Preterm birth is frequently associated with an increased risk of neurodevelopmental difficulties and of cognitive, behavioural and emotional problems during childhood. The present thesis comprises two MRI studies that demonstrated patterns of cerebral gray matter (GM) and white matter (WM) alterations and their cognitive correlates in children and adolescents who were born preterm.Our first study provided evidence of the persistence of diffuse WM abnormalities in adolescents who were born very preterm, and underlines their high frequency. The individual voxel-based morphometry analysis approach demonstrated that 80% of preterm subjects had WM abnormalities, the most frequently affected areas being the centrum semiovale and the posterior periventricular regions. These results suggest that WM reductions are common, even in those preterm subjects without motor impairment and who receive normal schooling. Volumetric and MRI-related cognitive outcomes suggest that cognitive processing speed is persistently impaired following early brain damage, despite the existence of developmental plasticity. Although the nature of the relationship between diffuse WM injury and cognitive/behavioural deficits is complex and not entirely understood, the results of our first study suggest that WM abnormalities are related with worse Performance IQ scores and slower processing speed. So, we can affirm that diffuse WM loss in preterm children plays an important role in long-term cognitive impairment. Our second study focussed on the investigation of preterm children with a low risk either of neurological deficit or of developmental difficulties. While the neurodevelopmental and cognitive outcome of high-risk preterm samples is well known, little research has been conducted into low-risk preterms, such as those born between 30-34 weeks of GA, with uncomplicated perinatal histories, normal cranial ultrasound scans and no obvious neurodevelopmental deficits. To our knowledge, this is the first study to investigate the brain volume characteristics of a low-risk preterm sample in childhood using an MRI approach and the first attempt to relate these measures to cognitive performance. This study demonstrated that low-risk preterm children are characterized by the presence of regional cortical GM volume reductions in the parietal and temporal lobes which correlate strongly with IQ. Moreover, preterm children also showed WM volume reductions that were concomitant with the GM loss in the parietal and temporal regions compared to full-terms.In summary, the body of results derived from this thesis provides evidence that preterm birth is associated with brain abnormalities and cognitive impairment in middle childhood and adolescence. Future studies are required to assess the impact of cognitive and behavioural function in middle childhood on later outcomes in preterm samples with low risk of neurodevelopmental deficits. / Les seqüeles cognitives i conductuals associades al naixement prematur constitueixen actualment un dels principals temes d'interès pediàtric. Les imatges per ressonància magnètica (RM) han resultat una eina interessant per a l'estudi de les lesions cerebrals associades a la prematuritat, encara que els correlats entre les troballes en RM i els indicatius del neurodesenvolupament estan poc investigats.L'interès general d'aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi de les bases neuroanatòmiques (patrons d'alteració de substància grisa i blanca cerebral) relacionades amb el rendiment cognitiu que presenten els nens i els adolescents que han nascut prematurs. Amb aquest objectiu s'han usat tècniques volumètriques de neuroimatge basades en imatges de RM, així com avaluacions cognitives i de conducta en dues mostres de nens i adolescents (edats mitges de 9 i 14 anys respectivament) amb antecedents de part prematur. L'objectiu del primer estudi va ser investigar les relacions entre el rendiment cognitiu general i la integritat (concentració) de la substància blanca en una mostra d'adolescents que van néixer molt prematurs. Segons el nostre coneixement, cap estudi previ no havia usat la tècnica de la morfometria basada en el vòxel (VBM de l'anglès voxel-based morphometry) per analitzar els possibles correlats entre la substància blanca cerebral i els processos cognitius relacionats amb el quocient d'intel·ligència (QI) manipulatiu i amb mesures de velocitat de processament en una mostra d'adolescents amb antecedents de part prematur. A més a més, aquest va ser el primer estudi en usar una anàlisi de comparacions individuals amb la VBM a fi d'avaluar i establir els diferents patrons d'afectació de la substància blanca per a cada adolescent nascut prematur.Mentre que el desenvolupament neurològic i cognitiu dels prematurs d'alt risc ha rebut molta atenció, pràcticament no hi ha estudis amb referència als prematurs amb baix risc a desenvolupar dèficits neurològics o cognitius. Els prematurs de baix risc es defineixen com aquells nascuts amb una prematuritat moderada (30-34 setmanes de gestació), sense evidències de complicacions neonatals associades, amb resultats d'ultrasons cranials normals i sense dèficits obvis del desenvolupament motor, cognitiu i social. Fins a la realització de la nostra segona investigació, cap altre estudi no havia investigat les característiques volumètriques d'una mostra de prematurs de baix risc mitjançant RM (tècnica VBM), ni havia relacionat aquestes mesures amb l'execució cognitiva.Les conclusions d'aquesta tesi derivades de l'estudi I (I-III) i de l'estudi II (IV-VI) son:I. Els adolescents amb antecedents de prematuritat, sense evidències d'alteracions en la substància blanca segons una inspecció visual neuroradiològica de les imatges de RM, presenten amb una freqüència elevada reduccions de concentració de substància blanca en comparació amb els adolescents nascuts a terme, usant la tècnica de neuroimatge voxel-based morphometry. II. Els resultats dels anàlisis de patrons d'alteració de la substància blanca cerebral en prematurs adolescents mostren que el centre semioval i les regions periventriculars posteriors son les àrees més freqüentment afectades. Aquests resultats suggereixen que aquestes alteracions en substància blanca son altament comunes en subjectes amb antecedents de part prematur, i que persisteixen fins a l'adolescència, després d'un llarg període de maduració cerebral.III. Els adolescents amb història de part prematur presenten una afectació major en el QI Manipulatiu que en el QI Verbal. Tanmateix, l'afectació difusa de la substància blanca cerebral té un efecte important en el rendiment cognitiu dels prematurs, sobretot en tasques d'organització perceptiva i de velocitat de processament.IV. Els nens prematurs amb baix risc de desenvolupar dèficits del neurodesenvolupament presenten unes reduccions volumètriques de substància grisa cerebral tant globals com regionals localitzades principalment al lòbul temporal.V. Els nens prematurs de baix risc presenten decrements de volum de la substància blanca adjacents a les regions d'afectació de la substància grisa, encara que a només a les regions temporals esquerres van assolir la significació estadística. Amb aquests resultats, queda palès que els nens prematurs de baix risc mostren una afectació principalment en la substància grisa cortical, amb reduccions associades, però no tant manifestes, de substància blanca. La integritat de les substàncies grisa i blanca cerebral en la infància estan relacionades amb variables neonatològiques tals com l'edat de gestació i el pes al néixer. VI. El rendiment cognitiu dels nens prematurs de baix risc està caracteritzat per dèficits en la comprensió verbal i en el raonament perceptiu. Tanmateix, els nens prematurs de baix risc no mostren problemes de conducta o afectius en comparació amb els nens nascuts a terme.Finalment, destacar que són necessaris estudis futurs que avaluïn els efectes de la prematuritat per se en el desenvolupament i la morfologia cerebral així com també en relació amb els subseqüents correlats cognitius.

