoptose des progéniteurs corticaux. La mise en évidence de cette nouvelle voie de signalisation pro-apoptotique pourrait avoir des implications importantes dans d’autres aspects de la biologie du développement et des cellules souches, ainsi que dans l’oncogénèse.

Les précurseurs neuraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPS-NPCs) peuvent représenter la source cellulaire autologue idéale pour la thérapie cellulaire visant à promouvoir la remyélinisation et la neuroprotection des maladies de la myéline. Jusqu'à présent, le potentiel thérapeutique de ces cellules a été abordé dans des conditions néonatales. Cependant, l'efficacité de la réparation et de la sécurité de ces cellules dans le système nerveux central (SNC), une condition associée à une diminution de la plasticité cellulaire et effarouchement, reste à être bien traités. D'ailleurs, il reste à démontrer si le comportement de ces cellules ressemble à celle des NPCs du SNC. D'abord, j'ai comparé des iPS-NPCs de souris avec des cellules embryonnaires du SNC, in vitro et après greffe dans des modèles de démyélinisation de la moelle épinière de souris adulte. Nos données ont révélé la capacité de survie, intégration, migration et différenciation rapide des cellules greffées en oligodendrocytes matures. Les cellules greffées ont généré de la myéline compacte autour des axones, la restauration de n¿uds de Ranvier et la vitesse de conduction aussi efficacement que les précurseurs du SNC dérivés tandis supplantant cellules endogènes. Ensuite, pour valider la fonctionnalité des précurseurs gliaux humains dérivés des iPS-NPC, je les ai transplantés dans des modèles nouveau-nés et adultes de dys/démyélinisation. Mes données ont montré la migration généralisée, l'intégration et génération de oligodendrocytes fonctionnels, la formation de la myéline compacte tout en reconstruisant n¿uds de Ranvier dans chez les nouveau-nés et les adultes greffés. / Induced pluripotent stem cell-derived neural precursor cells (iPS-NPCs) may represent the ideal autologous cell source for cell-based therapy to promote remyelination and neuroprotection in myelin diseases and can serve as suitable tools to model myelin disorders or to test the potential of pharmacological compounds. So far the therapeutic potential of these cells was approached in neonatal conditions. However, the repair efficacy and safety of these cells in the demyelinated adult central nervous system (CNS), a condition associated with decreased cell plasticity and scaring, remains to be well addressed. Moreover, whether the therapeutic behavior of these pluripotent-derived cells resembles that of physiologically committed CNS-derived precursors remains elusive. First, I used mouse iPS-NPCs and compared them side-by-side to embryonic CNS-derived cells, in vitro and in vivo after engraftment in models of adult spinal cord demyelination. My data revealed the prominent capacity of survival, safe integration, migration and timely differentiation of the grafted cells into mature oligodendrocytes. Grafted cells generated compact myelin around host axons, restoring nodes of Ranvier and conduction velocity as efficiently as CNS-derived precursors while outcompeting endogenous cells. Second, to validate the functionality of human iPS-NPC-derived glial precursors, I transplanted them in newborn and adult models of dys/demyelination. My data showed widespread migration, integration and extensive generation of functional oligodendrocytes ensheathing host axons, forming compact myelin while reconstructing nodes of Ranvier both in newborn grafted and adult demyelination contexts.