La recanalización arterial precoz es un punto clave para alcanzar un buen pronóstico funcional tras un ictus isquémico. El síndrome metabólico (SM) podría jugar un papel en la evolución de los pacientes con ictus isquémico tratados con activador tisular del plasminógeno (tPA) por vía sistémica (a) por su asociación a un estado protrombótico que podría interferir en la recanalización arterial inducida por tPA y (b) porque varias de las alteraciones metabólicas que acompañan al SM podrían contribuir a amplificar el daño cerebral post-isquémico. La presente tesis pretende probar la hipótesis surgida de trabajos previos de nuestro grupo sobre el papel del SM como predictor de resistencia a la recanalización y mal pronóstico en el ictus isquémico por oclusión aguda de la arteria cerebral media (ACM) tratados con tPA iv utilizando el Dúplex transcraneal (DTTC) para detectar recanalización de la ACM en tiempos más precoces (con más implicación para la práctica clínica en la indicación de terapia de rescate por vía intraarterial) así como analizar el valor pronóstico de algunos de los biomarcadores más relevantes asociados a SM y resistencia a la insulina. Para ello se seleccionaron 234 pacientes consecutivos con un ictus por oclusión aguda de la ACM, detectada mediante DTCC, que recibieron tPA iv en <4.5h desde el inicio de los síntomas en la Unidad de Ictus del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. El DTCC se repitió a las 2 horas del inicio del tPA y se registraron los patrones TIBI (Thromblysis In Brain Ischemia). La resistencia a la recanalización se definió como la ausencia de recanalización completa a las 2 horas. El SM se diagnosticó según la definición unificada y consensuada que se publicó en el 2009 (Alberti KG et al. Circulation 2009). La gravedad del ictus se cuantificó justo antes de la administración del tPA y a las 24h después del tratamiento mediante la escala NIHSS (National Institute of Health Stroke Scale). Se realizó un tomografía computerizada (TC) de control a las 24-36h. Se definió mejoría neurológica dramática como la reducción de 10 o más puntos en la escala NIHSS en las primeras 24 horas (o NIHSS de 0-1 a las 24h) y mal pronóstico funcional como una puntuación en la escala de Rankin modificada >2 a los 90 días. La transformación hemorrágica sintomática (HICs) se consideró ante la presencia de cualquier tipo de hemorragia en la TC de control asociada a una reducción de 4 o más puntos en la escala NIHSS. El volumen del infarto se calculó en la TC de control midiendo el volumen de la hipodensidad (mediante la fórmula 0.5x a x b x c). Este estudio demuestra que el SM es un factor predictor independiente de resistencia a la recanalización arterial a las 2 horas desde el inicio del tratamiento trombolítico endovenoso en pacientes con ictus por oclusión de la ACM así como de peor recuperación neurológica precoz (en términos de mejoría neurológica dramática). Además, el SM se asocia a un peor pronóstico funcional a los 90 días, aunque esta asociación desaparece al ajustar por el resto de variables asociadas a mal pronóstico. El SM se asocia también a mayor volumen de infarto y una mayor tasa de HICs aunque esta asociación no es independiente del resto de covariables. Los pacientes SM tienen niveles significativamente superiores de PAI-1 activo y de PCR aunque no se ha demostrado influencia de estos biomarcadores en la resistencia a la recanalización arterial, HICs, volumen de infarto ni mejoría neurológica precoz. Sin embargo, los niveles elevados de PCR se asociaron a mal pronóstico funcional. / Early arterial recanalization is a key point to achieve good functional outcome after ischemic stroke. Metabolic syndrome (MS) might lead to a worsening of stroke outcome in patients treated with tissue plasminogen activator (tPA) for several reasons: (a) first, MS, through its association with a prothrombotic state, could interfere with tPA-induced arterial recanalization and (b) secondly, many of the metabolic abnormalities related to MS could amplify cerebral ischemic damage. This thesis aims to test the hypothesis that emerged from previous work by our group (MS as a predictor of poor outcome in ischemic stroke due to middle cerebral artery (MCA) occlusion treated with intravenous thrombolysis) using Transcraneal Duplex (TCCD) to detect MCA recanalization in earlier time points (when rescue neurointervencional procedures may be still indicated to achieve arterial recanalization) and to analyze the prognostic value al baseline of some of the most relevant biomarkers associated with MS and insulin resistance. A total of 234 consecutive ischemic stroke patients treated with IV tPA within 4.5 hours from symptoms onset at University Hospital Germans Trias i Pujol Stroke Unit and who showed an MCA occlusion on prebolus TCCD examination were prospectively included. TCCD was repeated at 2 hours after tPA. TIBI (Thrombolysis In Brain Ischemia) grades were recorded. Resistance to thrombolysis was defined as the absence of TCCD-assessed complete MCA recanalization at 2 hours after tPA infusion. MS was diagnosed following the unified criteria of the last joint interim statement (Alberti KG et al. Circulation 2009). Stroke severity was measured by the NIHSS (National Institute of Health Stroke Scale) at baseline and at 24 hours after tPA administration. A CT scan was performed on admission and 24-36 hour after tPA. Dramatic neurological improvement was defined as a decrease in ≥10 points in the NIHSS score in the first 24 hours. Poor outcome was defined as a modified Rankin score >2 at 3 months. Symptomatic intracerebral hemorrhage (SICH) was defined as any hemorrhagic transformation in follow-up CT scan with NIHSS score worsening ≥4 points. Infarct size was assessed in follow-up CT scan by measuring hypodensity volume using ABC/2 method. This study demonstrates that MS is an independent predictor of resistance to thrombolysis at 2 hours from tPA administration in MCA occlusion stroke patients and worse early neurological recovery (in terms of dramatic neurological improvement). In addition, MS is associated with poor functional outcome at three months, although this association disappeared after adjustment for other variables associated with poor outcome. MS is also associated with an increased infarct volume and a higher SICH rate although this association is not independent of other covariates. Patients with MS have significantly higher PAI-1 and CRP levels. We didn´t found an influence of these biomarkers in resistance to thrombolysis, SICH, infarct volume or early neurological improvement. However, CRP levels were higher in patients with poor functional outcome.

Introducción y objetivos: La sobrecarga de hierro se ha asociado a un incremento del estrés oxidativo y del daño cerebral en modelos experimentales de isquemia y reperfusión cerebral. Este estudio investiga como objetivo primario si las concentraciones elevadas de ferritina en suero, como indicador de los depósitos corporales de hierro, se asocian a un peor pronóstico funcional, a la transformación hemorrágica (TH) del infarto y al edema cerebral después del tratamiento con activador recombinante tisular del plasminógeno (r-tPA) en pacientes con ictus isquémico agudo, y como objetivo secundario, mediante la determinación de biomarcadores de excitotoxicidad, inflamación y rotura de la barrera hematoencefálica, los mecanismos potencialmente asociados con el daño cerebral relacionado con el hierro en estos pacientes. Métodos: Un total de 134 pacientes consecutivos tratados con r-tPA intravenoso fueron incluidos de forma prospectiva en 4 centros hospitalarios. Las concentraciones en suero de ferritina (como indicador de los depósitos celulares de hierro), glutamato (como indicador de excitotoxicidad), interleucina-6 (como indicador de inflamación) y metaloproteasa-9 y fibronectina celular (como indicadores de rotura de la barrera hematoencefálica) fueron determinadas al ingreso, a las 24 y 72 horas después de la administración del tratamiento trombolítico. Se realizó una TC craneal al ingreso y a las 24-36 horas de la infusión del r-tPA. La gravedad neurológica y la situación funcional fueron evaluadas mediante las escalas National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS) y la modified Rankin Scale (mRS). Resultados: La TC craneal mostró TH en 27 pacientes (infarto hemorrágico en15 y hematoma parenquimatoso (HP) en 12; sintomático en 4) y edema cerebral con desplazamiento de la línea media en15. Un 54,5% de pacientes presentó una evolución funcional desfavorable (mRS>2) a los 90 días. Las concentraciones basales de ferritina fueron significativamente más elevadas en los pacientes con mal pronóstico a los 90 días (mediana [cuartiles], 165 [98,307] frente 17 [12,37] ng/mL; p<0.001), y en aquellos que desarrollaron HP (p=0.006), TH sintomática (p=0.008) y edema cerebral grave (p<0.001). Las concentraciones de ferritina superiores a 79 ng/mL antes del tratamiento con r-tPA se asociaron de forma independiente con un mal pronóstico (OR, 117 [95%CI, 25-557]). Las odds ratios ajustadas para hematoma parenquimatoso y edema cerebral grave para concentraciones basales de ferritina en suero > 79 ng/mL fueron 4.2 [95%CI, 0.8-22] y 6.4 [95%CI, 1.3-32]. Las concentraciones basales en suero de ferritina antes de la infusión del r-tPA mostraron una correlación con las concentraciones basales de glutamato (r= 0.59, p<0.001) e interleucina-6 (r= 0.55, p<0.001), y con las concentraciones de glutamato (r= 0.57, p<0.001), interleucina-6 (r= 0.49, p<0.001), metaloproteasa-9 (r= 0.23, p=0.007) y fibronectina celular (r= 0.27, p=0.002) a las 24 y 72 horas (datos no mostrados). La asociación entre las concentraciones de ferritina y glutamato permaneció en la determinación basal, 24 y 72 horas después de ajustar por factores de confusión en modelos de regresión lineal generalizados de medidas repetidas. Conclusiones: El incremento de los depósitos corporales de hierro está asociado con un peor pronóstico funcional, con la transformación hemorrágica sintomática y el edema cerebral grave en pacientes con ictus isquémicos tratados con r-tPA. El daño cerebral relacionado con la sobrecarga de hierro en pacientes con ictus isquémico tratados con r-tPA intravenoso parece estar mediado por mecanismos moleculares relacionados con el daño excitótoxico. El papel de la inflamación, de la rotura de la barrera hematoencefálica y del estrés oxidativo en este contexto requiere nuevas investigaciones. Estos hallazgos sugieren que la sobrecarga de hierro podría contrarrestar el efecto beneficioso del tratamiento trombolítico. / Background and Purpose: Iron overload has been associated with greater oxidative stress and brain injury in experimental cerebral ischemia and reperfusion. This study investigates as a primary objective whether high serum ferritin levels, as index of increased cellular iron stores, are associated with poor functional outcome, hemorrhagic transformation (HT) and brain edema after treatment with tissue plasminogen activator (t-PA) in patients with acute ischemic stroke, and as a secondary objective by measuring biomarkers of excitotoxicity, inflammation and blood brain barrier disruption, the mechanisms potentially associated with the iron overload-related damage in these patients. Methods: A total of 134 consecutive patients treated with i.v. t-PA were prospectively studied in 4 centers. Serum ferritin levels (as index of increased cellular iron stores), glutamate (as index of excitotoxicity), interleukin-6 (as index of inflammation) and matrix metalloproteinase-9 and cellular fibronectin (as index of blood-brain barrier disruption) were determined at baseline, 24 and 72 hours after treatment. Cranial CT was performed on admission and at 24-36 hours after t-PA infusion. Stroke severity and functional outcome were evaluated by using the National Institute of Health Stroke Scale and the modified Rankin Scale (mRS). Results: CT showed HT in 27 patients (hemorrhagic infarction in 15 and parenchymal hematoma (PH) in 12; symptomatic in 4) and brain swelling with midline shift in 15. Poor functional outcome (mRS >2) at 90 days was observed in 54.5% of patients. Ferritin levels at baseline were higher in patients with poor outcome at 90 days (median [quartiles], 165 [98,307] versus 17 [12,37] ng/mL; p<0.001), and in those who developed PH (p=0.006), symptomatic HT (p=0.008), and severe brain edema (p<0.001). Serum ferritin levels higher than 79 ng/mL before t-PA treatment were independently associated with poor outcome (OR, 117 [95%CI, 25-557]). The adjusted odds ratios of parenchymal hematoma and severe brain edema for baseline ferritin levels > 79 ng/mL were 4.2 [95%CI, 0.8-22] and 6.4 [95%CI, 1.3-32]. Serum ferritin levels before t-PA infusion correlated to glutamate (r= 0.59, p<0.001) and interleukin-6 (r= 0.55, p<0.001) levels at baseline, and with glutamate (r= 0.57, p<0.001), interleukin-6 (r= 0.49, p<0.001), metalloproteinase-9 (r= 0.23, p=0.007) and cellular fibronectin (r= 0.27, p=0.002) levels measured at 24 hours and at 72 hours (data not shown). The association between ferritin and glutamate levels at baseline, 24 hours and 72 hours and between ferritin and MMP-9 at 72 hours remained after adjustment for confounding factors in generalized linear models. Conclusions: Increased body iron stores are associated with poor functional outcome, symptomatic HT and severe edema in patients treated with t-PA after ischemic stroke. Iron overload-related damage in acute ischemic stroke patients treated with iv. tPA may be mediated by molecular mechanisms linked to excitotoxic damage. The role of inflammation, blood brain barrier disruption and oxidative stress in this condition needs further research. These findings suggest that iron overload may offset the beneficial effect of thrombolytic therapies.

Los mecanismos implicados en el deterioro neurológico precoz (DNP) y en la transformación hemorrágica (TH) de la lesión isquémica cerebral no se conocen con exactitud. Estudios previos habían demostrado la asociación de niveles elevados de TNF-a e IL-6 con el DNP en pacientes con isquemia cerebral independientemente del mecanismo ictal. Sin embargo, los mecanismos relacionados con el DNP en pacientes con infarto lacunar no se conocían con exactitud. Con el objetivo de determinar si los mecanismos inflamatorios participaban en la progresión y el pronóstico funcional de estos pacientes se determinaron los niveles de TNF-a, IL-6 e ICAM-1 en el momento del ingreso en 113 pacientes con ictus lacunar de < 24 h de evolución. Los pacientes con DNP y mal pronóstico funcional tenían niveles significativamente más elevados de las moléculas analizadas en el momento del ingreso. El análisis de regresión logística demostró que niveles de TNF-alfa > 14 pg/mL y de ICAM-1 > 208 pg/mL se asociaban de manera independiente tanto con el DNP como con el mal pronóstico funcional evaluado a los 3 meses. En cuanto a la TH, se había demostrado la asociación de niveles elevados de MMP-9 y la aparición de TH exclusivamente en pacientes con ictus de mecanismo cardioembólico por lo que se analizaron los niveles de esta molécula en 250 pacientes con ictus hemisférico de < 24 horas de evolución con el objetivo de conocer la capacidad predictora de TH de esta molécula independientemente del mecanismo ictal. Los pacientes con TH presentaron niveles significativamente más elevados de MMP-9. La regresión logística demostró que niveles de MMP-9 &#8805; 140 ng/mL se asociaban de manera independiente con la aparición de TH y predijeron la aparición de sangrado con una sensibilidad del 87%, especificidad del 90%, valor predictivo positivo (VPP) del 61% y valor predictivo negativo (VPN) del 97%. Finalmente, se estudió la asociación de los niveles de Fibronectina-celular (Fn-c) como molécula marcadora de daño endotelial y la aparición de TH en 87 pacientes con ictus isquémico tratados con rt-PA. También se analizaron los niveles de MMP-9 con el objetivo de comparar la capacidad predictora de ambas moléculas. Los niveles de Fn-c y MMP-9 previos a la administración de rt-PA fueron significativamente mayores en pacientes con TH. Los niveles de Fn-c fueron además más elevados en pacientes con TH sintomática mientras que los niveles de MMP-9 fueron similares en pacientes con TH sintomática y asintomática. En el análisis de regresión, la Fn-c fue la única variable asociada con la aparición de TH independientemente de otros factores que aumentan el riesgo de TH en pacientes que reciben rt-PA. Niveles de Fn-c &#8805; 3.6 µg/mL predijeron la aparición de infarto hemorrágico tipo 2 y hemorragia parenquimatosa (tipos de TH cuya frecuencia aumenta por la administración de rt-PA) con una sensibilidad del 100%, especificidad del 96%, VPP del 44% y VPN del 100%, mientras que los valores de los niveles de MMP-9 para los mismos tipos de TH fueron menores (81%, 88%, 41% y 98%, respectivamente). Los resultados de este estudio se demostraron en pacientes tratados tanto en las 6 como en las 3 primeras de evolución. En conclusión, los resultados demuestran que la inflamación participa en la progresión de pacientes con infarto lacunar y confirman que las concentraciones elevadas de MMP-9 son un factor predictor independiente de TH en pacientes con ictus isquémico agudo. Además, las concentraciones elevadas de Fn-c se asocian de manera independiente con la aparición de TH en pacientes tratados con rt-PA con lo que la determinación de Fn-c podría ser útil en la clínica práctica para mejorar el ratio riesgo/beneficio de la administración de tratamiento trombolítico. / The mechanisms related to early neurological deterioration (END) and hemorrhagic transformation (HT) in patients with acute cerebral ischemia are not completely understood. Previous studies have demostrated the association between high levels of TNF-a and IL-6 and END in patients with acute cerebral ischemia independently of the ischemic stroke mechanism. However, the mechanisms underlying neurological deterioration in patients with lacunar infarction have not been clearly established. The role of proinflammatory molecules (TNF-a, IL-6 and ICAM-1) in the early worsening and outcome of 113 consecutive patients with lacunar infarction within the first 24 hours of the onset of symptoms was investigated. Those patients with END as well as poor outcome had significantly higher levels at admission of the analyzed molecules. Logistic regression analysis showed that TNF-alfa > 14 pg/mL and ICAM-1 > 208 pg/mL were independently associated with both END and poor