Le cytosquelette d'actine est une structure dynamique capitale pour la cellule, qui intervient dans les processus de signalisation et génère des forces mécaniques pour compléter des fonctions aussi diverses que l'adhésion, la migration, la division ou la différenciation. Les protéines qui régulent cette structure sont capables de moduler ces fonctions. J'ai identifié une nouvelle famille de protéines régulatrices de l'actine, les protéines Refilines (RefilineA et RefilineB), dont l'expression est corrélée avec l'engagement des cellules dans des programmes de différenciation. La RefilineA est induite lors de la différenciation des cellules précurseurs neurales multipotentes en cellules progénitrices gliales. La RefilineB est stabilisée dans les cellules épithéliales lors de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) induite par le TGF-β. Dans ces cellules, les Refilines agissent en se complexant à la FilamineA, une protéine qui se lie aux filaments d'actine et forme le maillage. Des syndromes génétiques de mutations sur le gène de la FilamineA entrainent d'importants défauts développementaux, cependant la fonction précise de la protéine reste à ce jour obscure. Le complexe Refiline/FilamineA induit la formation de câbles d'actine et génère également une nouvelle structure d'actine périnucléaire appelée coiffe d'actine (" actin cap ") ou " ligne TAN" qui s'ancre à l'enveloppe nucléaire pour réguler les mouvements et la morphologie du noyau. Les Refilines sont les seules protéines identifiées à ce jour capables de catalyser la formation de structures périnucléaires d'actine. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives pour appréhender les fonctions de la FilamineA ainsi que la biologie et les fonctions des structures périnucléaires d'actine.

Le système nerveux est responsable de l’interconnexion interne des animaux multicellulaires. Il leur permet en effet d’intégrer les activités physiologiques de leurs différentes composantes en une seule entité fonctionnelle, capable d’interagir avec son environnement. L’évolution et le développement des systèmes nerveux complexes comptent parmi les questions les plus fascinantes de la recherche en biologie. Afin de mettre en place une diversité de types de cellules neurales et de connexions neurales, les animaux métazoaires ne déploient qu’un nombre étonnamment réduit de signaux développementaux. C’est l’intermodulation dynamique de ces signaux qui va pouvoir induire un patron spatial d’identités et de comportements cellulaires distincts. L’acide rétinoïque (AR) est une petite molécule diffusible dérivée de la vitamine A qui contribue à la mise en place des axes du système nerveux central des vertébrés et est un régulateur crucial de la différentiation neuronale. D’autre part, il a été montré que les signaux à l’AR affectaient le phénotype de neurotransmetteurs exhibé par des sous-populations neuronales et jouent des rôles divers dans la morphogenèse du système nerveux périphérique issu des placodes crâniennes et des cellules des crêtes neurales. Néanmoins, bien que le rôle de l’AR dans la régionalisation du système nerveux central ait été étudié de manière extensive, nous en savons beaucoup moins au sujet de l’action de l’AR sur le développement du système nerveux périphérique, sur l’établissement des différentes identités de neurotransmetteurs, ou quant à comment ces fonctions ont évolué. Bien qu’initialement considéré comme spécifique aux vertébrés, un volume croissant de données indique désormais que l’AR serait impliqué dans le développement du système nerveux de divers taxons, tels que les cnidaires, les mollusques gastropodes ainsi que les cordés invertébrés. En particulier, l’amphioxus, céphalocordé dont l’évolution est lente, est connu pour posséder un système de signalisation à l’AR semblable à celui des vertébrés. Le génome de l’amphioxus présente un haut degré de conservation de sa synténie par rapport à celui des vertébrés et exhibe relativement peu de pertes ou de duplications indépendantes de ses gènes développementaux. Par conséquent, l’embryogenèse ainsi que la morphologie de l’amphioxus ressemble par bien des points à celles des vertébrés, ce qui facilite l’identification des traits ancestraux et dérivés et en fait donc un modèle approprié à la recherche comparative. Cette étude vise à fournir une description détaillée de différentes populations neurales au sein du système nerveux périphérique de l’amphioxus et d’explorer les rôles joués par l’AR dans ce processus. À cette fin, des analyses d’expression de gènes et d’immunohistochimie ont été utilisées, en vue d’identifier les différentes sous-populations de progéniteurs