outcome at 3 months. On the other hand, the association between high levels of matrix metaloproteinase-9 (MMP-9) and secondary bleeding in patients with cardiembolic ischemic stroke had been already published. However, there were no data about the HT predictive capacity of MMP-9 in patients with other stroke subtypes. The association between high levels of MMP-9 and the development of HT was determined in 250 patients with hemispheric ischemic stroke within the first 24 hours of symptoms' onset. The results demonstrated that those patients with HT had significantly higher levels of MMP-9 at admission compared to those without secondary bleeding. Logistic regression analysis showed that MMP-9 levels &#8805; 140 ng/mL were independently associated with HT after adjustment for potential confounders. Moreover, MMP-9 levels &#8805; 140 ng/mL predicted the development of HT with a sensitivity, especificity, negative predictive value (NPV) and positive predictive value (PPV) of 87%, 90%, 61% and 97%, respectively. Finally, the association between the levels of cellular-Fibronectin (c-Fn), taken as a more specific marker of endothelial damage, and the development of HT in 87 patients who received thrombolytic treatment with rt-PA was evaluated. In order to compare the predictive capacity of MMP-9 and c-Fn levels, the levels of MMP-9 were also analyzed in this group of patients. The results demonstrated that patients with HT had significantly higher c-Fn as well as MMP-9 levels before the administration of the treatment. The levels of c-Fn were also higher in patients with symptomatic HT whereas no differences were found in MMP-9 levels between symptomatic and asymptomatic HT. Logistic regression analysis showed that c-Fn levels was the only variable associated with HT development after adjustment of potential confounders, which included MMP-9 levels. Levels of c-Fn &#8805; 3.6 µg/mL predicted the development of hemorrhagic infarction type 2 and parenchymal hemorrhage (types of HT that has been reported to occur more often in patients treated with rt-PA) with a sensitivity of 100%, specificity of 96%, NPV of 44% and PPV of 100%, whereas the sensitivity, specificity, NPV and PPV of MMP-9 levels &#8805; 140 ng/mL were 81%, 88%, 41% and 98%, respectively. These results were observed both in patients treated within 6 hours and within 3 hours from symptoms' onset. In conclusion, the results suggest that inflammation contributes to brain injury in patients with lacunar stroke and confirm that high plasma MMP-9 concentration is an independent predictor of HT in patients with acute ischemic stroke. Moreover, high plasma c-Fn levels are significantly associated with subsequent HT in stroke patients treated with rt-PA, so plasma c-Fn determinations might be useful in clinical practice to improve the risk/benefit ratio of thrombolytic treatment.

INTRODUCCIÓN: El crecimiento de la hemorragia intracerebral (CHIC) ocurre en el 38% de los pacientes durante las primeras 24 horas y se ha relacionado con un peor pronóstico. Se ha sugerido que el CHIC se produciría en el área perihematoma, en relación con múltiples mecanismos, entre los que se han implicado el efecto mecánico producido por el propio hematoma que induciría a la isquemia, la liberación de sustancias procedentes del coágulo, la expresión de metaloproteasas que degradan los componentes de la lámina basal y la activación de la cascada inflamatoria.HIPÓTESIS DE TRABAJO: Nuestra hipótesis de trabajo se basa en que el crecimiento precoz de la hemorragia intracerebral (CPHIC) se debe a la ruptura de la lámina basal por la acción de metaloproteasas y mediadores de inflamación, lo que conduciría a la expresión de marcadores de daño endotelial e inflamación en plasma.OBJETIVOS: El objetivo primario de nuestro estudio fue investigar si los marcadores de daño endotelial (fibronectina celular (C-FN) y metaloproteasa-9 (MMP-9)) y los mediadores de inflamación (IL-6 y TNF-alfa) se relacionan con el CPHIC y el objetivo secundario analizar si el CPHIC se relaciona con el deterioro neurológico precoz y la situación funcional de los pacientes a los 3 meses.MATERIAL Y MÉTODOS: Se incluyeron 183 pacientes consecutivos en un estudio multicéntrico, diagnosticados de HIC espontánea supratentorial mediante TC craneal y evaluados dentro de las primeras 12 horas desde el inicio de los síntomas. Se realizó una evaluación neurológica a su llegada a urgencias, a las 48 horas y a los 3 meses, incluyendo la escala canadiense (EC). Se definió el deterioro neurológico precoz como el descenso en un punto o más en la EC entre la exploración a las 48 horas y la basal. A los 3 meses se valoró la dependencia mediante la escala de Rankin modificada (ERm) y la mortalidad.Se practicó una TC craneal al ingreso y a las 48 horas. Se definió el crecimiento de la HIC como el incremento >33% respecto al volumen inicial para las HIC de < 20 cc en la exploración basal y el incremento>10% para las HIC &#8805; 20 cc. RESULTADOS: Se observó CPHIC en el 29.5% de los pacientes. El análisis bivariado detectó niveles de leucocitos y fibrinógeno al ingreso significativamente superiores en el grupo de pacientes con CPHIC (n=129) respecto al grupo sin CPHIC (n=54), así como niveles inferiores de plaquetas y menor porcentaje de invasión ventricular en el primer grupo. Las concentraciones plasmáticas al ingreso de IL-6, TNF-alfa, MMp-9 y C-FN fueron significativamente superiores en los pacientes que presentaron CPHIC. Se observó una correlación positiva entre los niveles de C-FN y MMP-9 al ingreso y el porcentaje de crecimiento del hematoma (r=0.77 y r=0.64, respectivamente; p<0.0001). Esta correlación, aunque menor, también se observó entre los niveles plasmáticos al ingreso de TNF-alfa e IL-6 y el porcentaje de crecimiento del hematoma.El análisis de regresión logística identificó como variables con capacidad predictiva independiente sobre el crecimiento del hematoma los niveles de C-FN al ingreso > 5.9 mg/ml (OR 81; IC95% 20-325; p<0.001), de IL-6 al ingreso >24.4 pg/ml (OR 18; IC95% 2.5-137; p=0.004) y los niveles de fibrinógeno al ingreso (OR 1; IC95% 1-1,01; p=0.04).Se observó deterioro neurológico precoz en el 44.4% de los pacientes con CPHIC y en el 13.2% de los pacientes sin CPHIC (p<0.0001). La mortalidad a los 3 meses fue del 37% en el primer grupo respecto al 11.6% en el segundo (p<0.0001) y la dependencia (ERm>2) del 75.5% y 54.5%, respectivamente (p<0.05). El CPHIC se asoció a un incremento en el riesgo independiente de deterioro neurológico precoz (OR 3.7; IC95% 1.1-12.4), mortalidad (OR 5.2; IC95% 1.9-14.2) y dependencia a los 3 meses (OR 3.7; IC95% 1.0-13.2) tras ajustar por las variables significativas en el análisis bivariado.CONCLUSIONES: El CPHIC se produce en el 29.5% de los pacientes en las primeras 48 horas. Los pacientes con CPHIC presentaban niveles plasmáticos al ingreso de fibrinógeno, leucocitos, IL-6, TNF-alfa, MMP-9 y C-FN significativamente más elevados y niveles más bajos de plaquetas y menor porcentaje de invasión intraventricular. Los factores predictivos independientes de CPHIC fueron los niveles de C-FN, IL-6 y fibrinógeno al ingreso. El CPHIC se relacionó con un incremento en el riesgo de deterioro neurológico precoz y morbimortalidad a los 3 meses. Estos datos apoyan la participación de la ruptura de la lámina basal y de la inflamación en los mecanismos fisiopatológicos que intervienen en el crecimiento del hematoma cerebral. / INTRODUCTION: Hematoma growth (HG) has been reported in the 38% of patients during the first 24 hours and has been associated to poor outcome. HG has been related to several mechanisms that occurred in the area perihematoma, such as a mechanic effect that lead to ischemia, the release of clot-derived proteins, metalloprotease expression and inflammatory-cascade activation.HYPOTHESIS: We hypothesize that early hematoma growth (EHG) is a consequence of the rupture of basal lamina due to the action of metalloproteases and inflammatory mediators, that lead a plasma overexpression of vascular injury and inflammatory markers.OBJECTIVE: Our primary objective was to investigate if vascular injury markers (cellular fibronectin (C-FN) and metalloprotease-9 (MMP-9)) and inflammatory markers (IL-6 and TNF-a) are associated to the EHG. The secondary objective was to analyze if the EHG is related to early neurological deterioration and functional situation of patients at 3 months.SUBJECTS AND METHODS: We included 183 consecutive patients with a spontaneous HIC diagnosed by cranial CT and evaluated during the first 12 hours from symptoms onset in a multicentre study. Neurological evaluation including the Canadian Stroke Scale (CSS) was performed at admission, at 48 hours and 3 months. Early neurological deterioration was diagnosed when the CSS score decreased 1 or more points between admission and 48 hours. At 3 months we evaluated dependency by the modified Rankin Scale (mRS) and mortality. A cranial CT was performed at admission and at 48 hours. EHG was defined as an increase in the volume of ICH of > 33% on the 48-hours CT scan compared with the baseline CT scan in ICH < 20 cc and of > 10% in the case of ICH &#8805; 20 cc.RESULTS: EHG occurred in the 29.5% of patients. Bivariate analysis identified that patients with EHG (n=54) had higher leukocyte count, and plasma fibrinogen levels at admission, and lower platelet count and intraventricular bleeding than non EHG patients (n=129). Plasma concentrations of IL-6, TNF-_, MMP-9, and C-Fn were significantly higher in patients with subsequent EHG. A highly significant correlation was found between plasma C-Fn and MMP-9 levels on admission and the percentage of ICH growth (r=0.77 and r=0.64, respectively; both p<0.001). Also, a significant moderate correlation was found between baseline TNF-_ and IL-6 levels and the percentage of ICH growth. C-FN levels on admission > 5.9 mg/ml (OR 81; IC95% 20-325; p<0.001), IL-6 levels on admission >24.4 pg/ml (OR 18; IC95% 2.5-137; p=0.004) and fibrinogen levels on admission were independently associated with EHG in the logistic regression analysis. Early neurological deterioration was observed in the 44% of patients with EHG and in the 13.2% of non EHG patients (p<0.0001). At 3 months, mortality was recorded in the 37% and 11.6%, respectively (p<0.0001) and dependency (mRS>2) in the 75.5% and 54.5% (p<0.05).EHG was significantly associated with an increased risk of early neurological deterioration (OR, 3.7; 95%CI, 1.1-12.4), mortality (OR, 5.2; 95%CI, 1.9-14.2), and poor functional outcome at 3 months (OR, 3.7; 95%CI, 1.0-13.2) after adjustment for potential confounders in the bivariate analysis. CONCLUSIONS: EHG occurred in the 29.5% of patients during the first 48 hours. Patients with EHG had higher leukocyte count, and plasma fibrinogen levels at admission, and lower platelet count and intraventricular bleeding than non EHG patients. Plasma C-FN, IL-6 and fibrinogen levels on admission were independent predictive factors of EHG. EHG increased the risk of early neurological deterioration and mortality and dependency at 3 months. These findings support the implication of basal lamina rupture and inflammatory-cascade in the pathogenesis of EHG.

El fetge, òrgan fonamental en el control del metabolisme intermediari, està implicat en múltiples funcions com la producció de la bilis per la digestió, el metabolisme de carbohidrats i de lípids; la síntesi de proteïnes i dels factors de coagulació; l’emmagatzematge de vitamines i de ions; o l’eliminació de substàncies tòxiques de la sang. Quan el fetge perd la seva funció sintètica i metabòlica es produeix una insuficiència hepàtica que pot provocar complicacions que afecten al cervell com són desordres en el sistema nerviós central, augment del contingut d’aigua cerebral, alteracions de l’autoregulació del flux sanguini i canvis en el metabolisme cerebral. L’encefalopatia és una greu complicació produïda per una insuficiència hepàtica tant crònica com aguda. Els pacients amb encefalopatia hepàtica manifesten desordres en el sistema nerviós central que van des de canvis neurològics mínims fins a un estat de coma. La qualitat de vida d’aquests pacients es troba afectada i això fa que l’encefalopatia hepàtica sigui un element a considerar en les estratègies per la gestió clínica, per la prioritat del trasplantament hepàtic i per la supervivència del pacient. L’edema cerebral també és una greu complicació observada en la insuficiència hepàtica. Encara que, no està clar quin paper juga aquest increment d’aigua en l’encefalopatia hepàtica, sembla que l’amoni també està implicat en el mecanisme de formació de l’edema. Es creu que l’amoni té un efecte advers en la regulació dels osmolits, induint la formació de glutamina que és un reservori d’amoni cerebral i això contribueix a perpetuar l’edema cerebral. El desenvolupament de noves tecnologies no invasives ha permès avaluar la morfologia i la funció cerebral ‘in vivo’ i això ha estat crucial per entendre la patogènesi de diferents desordres neurològics. La ressonància magnètica ha estat la tècnica elegida per avaluar ambdues complicacions i així poder establir el mecanisme de desenvolupament. Aquests estudis s’han dut a terme tan en models animals com en pacients. Estudis previs han descrit imatges característiques: potenciades en T1, on s’observen hiperintensitats situades en els ganglis de la base que probablement es deuen a la deposició de manganès; imatges potenciades en T2 i difusió, on s’observen hiperintensitats difuses situades en la regió corticoespinal i hiperintensitats focals en la substància blanca que corresponen a àrees en les que hi ha un increment de l’aigua cerebral. Aquests malalts també presenten espectres amb un patró metabòlic caracteritzat per un augment de les ressonàncies de glutamat/glutamina i una disminució de myo-inositol i colina. Aquestes alteracions reverteixen de forma parcial o total després del trasplantament hepàtic o de l’episodi d’encefalopatia hepàtica. Els resultats dels diversos estudis realitzats en aquesta tesi mostren que existeixen diferents patrons en l'augment d'aigua cerebral produïts per la insuficiència hepàtica. Aquest augment de l’aigua seria principalment intracel·lular en la insuficiència hepàtica aguda, mixte en la insuficiència hepàtica crònica aguditzada i extracel·lular en la insuficiència hepàtica crònica. La hipòtesi que es podria suggerir sobre l’edema cerebral en l’insuficiència hepàtica seria la següent. En un primer moment es formaria l’edema citotòxic a nivell de l’astròcit produït per l’augment de la concentració d’amoníac al cervell en forma de glutamina. El segon esdeveniment, i tenint en compte que l’astròcit forma part de la barrera hematoencefàlica, és l’existència d’una alteració de la barrera que a llarg termini produiria l’edema vasogènic. Tot i que l’edema cerebral està present en pacients durant un episodi d’encefalopatia hepàtica, no sembla ser el factor desencadenant d’aquesta complicació. La glutamina cerebral augmenta a mesura que creix el grau d’encefalopatia hepàtica i es redueix un cop el pacient s’ha recuperat de l’episodi i per això podria ser un biomarcador pel diagnòstic de l’encefalopatia. / The liver, an important organ of intermediary metabolism control, is involved in several functions such as producing bile for digestion, the metabolism of carbohydrates and lipids, synthesis of coagulation factors, vitamins and ions storage, or the elimination of toxic substances in the blood. The loss of liver function produces a liver failure that can cause subsequent complications that affects to the brain, such as disorders in the central nervous system, increase of brain water content and alterations in the autoregulation. Hepatic encephalopathy is a severe complication caused by both chronic and acute liver failure. Patients with hepatic encephalopathy manifested central nervous system disorders ranging from minimum neurological changes to coma. The quality of life of these patients is affected; so hepatic encephalopathy is an element to consider in the strategies for clinical management, liver transplantation priority and patient survival. Cerebral edema is also a serious complication observed in liver failure. Although it is unclear the role of cerebral edema in hepatic encephalopathy, it appears that ammonia is also involved in the mechanism of edema development. It is hypothesized that ammonia has an adverse effect on the regulation of the osmolytes, inducing the formation of glutamine that is a reservoir of brain ammonia and perpetuates the edema. The development of new technologies has made possible a non-invasive 'in vivo' evaluation of morphology and brain function that is crucial for understanding the pathogenesis of neurological disorders. Magnetic resonance was used to evaluate both the brain edema in experimental models and patients. Previous studies showed imaging features: T1WI observed hyperintensities localized in the basal ganglia, probably due to manganese deposition; T2WI and diffusion images showed focal white matter lesions and diffuse hyperintensities related to an increase in brain water. These patients also had a metabolic pattern characterized by an increased of glutamate and glutamine and a decreased of myo-inositol and choline. These alterations reverted partially or completely after liver transplantation or after resolution of hepatic encephalopathy. The results of studies obtained in this thesis showed differences in brain water distribution in relation to the time course of liver failure. The results suggest that there is a spectrum in the increase in brain water in liver failure that is predominantly intracellular in acute liver failure, mixed in acute-on-chronic liver failure and extracellular in chronic liver failure. A hypothesis could suggest for cerebral edema in liver failure would be the following. Firstly, the formation of cytotoxic edema produced in the astrocyte due to the rise of ammonia concentration (glutamine) in the brain. Finally, taking an account that astrocyte is an element of the blood-brain-barrier, there could be an alteration in the barrier and consequently could produce vasogenic edema at long-term. Although cerebral edema is present in patients during an episode of hepatic encephalopathy, it not seems to be the triggering factor of this complication. The brain glutamine, measured by spectroscopy, increases with the hepatic encephalopathy degree and decreases when patient recovered from the episode, thus brain glutamine could be a biomarker for the diagnosis of encephalopathy.

INTRODUCCIÓN: El ictus constituye la segunda causa de mortalidad global en España (la primera causa en mujeres) y la primera de discapacidad. Aproximadamente un 6-10% de los ictus isquémicos en nuestra población son debidos a la aterosclerosis intracraneal, y se considera que ésta es la principal causa de ictus isquémico a nivel mundial, debido a su alta prevalencia en países asiáticos. Dada la importancia creciente de la prevención primaria del ictus y la ausencia de estudios sobre la fase asintomática de esta patología en nuestro medio, el estudio Barcelona- AsIA (Asymptomatic Intracranial Atherosclerosis study) se diseñó para conocer la prevalencia de aterosclerosis intracraneal asintomática en una población caucásica con riesgo vascular moderado-alto, estudiar su impacto pronóstico, e identificar factores clínicos, biológicos y genéticos asociados a su desarrollo, progresión y expresión clínica. Asimismo, se diseñó para comparar dichos factores con los asociados a la presencia de aterosclerosis extracraneal asintomática en la misma población. En la presente tesis se expone el diseño y los principales resultados de la fase transversal del estudio Barcelona-AsIA. MÉTODOS: El estudio Barcelona-AsIA constituye el primer trabajo centrado el estudio de la aterosclerosis intracraneal asintomática en población caucásica. Se trata de un estudio transversal y longitudinal, observacional y de base poblacional. Se incluyeron prospectivamente 933 sujetos mayores de 50 años con riesgo vascular moderado-alto y sin enfermedad cerebrovascular previa, seleccionados de una forma aleatoria en nuestra área sanitaria de 600.000 habitantes. En la visita basal se recogieron variables demográficas, socioeconómicas y clínicas, y se obtuvieron muestras sanguíneas para estudio de marcadores biológicos y genéticos. Se realizó un Eco-Doppler de troncos supra-aórticos y transcraneal para detectar la presencia de lesiones ateroscleróticas extra e intracraneales, confirmando estas últimas mediante angioresonancia magnética. En la fase longitudinal del estudio se evaluará durante 3 años el impacto pronóstico de la aterosclerosis intracraneal asintomática en la aparición de eventos vasculares cerebrales, cardiacos y periféricos, y en la muerte de origen vascular. RESULTADOS/DISCUSIÓN: La fase transversal del estudio ha permitido determinar que la prevalencia de aterosclerosis intracraneal asintomática de cualquier grado en una población caucásica con riesgo vascular moderado-alto y sin antecedentes de ictus es del 8.6%, y que la prevalencia de aterosclerosis intracraneal de grado moderado-grave es del 3.3%. Los factores clínicos asociados a la presencia y mayor gravedad de la aterosclerosis intracraneal fueron la edad, la diabetes y el síndrome metabólico. La resistencia insulínica se mostró como un factor íntimamente relacionado con el desarrollo de lesiones ateroscleróticas a nivel intracraneal, más que a nivel extracraneal. Los niveles séricos del marcador de disfunción endotelial ADMA y de la molécula inflamatoria resistina también se asociaron de forma independiente a la presencia de aterosclerosis intracraneal asintomática en nuestra población. El presente trabajo ha dado luz a un vacío existente en la literatura ya que nos ha permitido conocer la prevalencia de aterosclerosis intracraneal asintomática en población caucásica, desconocida hasta ahora. Además, el hallazgo de los principales factores de riesgo asociados a la presencia y gravedad de la aterosclerosis intracraneal desde su fase pre-clínica, nos ayudará a detectar a los sujetos en riesgo de presentar esta patología en nuestra población. La evaluación del impacto pronóstico de la presencia de aterosclerosis intracraneal asintomática durante la fase longitudinal del estudio ASIA podrá ser útil para diseñar estrategias sanitarias coste-efectivas en el campo de la prevención primaria de la enfermedad cerebrovascular sintomáti / INTRODUCTION: Stroke is the second cause of mortality and the first cause of disability in Spain. Around 6-10% of ischemic strokes in our population are caused by large artery intracranial atherosclerosis (ICAD). Moreover, ICAD is considered the major cause of ischemic stroke worldwide, due to the high prevalence of this entity in Asian populations. Owing to the importance of developing stroke primary prevention strategies, Barcelona-AsIA (Asymptomatic Intracranial Atherosclerosis) study was designed to determine the prevalence of asymptomatic ICAD in a stroke-free Caucasian population with moderate-high vascular risk, to study its prognostic impact and to identify clinical, molecular and genetic factors associated with its development, progression and clinical expression. We also aimed to compare these factors with the presence of asymptomatic extracranial atherosclerosis in the same population. In this doctoral thesis we present the design and first results of the transversal phase of Barcelona-AsIA study. METHODS: Barcelona-AsIA study is the first study on asymptomatic ICAD in a Caucasian population. This is a population-based, prospective and long-term follow-up observational study. We included 933 subjects older than 50 years, with a moderate-high vascular risk and without history of stroke, randomly selected from our reference population of 600.000. At baseline visit we registered clinical, demographic and anthropometric data, and we collected blood samples to study biological and genetic markers. All individuals underwent a complete extracranial and transcranial color-coded duplex to identify the presence and severity of carotid atherosclerosis and intracranial stenoses. Intracranial stenoses were also assessed by magnetic resonance angiography. In the longitudinal phase of the study we will evaluate the prognosis impact of asymptomatic intracranial atherosclerosis on the risk of suffering major ischemic vascular events and vascular death. RESULTS/DISCUSSION: Prevalence of asymptomatic intracranial atherosclerosis of any degree in a Caucasian population with moderate-high vascular risk and without history of stroke was 8.6%, and prevalence of moderate-severe intracranial lesions was 3.3%. Age, diabetes and metabolic syndrome were risk factors independently associated with the presence and higher severity of asymptomatic intracranial atherosclerosis. Insulin resistance was found to be an important factor associated with the development of intracranial atherosclerosis, more than with extracranial atherosclerosis. High levels of serum biomarkers ADMA (marker of endothelial dysfunction) and resistin (inflammatory marker) were independently associated with the presence of isolated intracranial atherosclerosis and combined intracranial-extracranial atherosclerosis respectively. The present study has allowed us to determine the prevalence of asymptomatic intracranial atherosclerosis in a Caucasian population, which was unknown until now. Moreover, the finding of the main clinical and biological risk factors associated with intracranial atherosclerosis from its preclinical stage will allow us to detect individuals at risk in our population. The evaluation of the prognosis impact of asymptomatic intracranial atherosclerosis in the longitudinal phase of Barcelona-AsIA study will allow us to evaluate cost-effectiveness in the field of stroke primary prevention.

La disferlina es una proteína que se expresa en el músculo esquelético humano. Aunque su función no se conoce completamente, se sabe que participa en la reparación de la membrana tras una lesión externa. Los pacientes con un déficit de disferlina sufren una distrofia muscular lentamente progresiva para la que no se conoce tratamiento alguno. En esta tesis hemos investigado nuevos aspectos diagnósticos y terapéuticos de esta enfermedad. Hemos demostrado que el estudio de la expresión de disferlina en monocitos de sangre periférica es una técnica útil para detectar pacientes con la enfermedad. Esta técnica es rápida, ya que se puede obtener un resultado en 48 horas, y evita la realización de biopsias musculares en pacientes con una disferlinopatía, aportando además material genético suficiente para poder detectar la presencia de mutaciones. Existen diferentes patrones de expresión de disferlina: los pacientes con dos mutaciones tienen niveles de entre un 0 y un 20%, los portadores de una única mutación tienen una expresión de entre el 20 y el 80% y en personas sin mutación en el gen de la disferlina los niveles se encuentran por encima del 80%. Hemos demostrado que existe una buena correlación entre la expresión de disferlina en monocitos y en músculo, siendo así una buena herramienta para confirmar la efectividad de tratamientos destinados a incrementar la expresión de disferlina. Desde el punto de vista terapéutico hemos investigado dos opciones diferentes. Por un lado hemos demostrado que la vitamina D es capaz de incrementar la expresión de disferlina tanto en monocitos como en miotubos de individuos portadores de una mutación en el gen de la disferlina in vitro. Estos resultados han sido confirmados in vivo gracias a la realización de un ensayo clínico con vitamina D en portadores de una mutación en el gen de la disferlina. Por otro lado hemos demostrado como el trasplante de un tipo de célula madre, los mesoangioblastos (MABs), es efectivo en un modelo murino de la enfermedad. Los MABs fueron aislados desde biopsias musculares de ratones sanos adultos e inyectados por vía intra-arterial en ratones A/J SCID deficitarios en disferlina. Estas células colonizaron los músculos enfermos, fusionaron con las fibras musculares enfermas y recuperaron la producción de disferlina. Este cambio, indujo una mejoría funcional notable, permitiendo que las fibras musculares fuesen capaces de reparar la membrana. Dado que los MABs son un subtipo de pericitos, células periendoteliales presentes en el músculo esquelético, estudiamos si los pericitos participan en el proceso de regeneración muscular in vivo en los músculos distróficos. Hemos observado que esta población celular está incrementada en biopsias distróficas, existiendo una buena correlación entre el número de células y el grado de destrucción y regeneración observado en las biopsias. Estas células expresan in vivo marcadores de diferenciación a músculo, como el factor MyoD, y son capaces de fusionar con miotubos in vitro, participando en el crecimiento de los mismos. Estos datos sugieren que los pericitos pueden participar en el proceso de regeneración muscular que tiene lugar en las distrofias musculares. / Dysferlin is a protein expressed in the skeletal muscle. Despite its function is not completely known yet, it seems that participate in the process of membrane reparation after a damage. Patients with mutation in the dysferlin gene develop a muscle dystrophy characterized by a progressive weakness of the muscles of the lower and upper limbs. There is not any effective treatment for this disease yet. In the present thesis we have studied diagnostic and therapeutics aspects of the disease. We have demonstrated that the study of the expression of dysferlin in monocytes from peripheral blood is useful to detect patients with dysferlinopathy. This technique is quick, a result can be obtained in less tan 48 hours, as avoid the need of a muscle biopsy in patients affected. Moreover, it allows the study of mutations in the dysferlin gene. There are different patterns of expression of dysferlin related to the number of mutation present in the gene. In patients with two mutations, levels are between 0 and 20%. In carriers of one mutation in the gene, levels of expression are between 20 and 80% and finally in patients with no mutation in the dysferlin gene, levels are higher than 80%. We have also demonstrated that there is a good correlation between the expression of dysferlin in monocytes and in skeletal muscle. For this reason, we think that the study of dysferlin expression in monocytes could be a good tool to follow-up patients treated with drugs able to increase the expression of dysferlin. From a therapeutic point of view we have investigated two different options. We have demonstrated that vitamin D is able to increase the expression of dysferlin both in monocytes and in myotubes of carriers of a single mutation in the dysferlin gene in vitro. These results have been confirmed in vivo trough a clinical trial where healthy carriers of a single mutation in the dysferlin gene have been treated with vitamin D. We have also demonstrated that transplantation of mesoangioblasts (MABs), a mesenchymal stem cell, is effective in a murine model of the disease. MABs were isolated from muscle biopsies of adult healthy mice and injected into the femoral artery of A/J SCID mice. The cells were able to colonize the skeletal muscle, fusing with the regenerating muscle fibres and restoring the expression of dysferlin. Moreover, we demonstrated that this new dysferlin was completely functional, because muscle fibres treated were able to repair the membrane after an external damage. In view that MABs are a subtype of pericytes, periendothelial cells present in the normal skeletal muscle, we wondered if these cells are able to participate in the normal process of muscle regeneration. We observed that the population of pericytes is increased in dystrophic muscle biopsies of our patients. There was a good correlation between the degree of muscle regeneration and degeneration an the number of pericytes in the biopsy. We have observed that pericytes expressed transcription factors specific of skeletal muscle differentiation pathway in vivo, as for example MyoD. Finally, these cells were able to activate the skeletal muscle differentiation process and fuse with mature myotubes in vitro, suggesting that they are able to fuse with regerenerating muscle fibers in vivo, and participating in the normal process of muscle regeneration in humans.

Tesi realitzada a l'Institut d’Investigacions Biomédiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / The present Thesis addressed different questions concerning spontaneous oscillatory activity in the cerebral cortex, including functional comparative studies, studies of mechanisms generating this activity and the evaluation of alterations in a model of mental disability. The main technique used for this work is the recording of electrophysiological extracellular Local Field Potential signals, which mainly respond to the activity of local populations of neurons. This type of recordings was obtained both in brain slices and in vivo and was used in combination with other techniques. Single Unit recordings, which evaluate the firing properties of a single neuron, were also obtained in combination of LFP in some of the studies. In the first study, we aimed to disclose the role of persistent sodium current in controlling cortical oscillatory activity, either in the generation and maintenance of UP states in slow oscillations and the control of fast beta-gamma oscillations. Here, we saw that blocking this current with phenytoin provoked the elongation of UP states and increased firing rate of the network, while the generation of new UP states was prevented. In another study, we performed a comparison of the oscillatory activity along different cortical areas in vivo. Here, prefrontal cortex showed special features compared to primary areas, including increased firing rate and gamma oscillations, and firing patterns of single units. This study also included a measurement of the speed of propagation of UP states, because prefrontal cortex was found to present a reduced Coefficient of Variation of UP state duration, compatible with being an area of wave generation. Thus, we aimed to demonstrate a main pattern of propagation of slow waves from frontal areas to posterior areas, as previously described in humans. Finally, we performed a study of the functional and anatomical alterations in the cortical network underlying cognitive deficits in a transgenic model of Down syndrome, TgDyrk1A mice. This work was performed in two cortical areas: prefrontal and primary somatosensory cortex. In our study of prefrontal cortex, TgDyrk1A mice presented alterations in oscillatory activity that were compatible with as more inhibited network, such as decreased firing rate, decreased gamma oscillations and a slower speed of propagation. This unbalance between excitation and inhibition was later demonstrated at anatomical level, and may explain our findings of altered behavior in cognitive tasks that involved prefrontal cortex such as the puzzle box. In our study in somatosensory cortex, thalamocortical evoked potentials showed increased cortical inhibition. Although that, oscillatory activity, either in parameters of Slow waves or beta-gamma frequencies, remained unchanged, suggesting the existence of compensatory mechanisms. From the work of this Thesis, we demonstrated some mechanistic aspects that control the emergence of rhythmic patterns from cortical circuits, with a striking role on the mechanisms which control excitability or cortical connectivity that underlies oscillations. First, this study presents de dependence of slow and fast rhythms on an intrinsic mechanism of neurons that governs cortical oscillations which is the persistent sodium current. Secondly, here is presented the role of cortical excitability in the expression of those rhythms across different cortical areas. And finally, this study shows the changes in cortical network function in a model of Down syndrome by means of analyzing oscillatory activity, as this represents a network activity and reflects the altered cellular and connectivity elements which are critical for the expression of cortical rhythms. These findings can all be understood within frame of altered balance between excitation and inhibition. / Esta Tesis aborda diferentes cuestiones acerca de la actividad oscilatoria espontánea en la corteza cerebral, incluyendo estudios comparativos funcionales, estudios de mecanismos que generan esta actividad y la evaluación de alteraciones en un modelo de discapacidad mental. La principal técnica que se ha usado es el registro electrofisiológico de señales de Potencial de Campo Local (LFP), el cual se ha usado en combinación con otras técnicas, y que responde principalmente a la actividad de una población local de neuronas. Este tipo de registros se ha obtenido tanto en rodajas de cerebro como in vivo. Además, se han obtenido registros de neurona única, que evalúan sus propiedades de disparo, que fueron obtenidas al mismo tiempo que registros de LFP. En el primer estudio, nuestro objetivo fue entender el rol de la corriente persistente de sodio en el control de la actividad oscilatoria, tanto en la generación y mantenimiento de estados UP en oscilaciones lentas como el control de las oscilaciones rápidas beta-gamma. Aquí, vimos que el bloqueo de esta corriente con fenitoína provocaba el alargamiento de los estados UP e incrementaba la tasa de disparo de la red durante los mismos, a la vez que evitaba la generación de nuevos estados UP. En otro estudio, llevamos a cabo una comparación de la actividad oscilatoria espontánea en diferentes áreas de la corteza in vivo. Vimos que la corteza prefrontal presentaba características distintas comparadas con áreas primarias, incluyendo mayor tasa de disparo de la red, frecuencias gamma aumentadas, una variabilidad menor de las duraciones de los estados UP y patrones de disparo de las neuronas distintos. Este estudio también incluye un análisis de los patrones de propagación de las ondas lentas en la corteza. Finalmente, hicimos un estudio de las alteraciones funcionales y anatómicas en la red cortical que subyacen los déficits cognitivos en un modelo transgénico de síndrome de Down, el ratón TgDyrk1A. Este trabajo se llevó a cabo en dos áreas corticales: prefrontal y somatosensorial primaria. En el estudio en la corteza prefrontal, los ratones transgénicos presentaron alteraciones en la actividad oscilatoria que eran compatibles con una mayor inhibición de la red. Este desbalance entre excitación e inhibición fue demostrado posteriormente a nivel anatómico, y explicaría los hallazgos de alteraciones de comportamiento en tareas cognitivas que requieren de la corteza prefrontal, como el puzzle box. En el estudio de la corteza somatosensorial, el análisis de potenciales evocados talamocorticales mostró un aumento de inhibición cortical. A pesar de ello, la actividad oscilatoria no se vio alterada, sugiriendo la existencia de mecanismos compensatorios. Todos estos fenómenos estudiados en esta Tesis se pueden entender en el marco de alteraciones en el balance excitación-inhibición de la corteza cerebral.

Estudios de correlación clínico-patológica y de neuroimagen de amiloide beta in vivo han mostrado que algunos individuos no sufren demencia a pesar de tener abundantes depósitos de amiloide beta y tau. La caracterización del fenotipo neuropatológico de estos casos únicos ayudaría a demostrar si existe una resiliencia a la enfermedad de Alzheimer. En este estudio hemos realizado el análisis postmortem más exhaustivo hecho hasta ahora de los casos que presentan discordancia entre los datos neuropatológicos y clínicos. Hemos reunido 90 muestras de cerebro humano que incluían 33 sujetos potencialmente resilientes—individuos cuyos cerebros al fallecer presentaban abundante patología de la enfermedad de Alzheimer pero que nunca desarrollaron síntomas de enfermedad en vida— y hemos estudiado dos áreas anatómicas de interés desde el punto de vista patológico y bioquímico: el surco temporal superior y la corteza entorrinal. En apoyo a la hipótesis de la resiliencia, hemos confirmado que hay individuos con una carga de amiloide y tau similar a la de sujetos dementes pero que no desarrollan demencia. Marcadores específicos de resiliencia son: preservación del número de neuronas y de la morfología axonal, menor carga de placas densas y oligoméricas de amiloide beta, menor acúmulo de especies solubles de tau hiperfosforilado en la sinapsis y, por último, menor número de astrocitos reactivos y de células microgliales activadas que secretan un perfil de citoquinas único que podría ser neuroprotector. El descubrimiento más importante en esta cohorte es que los oligómeros sinápticos de tau hiperfosforilado y la respuesta inflamatoria predicen la demencia con más fiabilidad que las placas de Aβ y los ovillos neurofibrilares. Definir los marcadores de resiliencia es muy importante en el contexto actual en el que los ensayos clínicos han fracasado reiteradamente. Gracias a la neuroimagen de amiloide beta y tau ya es posible la detección de las lesiones de la enfermedad de Alzheimer in vivo incluso en la fase preclínica. Debemos ser capaces de predecir con certeza la evolución clínica de sujetos asintomáticos a largo plazo para identificar quiénes podrían beneficiarse de un tratamiento preventivo secundario. En resumen, la detección de los marcadores de resiliencia puede ayudar a predecir si un individuo va a desarrollar una demencia o va a permanecer sin síntomas, cuantificar efectos terapéuticos y encontrar nuevas dianas neuroprotectoras. / Clinico-pathological correlations and tomography imaging of amyloid beta with positron emission imaging have shown that some individuals tolerate substantial amounts of Alzheimer’s pathology in their brains without experiencing dementia. The characterizacion of the neuropathological phenotype of these unique cases is necessary to demonstrate the existence of resilience to Alzheimer’s pathology. In this study we have carried the most exhaustive postmortem analysis of mismatched subjects. Detailed histopathological and biochemical assessments were conducted in the superior temporal sulcus and enthorinal cortex of 90 brains, including 33 from non-demented individuals at the time of death but whose post-mortem examination demonstrated significant amounts of Alzheimer’s changes, hence indicating that they are potentially resilient. Our results confirm that some individuals can accumulate equivalent loads of amyloid- plaques and tangles to those found in demented Alzheimer’s cases without experiencing dementia thus supporting the existence of resiliency to Alzheimer’s disease. Resilient cases exhibited the following markers: preservation of neuron numbers and axonal geometry, lower burdens of fibrillar thioflavin-S positive plaques and oligomeric amyloid- deposits, and fewer reactive astrocytes and activated microglial cells secreting a unique perhaps neuroprotective cytokine profile. The most important discovery in this cohort is that synaptic hyperphosphorylated tau oligomers and the inflammatory response predict dementia more reliably than amyloid beta plaques and neurofibrillary tangles. Resilience marker identification is very important at the present time because clinical trials have repeatedly failed. Neuroimaging of amyloid beta amyloid and tau allows us to detect lesions of Alzheimer's disease even in the preclinical phase. We need to accurately predict the clinical course of long-term asymptomatic subjects to identify those who would benefit from preventive secondary treatment. In summary, the detection of markers of resilience can contribute to predict whether an individual will develop dementia or will remain without symptoms, quantify therapeutic neuroprotective effects and find new therapeutics targets for Alzheimer’s disease.