et les différents types de cellules neurales. De plus, les niveaux de signaux à l’AR ont été altérés pharmacologiquement à différents stades de développement de l’amphioxus, pour déterminer leurs effets sur la formation des populations neurales identifiées, ainsi que sur les patrons de prolifération et d’apoptose. Les résultats inclus dans ce travail révèlent la présence de différentes populations de cellules neurales chez l’amphioxus et mettent en lumière leur vraisemblable relation phylogénétique avec les structures leur correspondant chez les vertébrés. Par ailleurs, différents rôles contexte-dépendants de la signalisation à l’AR on été documentés, incluant la mise en place de frontières discrètes dans le système nerveux central et l’ectoderme de l’embryon d’amphioxus, et la régulation du développement des progéniteurs neuraux tardifs dans le système nerveux périphérique de manière spécifique à leur type cellulaire. / The nervous system provides internal interconnection to multi-cellular animals. It enables them to integrate the physiological activities of their different components into one functional entity that can successfully interact with its environment. The evolution and development of complex nervous systems is one of the most fascinating questions of biological research. In order to generate a diversity of neural cell types and neural connections, metazoan animals deploy a surprisingly small number of instructive developmental signals, which crosstalk in a dynamic manner to induce a spatial pattern of cell identities and behaviors.Retinoic acid (RA) is a small diffusible signaling molecule derived from vitamin A that contributes to the axial patterning of the vertebrate central nervous system and functions as a crucial regulator of neuronal differentiation. Moreover, RA signals have been shown to affect the neurotransmitter phenotype of specific neuronal subsets and play distinct roles during the morphogenesis of the peripheral nervous system from cranial placodes and neural crest. However, while the role of RA signaling in the regionalization of the central nervous system has been extensively studied, much less is known about its actions in cranial placodes and neural crest derivatives, in the establishment of different neurotransmitter identities, or how these functions might have evolved.Albeit initially believed to be vertebrate-specific, a growing body of evidence now implicates RA signaling in the nervous system development of various distant taxa, such as cnidarians, gastropod mollusks and invertebrate chordates. In particular, the slow evolving cephalochordates, commonly called amphioxus, are known to possess a vertebrate-like RA signaling system. The amphioxus genome has retained a high degree of synteny with vertebrate genomes and exhibits relatively little losses or independent duplications of developmental genes. Accordingly, amphioxus embryogenesis and morphology also display remarkable similarity with vertebrates, which allows the identification of ancestral as well as newly derived traits and makes these animals attractive models for comparative research.This study aims at providing a detailed description of the development of different neural cell populations in the central and peripheral nervous system of amphioxus and explores the roles played by RA signaling during this process. To this end, gene expression analyses and immunohistochemistry were used, in order to identify distinct subsets of neural progenitors and neural cell types. Furthermore, RA signaling levels were manipulated pharmacologically at different stages of amphioxus development, to assess their effects on the formation of identified neural cell populations as well as on proliferation and apoptosis patterns. The results presented in this work reveal the presence of distinct neural cell populations in amphioxus and highlight their likely phylogenetic relationships with corresponding structures in other chordates. In addition, several context-dependent functions of RA signaling were documented, which include the generation of discrete boundaries in the central nervous system and ectoderm of amphioxus embryos as well as the cell type-specific regulation of late neural progenitor development in the peripheral nervous system. The observed roles of RA signaling in the amphioxus neural tube and peripheral nervous system correspond well to those reported for the vertebrate hindbrain and cranial placodes, supporting the current hypothesis of a close evolutionary relationship between these structures and suggesting that the involvement of RA signals in their development is a conserved feature of chordates.

Le cytosquelette d'actine est une structure dynamique capitale pour la cellule, qui intervient dans les processus de signalisation et génère des forces mécaniques pour compléter des fonctions aussi diverses que l'adhésion, la migration, la division ou la différenciation. Les protéines qui régulent cette structure sont capables de moduler ces fonctions. J'ai identifié une nouvelle famille de protéines régulatrices de l'actine, les protéines Refilines (RefilineA et RefilineB), dont l'expression est corrélée avec l'engagement des cellules dans des programmes de différenciation. La RefilineA est induite lors de la différenciation des cellules précurseurs neurales multipotentes en cellules progénitrices gliales. La RefilineB est stabilisée dans les cellules épithéliales lors de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) induite par le TGF-β. Dans ces cellules, les Refilines agissent en se complexant à la FilamineA, une protéine qui se lie aux filaments d'actine et forme le maillage. Des syndromes génétiques de mutations sur le gène de la FilamineA entrainent d'importants défauts développementaux, cependant la fonction précise de la protéine reste à ce jour obscure. Le complexe Refiline/FilamineA induit la formation de câbles d'actine et génère également une nouvelle structure d'actine périnucléaire appelée coiffe d'actine (« actin cap ») ou « ligne TAN» qui s'ancre à l'enveloppe nucléaire pour réguler les mouvements et la morphologie du noyau. Les Refilines sont les seules protéines identifiées à ce jour capables de catalyser la formation de structures périnucléaires d'actine. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives pour appréhender les fonctions de la FilamineA ainsi que la biologie et les fonctions des structures périnucléaires d'actine. / The actin cytoskeleton is a highly dynamic structure involved in cell signaling and that creates mechanical force for the completion of diverse functions such as adhesion, migration, division or differentiation. Proteins that regulate this structure can modulate its function. We identified a new protein family that regulates the actin cytoskeleton, Refilin proteins (RefilinA and RefilinB), and whose expression correlates with differentiation switches. RefilinA is induced during differentiation of neural multipotent precursors into glial progenitors, while RefilinB is stabilized in epithelial cells during epithelial-mesenchymal transition (EMT) induced by TGF-β. In cells, Refilins interact with FilaminA, a protein that binds actin filaments to organize them into a network. Genetic syndromes where the FilaminA gene is mutated lead to important developmental defects, The Refilin/FilaminA complex generates actin cables as well as a new perinuclear structure called « actin cap » or «TAN line» that interacts with the nuclear envelope to regulate nuclear movement and shape. Refilin proteins are the only proteins identified so far that induce the formation of perinuclear actin structures. These results open up new perspective for the understanding of FilaminA's function as well as for the biology and functions of perinuclear actin structures.

Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l'utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d'une maladie monogénique, obtenues au cours d'un diagnostique pré-implantatoire. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l'utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d'obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j'ai ensuite comparé le profil d'expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J'ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d'utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J'ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l'observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J'ai également étudié l'expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d'Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l'équipe, permettent d'apporter la preuve de concept de l'intérêt d'un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.

La protéine kinase CK2 est un complexe moléculaire dynamique composé de 2 sous-unités catalytiques α et d'un dimère de sous-unités régulatrices β. La structure cristallographique du dimère de CK2β suggère qu'il représente une plate-forme moléculaire, plaçant la protéine au cœur d'un réseau de voies de signalisation.<br />L'invalidation du gène CK2β chez la souris conduit à un défaut de viabilité des cellules souches embryonnaires (ES). Nous avons pu étudier la fonction de différents domaines fonctionnels in vitro dans un modèle cellulaire reposant sur une stratégie d'invalidation conditionnelle du gène CK2β dans les cellules ES murines. L'abolition de l'expression du gène endogène est létale pour les cellules ES et leur viabilité est restaurée par l'expression exogène de la protéine CK2β sauvage. Ce modèle nous permet d'étudier l'implication de divers domaines de CK2β dans la survie, la prolifération et la différenciation des cellules souches embryonnaires, en remplaçant la protéine endogène par diverses formes mutées de la protéine. <br />Parallèlement, l'invalidation conditionnelle du gène chez la souris ciblée dans les précurseurs neuraux a montré que CK2β est un élément clef dans les voies de signalisation qui contrôlent l'oligodendrogenèse. La différenciation des cellules ES nullizygotes exprimant la protéine exogène sauvage nous a permis de montrer que celle-ci restaure la lignée oligodendrocytaire. Nous avons aussi montré que certains domaines de CK2β, impliqués dans la fonction régulatrice du dimère, sont des déterminants structuraux cruciaux pour la prolifération des cellules souches neurales et leur progression dans la lignée oligodendrocytaire.

Les ephrines et leurs récepteurs Eph constituent une famille multigénique de facteurs de guidage cellulaire et axonal. Ces facteurs jouent un rôle-clé dans l’établissement de cartes neurales topographiques, notamment au niveau des connexions thalamocorticales, réseau neuronal majeur du cerveau des mammifères.<p><p>Notre projet visait initialement à étudier l’implication des ephrines corticales dans la génèse des connexions thalamocorticales par une approche de gain de fonction. Pour ce faire, nous avons généré des souris transgéniques présentant une expression ectopique spécifique de l’ephrine-A5 dans le cortex en développement, en utilisant une technique de transgénèse d’addition par chromosome artificiel de bactéries (BAC). <p><p>De façon surprenante, l’analyse de ces souris nous a révélé que les ephrines, à côté de leurs rôles classiques de facteurs de guidage, influençaient la taille du cortex cérébral en régulant l’apoptose des progéniteurs neuronaux. En effet, nous avons pu montrer que l’expression ectopique du ligand ephrine-A5 par les progéniteurs corticaux exprimant son récepteur EphA7 résultait en une déplétion précoce en progéniteurs corticaux par apoptose, et une diminution subséquente de la taille du cortex. Cette vague apoptotique est observée en l’absence de toute altération détectable de la prolifération, la différenciation et la migration neurale dans le cortex.<p><p>Nous avons étayé notre étude in vivo par des expériences in vitro, qui ont montré que l’ephrine-A5 recombinante était capable d’induire rapidement la mort des progéniteurs neuronaux dissociés. Nous avons également montré que cette mort cellulaire impliquait l’activation de la caspase-3, confirmant ainsi l’effet direct des ephrines et de leurs récepteurs sur une ou plusieurs cascades apoptotiques. Par contre, la stimulation des neurones post-mitotiques corticaux par l’ephrine-A5 est accompagnée d’une activation de la caspase-3 sans mort cellulaire apparente. La signalisation ephrine/Eph induirait donc l’activation de la caspase-3 dans différents types cellulaires, sans que celle-ci ne soit systématiquement le reflet d’une mort cellulaire programmée. <p><p>Parallèlement, afin d’évaluer l’importance physiologique de cette voie pro-apoptotique dépendante des ephrines, nous avons étudié des souris présentant une perte de fonction du récepteur EphA7. L’analyse de ces mutants nous a permis de mettre en évidence une diminution de l’apoptose des progéniteurs corticaux, une augmentation de la taille du cortex, ainsi qu’une hypercroissance exencéphalique de tout le cerveau antérieur dans les cas les plus extrêmes. Ces observations indiquent donc que les ephrines sont nécessaires au contrôle de la mort cellulaire programmée des progéniteurs du cortex cérébral. Nous avons également observé le même phénotype exencéphalique dans des mutants déficients en ephrines-A2, -A3 et -A5, dont l’analyse préliminaire suggère également des défauts de processus apoptotiques. <p><p>Nos diverses expériences, combinant une approche par gain et perte de fonction, à la fois in vivo et in vitro, ont ainsi permis de proposer un nouveau rôle des ephrines en marge de leur implication dans la guidance axonale, à savoir un rôle dans le contrôle de la taille cérébrale par induction de l’apoptose des progéniteurs corticaux.<p>La mise en évidence de cette nouvelle voie de signalisation pro-apoptotique pourrait avoir des implications importantes dans d’autres aspects de la biologie du développement et des cellules souches, ainsi que dans l’oncogénèse. <p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished