Los nucleótidos cíclicos, AMPc y GMPc, están considerados segundos mensajeros que participan en la transducción de las vías de señalización intracelular, contribuyendo de esta manera en una gran variedad de procesos celulares. Los niveles del AMPc están regulados por la adenilato ciclasa y los del GMPc por la guanilato ciclasa a nivel de su síntesis, y para ambos por las fosfodiesterasas, a nivel de su degradación. Entre la gran variedad de procesos fisiológicos en los que están involucrados, se ha demostrado su participación en reacciones inflamatorias. Niveles elevados de ambos nucleótidos cíclicos desencadenan respuestas antiiflamatorias y/o neuroprotectoras, por lo tanto, es de esperar que la regulación de los enzimas involucrados en su degradación, las fosfodiesterasas, influya indirectamente en estos procesos.En este trabajo determinamos la expresión de los ARNm de fosfodiesterasas específicas de AMPc, como las variantes de splicing de la PDE4B y el isoenzima de la PDE7, la PDE7B, en cerebros controles de ratas para posteriormente determinar su regulación en cerebros de modelos animales con componente inflamatorio (LPS y EAE). Por otro lado estudiamos la expresíón de los ARNm de la PDE2 y de la PDE9, fosfodiesterasas que son capaces de hidolizar el GMPc, en cerebros postmortem de humanos control, y comparamos su expresión con cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer.La distribución de los ARNm de las cuatro variantes de splicing de la PDE4B en el cerebro de la rata presenta estructuras en común, como el núcleo anterior olfatorio, o la corteza piriforme. Sin embargo existen regiones en las que no encontramos todas isoformas como en el área postrema, donde no se expresa la PDE4B4, en diversos tractos de materia blanca, que hibrida intensamente con el oligonucleótido para la PDE4B3 y no presenta señal para la PDE4B1, o en el giro dentado del hipocampo, donde sólo se expresa la PDE4B2. Su estudio en los modelos animales utilizados reveló un aumento exclusivo de la PDE4B2 a las 2 y 3 h después de la administración de la toxina en los plexos coroideos en el modelo animal de inflamación por LPS, y en áreas perivasculares de cerebro en el modelo animal de EAE. La expresión de esta variante de splicing en este último modelo se localizó en algunos linfocitos T y macrófagos/microglía.El ARNm de la PDE7B se localiza a lo largo de todo el cerebro de la rata, siendo más abundante en regiones cerebrales anteriores, especialmente en el tubérculo olfativo, los núcleo caudado-putamen, el giro dentado del hipocampo, algunos núcleos talámicos y las células de Purkinje del cerebelo. En estas áreas se expresa preferentemente en neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas, pero no en colinérgicas. La expresión de los dos isoenzimas de la PDE7, la PDE7A y PDE7B, no presenta cambios en la expresión en áreas perivasculares del cerebro de los animales EAE.Los ARNm de la PDE2 y de la PDE9 en el cerebro humano se localiza en áreas como la corteza cerebral, la formación hipocampal, el claustrum y los núcleos caudado y putamen. Sin embargo en el cerebelo encontramos expresión de la PDE9, pero no de la PDE2, en las células de Purkinje, en la capa granular del cerebelo y en el núcleo dentado. La comparación de su expresión entre cerebros postmortem control y cerebros diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer en las regiones estudiadas (corteza frontal, cerebelo y diferentes regiones del área hipocampal) no mostró diferencias estadísticamente significativas. / "cAMP and cGMP fosfodiesterases in brain: Expression in neuroinflammatory and neurodegenerative processes" cAMP and cGMP are second messengers involved in intracellular signalling pathways, contributing in a variety of cellular processes. Their synthesis is regulated by adenilyl-cyclase and guanilyl-cyclase, and their degradation by phosphodiesterases. High levels of both nucleotides develop antiinfammatory and/or neuroprotective actions, so that, we would expect that the regulation of the enzymes involved in their degradation, phosphodiesterases, will act indirectly in those processes.In this work we determined cAMP specific phosphodiesterase mRNA expression, PDE4B splicing variants and PDE7B isozyme, first, in control rat brain, and then in neuroinflammatory animal model brains (LPS and EAE) in order to determine their regulation. We also studied PDE2 and PDE9 mRNA expression, phosphodiesterases hydrolyzing cGMP, in post-mortem control human brains comparing with Alzheimer disease patient brains.PDE4B splicing variant mRNA distribution in rat brain presents common structures: anterior olfactory nucleus or piriform cortex. However, some regions do not express all PDE4B isoforms. PDE4B4 is not expressed in area postrema; some white fibre tracts do not hybridize for PDE4B1 mRNA, or hippocampal dentate gyrus expresses exclusively PDE4B2 mRNA. Their expression in our animal models showed an exclusive increase for PDE4B2 mRNA levels in choroid plexus after toxin administration in the LPS inflammatory model, and in brain perivascular areas in the EAE animal model, where we found this splicing variant expression in some T cells and some macrophages/microglia.PDE7B mRNA is localized along de whole rat brain, abundantly in anterior brain regions: olfactory tubercle, caudate-putamen nucleus, dentate gyrus of the hipocampus, some thalamic nucleus and Purkinje cells. This isoenzyme is preferently expressed in glutamatergic and GABAergic neurons, but not in cholinergic cells. PDE7 isoenzymes expression does not change in perivascular regions of the EAE animal brains.PDE2 and PDE9 mRNA are localized in human brain regions: cerebral cortex, hipocampal formation, claustrum and caudate and putamen nuclei. However, we find PDE9 mRNA expression, but no PDE2 mRNA expression, in Purkinje cells, in granule cerebellar layer and in dentate nucleus of the cerebellum. When comparing their expression between post-mortem control and Alzheimer disease brains in studied regions we do not find statistically significant differences.

TESI:L'objectiu general del projecte de tesi és estudiar la implicació de la NP1 en el procés de mort neuronal programada i en el dany sinàptic induïts per beta-amiloid en la malaltia d'Alzheimer.Està descrit que l'acumulació de beta-amiloid juga un paper central en la pèrdua progressiva de sinapsis, el dany neurític i la mort neuronal característiques de la malaltia d'Alzheimer. Els mecanismes mitjançant els quals el pèptid beta-amiloid indueix aquesta neurotoxicitat encara romanen desconeguts.Ens basem en la hipòtesi de que les proteïnes del programa de mort cel·lular formen part del mecanisme molecular de neurodegeneració. Així, ens vam centrar a estudiar si la neurotoxicitat de beta-amiloid depèn de l'expressió de NP1, una proteïna implicada en la remodelació de sinapsis excitadores i que s'ha demostrat recentment que participa també en el procés de mort que s'indueix per reducció d'activitat en neurones granulars de cerebel madures (DeGregorio-Rocasolano et al., J.Biol..Chem., 2001, Jan 5;276 (1):796-803; Enguita et al., Mol.Pharm., 2005, 67(4):1237-46).Els resultats obtinguts són que el tratactament amb beta-amiloide de les neurones corticals en cultiu indueix un increment dels nivells de la proteïna NP1 abans de que la mort apoptòtica sigui significativa i que el silenciament de l'expressió de NP1 mitjançant la utilització d'ODNs antisentit i mitjançant ARN d'interferència bloqueja la pèrdua de sinapsis, la reducció del creixement neurític i l'apoptosi induïda pel tractament amb beta-amiloid. Aquestes dades indicarien que la NP1 és necessària per la toxicitat induïda per beta-amiloid. La sobre-expressió del transgen de NP1 induïda per la transducció amb lentivirus reprodueix els efectes tòxics de beta-amiloid. A més, trobem que la NP1 està incrementada en les neurites distròfiques en els cervells de pacients amb la malaltia d'Alzheimer esporàdica d'aparició tardana. Assaigs d' immunohistoquímica doble contra NP1 i la proteïna Tau van mostrar que la NP1 co-localitza amb els dipòsits de Tau en les neurites distròfiques. També observem que la NP1 co-localitza amb SNAP-25 (synaptosomal-associated protein of 25kDa) a la majoria de les neurites distròfiques que es troben al voltant de les plaques d'amiloid. La NP1 també es troba incrementada en els processos neuronals que estan localitzats al voltant dels dipòsits de beta-amiloid en ratolins transgènics APP/PS1 (proteïna precursora amiloidea/presenilina 1 mutants). Aquests resultats confirmen que la NP1 co-localitza amb proteïnes sinàptiques en les neurites distròfiques, y en base a això, ens vàrem preguntar si la NP1 és capaç de regular la sinaptogènesi. Utilitzant els vectors lentivirals per a silenciar l'expressió de NP1 mitjançant ARN d'interferència en les cèl·lules corticals vam veure que la reducció dels nivells de NP1 indueix un increment de sinaptofisina, proteïna pre-sinàptica associada a vesícules, i de PSD-95, proteïna de la densitat post-sinàptica de sinapsis excitadores. Vam voler estudiar el resultat funcional d'aquest increment en el nombre de sinapsis excitadores i per això vam analitzar els nivells de calci intracel·lular. Vam veure que les neurones amb NP1 silenciada presenten unes oscil·lacions majors de la concentració intracel·lular de calci respecte les neurones control, el que indicaria que el silenciamient de NP1 fa que les neurones siguin més excitables. Aquests resultats demostren que la NP1 és un factor clau en la pèrdua sinàptica, el dany neurític i la mort neuronal apoptòtica induïda per beta-amiloid i indiquen que beta-amiloid contribueix a la malaltia d'Alzheimer mitjançant la regulació de l'expressió de NP1 i que la NP1 està implicada en sinaptogènesi.

Esta Tesis Doctoral ha consistido en el estudio de los mecanismos implicados en la comorbilidad entre el abuso de drogas y los trastornos de ansiedad, así como en las regiones cerebrales responsables de la coexistencia de estos dos trastornos en modelos transgénicos. Nos hemos centrado en dos grandes familias de genes, que podrían actuar como interfaz genético en la comorbilidad entre trastornos de ansiedad y de abuso de sustancias: neurotrofinas por su intervención en el neurodesarrollo y en la neuroplasticidad, y elementos de sistemas de neurotransmisión concretos como son los receptores nicotínicos, cuya implicación en adicción y ansiedad ha sido previamente demostrada a través de estudios farmacológicos.1) HIPÓTESIS:La comorbilidad entre trastornos de ansiedad y de abuso de sustancias es un hecho bien establecido y que tiene importantes implicaciones clínicas, terapéuticas y pronósticas. Si bien los mecanismos patogenéticos de cada uno de estos trastornos por separado se conocen relativamente bien, el mecanismo que subyace a la comorbilidad no está bien delimitado. Se ha propuesto la existencia de factores genéticos, neurobiológicos y/o ambientales comunes a ambos trastornos, pero todavía no está claro qué genes podrían estar implicados o ser predisponenentes a esta comorbilidad. Nosotros proponemos que los factores genéticos de susceptibilidad para la patología dual deberían modular componentes de desarrollo, y componentes funcionales, que están implicados en la coexistencia entre ambos trastornos. Por esta razón el trabajo, se centra en genes de dos familias: el receptor de la neurotrofina-3 (NTRK3) y un cluster que contiene los genes de las subunidades, α3, α5, β4 de receptores nicotínicos (CHRNA3/A5/B4). Así, NTRK3 podría participar en el desarrollo y los mecanismos adaptativos a través de su implicación en proliferación, diferenciación y plasticidad neuronal, mientras que el cluster CHRNA3/A5/B4 podría estar implicado en la activación de circuitos neuronales específicos que podrían ser comunes a ambos trastornos.2) OBJETIVOS:El objetivo general de esta tesis ha consistido en el estudio de la posible implicación funcional de los genes objeto de estudio en elementos de la comorbilidad entre trastornos de ansiedad y abuso de sustancias mediante el uso de ratones transgénicos como modelo de aproximación experimental. Para ello hemos caracterizado el impacto de la sobreexpresión in vivo de los genes NTRK3 y CHRNA3/A5/B4 sobre el fenotipo conductual, neuromorfológico y neurofisiológico.Dado que intentamos comprender los mecanismos implicados en la comorbilidad entre el abuso de drogas y los trastornos de ansiedad, pero también delimitar las regiones cerebrales responsables de la co-ocurrencia de estos dos trastornos se han realizado estudios conductuales, farmacológicos con drogas de abuso como morfina o nicotina, y experimentos de caracterización histológica y molecular.3) CONCLUSIONES:Como conclusión general, los resultados obtenidos demuestran que alteraciones en los niveles de expresión de genes tan diferentes como los factores neurotróficos o los receptores nicotínicos, pueden modificar la actividad de regiones cerebrales implicadas en la aparición simultánea de diferentes trastornos psiquiátricos. De nuestros experimentos se desprende que el sistema mesocorticolímbico, junto con regiones troncoencefálicas como el LC, jugaría un papel clave en la comorbilidad de trastornos como la ansiedad, la adicción o la epilepsia. Un mecanismo de convergencia podría depender de los cambios en receptores glutamatérgicos, que son elementos clave en la plasticidad neuronal. Nuestros resultados apoyan la naturaleza poligénica de la patología dual y sugieren que los cambios de dosis de determinados genes podrían ejercer un papel esencial en la morbilidad de la misma. / This Doctoral Thesis has been focused on understanding the mechanisms and the cerebral regions implicated in the commorbidity between drug abuse and anxiety disorders. To this aim we have focused on two families of genes that may act as genetic interface to the commorbidity between these neuropsychiatric disorders: 1/ neurotrophins, that may interfere in neurodevelopment and neuroplasticity, and 2/ elements of specific neurotransmitter systems such as nicotinic receptors, that have been implicated in addiction and anxiety, previously demonstrated by pharmacological studies. Our hypothesis proposes the existence of a development component and a functional component in the generation of an addictive and anxious brain. To this study we used two mouse models: 1/ A transgenic mouse model overexpressing the neurotrophin-3 receptor, TrkC (TgNTRK3), since it has been implicated in plasticity, proliferation and cellular differentiation with a possible pathogenetic intervention in the dual pathology, such as the noradrenergic system, and 2/ A transgenic mouse model overexpressing the α3, α5, β4 nicotinic receptor subunits (TgCHRNA3/A5/B4), candidates to the development of psychiatric disorders and addiction. To determine the gene overexpression effects on the appearance of this dual pathology we have performed pharmacological studies using drug abuse, such as nicotine and morphine. The results obtained suggest that alterations in the expression levels of these genes could be modifying the activity of different cerebral regions responsible for the commorbidity between both disorders in transgenic mouse models. Thus, our experiments suggest that the mesocorticolimbic system, as well brainstem regions, such as the Locus coeruleus, would play a key role in the commorbidity between anxiety and addiction. That could be due to alterations on glutamatergic receptors, key elements in neuronal plasticity.

La relación entre la CPFm y los núcleos del ATV y RD forma parte de la fisiopatología de muchos trastornos psiquiatricos. En este trabajo se han encontrado una importante proporción de neuronas de CPF que bifurcan sus axones proyectando tanto al ATV como al RD. Las estrategias experimentales utilizadas incluyeron utilizando técnicas de electrofisiología y de trazado de vías. Con respecto a las primeras, se estimuló secuencialmente el RD y el ATV, registrándose los correspondientes potenciales antidrómicos en neuronas de CPFm. Las latencias obtenidas desde el ATV fueron de 7.9 ± 0.7 ms con una velocidad de propagación del potencial estimada en 1.76± 0.14 (n=35, ATV) y en el caso del RD las latencias fueron de 13.7 ± 0.8 con una velocidad estimada de 1.11± 0.06m/s (n=31, RD). Se registraron potenciales antidrómicos desde ambas áreas en un 60% de las neuronas piramidales registradas. Un 78% de las neuronas que proyectan al RD también proyectan al ATV y un 72% de las que proyectan al ATV también proyectan al RD. Los estudios histológicos muestran que las neuronas piramidales de la CPFm captaron ambos trazadores cuando estos fueron inyectados por separado en el ATV y el RD. La proporción de neuronas doblemente marcadas fue similar al observado por electrofisiología (ATV 81±18; RD 52±9; dobles 31±4; n = 5 ratas) confirmando los resultados obtenidos mediante esta técnica. Además, se combinaron técnicas de inmuhistoquímica con técnicas de hibridación in situ con oligonucleótidos de ADN, siendo uno de los primeros trabajos conocidos por nosotros donde se hayan podido combinar ambas técnicas. Se determino que una gran proporción de las neuronas de proyección a los núcleos aminérgicos del ATV y el RD contenían el mensajero del receptor 5-HT2A. En el caso del ATV se observó que los porcentajes para la CPFm oscilaban entre el 43 y el 60% con una media de 52 ± 5% mientras que para la OFC se encontraron proporciones de 45% y 71% en dos de las ratas inyectadas. En el caso del RD se obtuvieron resultado similares. Para la CPFm la proporción de neuronas de proyección que expresaban el 5-HT2A fue de entre 60% y 67% para la corteza derecha y de entre 59% y 71% para la corteza izquierda. Además se encontraron una gran cantidad de neuronas de proyección en el OFC que también expresaban el mensajero del receptor 5-HT2A 64% a 75% en la corteza derecha y en la izquierda (73% a 81%). Otro punto estudiado en esta tesis fue la distribución de subunidades del receptor AMPA en el ATV y el RD. No se observó una distribución homogénea del receptor GluR1 en estos núcleos aminérgicos. En el RD este receptor fue hallado en células GABAérgicas pero no células serotoninérgicas. Se evaluó también su posible presencia en células dopaminérgicas encontrándose un nivel de marcaje muy tenue muy inferior al observado para el mismo tipo celular en el ATV a pesar de haberse realizado los experimentos en simultaneo. Un punto importante a aclarar es que se encontraron células GluR1 positivas en el RD que no eran GABAérgicas. Al realizarse la inmunohistoquímica del receptor GluR2 se observo que este si estaba presente en neuronas serotoninérgicas. También se evaluó la presencia presináptica de ambos recetores en fibras serotoninérgicas y del GluR1 en fibras dopaminérgicas. En la CPFm no se encontró la presencia de ninguna de estas subunidades a nivel presináptico en los axones estudiados.Estos resultados aportan datos morfológicos que ayudan a la comprensión del mecanismo de acción de los antipsicóticos en general y de los atípicos en particular.

La sintomatología esquizofrénica es múltiple y variada. En general, los síntomas se dividen en positivos o psicóticos (alucinaciones, pensamiento aberrante), negativos (falta de motivación, aislamiento social, depresión) y déficits cognitivos (problemas de atención y aprendizaje, de la memoria operativa). En el estudio de esta enfermedad se utilizan modelos farmacológicos como es el de los antagonistas del receptor NMDA. Estos compuestos, la ketamina, PCP y MK-801, provocan los tres tipos de síntomas en individuos sanos y los exacerban en pacientes de esquizofrenia. Administrados a animales de experimentación, provocan alteraciones del comportamiento así como de la neurotransmisión en la corteza prefrontal. Estos efectos pueden ser revertidos mediante la administración de fármacos antipsicóticos. En la presente tesis doctoral hemos estudiado las consecuencias de la administración de los antagonistas NMDA sobre la neurotransmisión serotonérgica y glutamatérgica en la corteza prefrontal, así como las posibles regiones del cerebro donde pueden estar actuando estos compuestos. Los resultados obtenidos muestran que la administración sistémica del antagonista NMDA, MK-801, provoca un incremento de la concentración extracelular de serotonina y glutamato en la corteza prefrontal, efecto que no se reproduce con su perfusión unilateral intracortical. Debido a esta falta de efecto local, se perfundió MK-801 en las posibles zonas candidatas donde podría estar actuando. Las principales entradas excitatorias a la corteza prefrontal provienen de la corteza prefrontal contralateral y, a nivel subcortical, del núcleo medio dorsal del tálamo y el hipocampo ventral. Mientras que la administración de MK-801 en el hipocampo, así como en el núcleo reticular o el pálido ventral (núcleos que ejercen el control inhibitorio sobre el tálamo en rata) no produjo ningún cambio en los niveles corticales de serotonina, la perfusión de MK-801 de forma bilateral en la corteza prefrontal izquierda y derecha sí aumentó la concentración de serotonina cortical. La perfusión unilateral de TTX en la corteza izquierda fue capaz de bloquear el incremento de serotonina en la corteza derecha tras la administración sistémica de MK-801, sugiriendo que, efectivamente, hace falta una acción bilateral para que el MK-801 provoque sus alteraciones sobre la neurotransmisión serotonérgica cortical. En este trabajo hemos estudiado también el mecanismo de acción de los fármacos antipsicóticos: el papel que tiene la corteza prefrontal en sus efectos y los principales receptores a través de los cuales actúan para revertir las alteraciones de los antagonistas NMDA. Comprobamos que, mientras que tanto los antipsicóticos clásicos como los atípicos fueron capaces de bloquear el incremento de glutamato cortical, solo los antipsicóticos atípicos fueron capaces de bloquear el incremento de serotonina tras la administración de MK-801. Esta capacidad se observó tanto con la administración sistémica de los fármacos como con su administración local, hecho que sugiere que los antipsicóticos están realizando parte de su acción de forma local en la corteza prefrontal. Con el fin de estudiar el mecanismo de acción de estos fármacos, se perfundieron compuestos específicos para los principales receptores a través de los cuales podrían estar actuando los antipsicóticos. Los resultados mostraron que, mientras que los compuestos que actuaban sobre los receptores dopaminérgicos no fueron capaces de bloquear el incremento de serotonina cortical (aunque sí el de glutamato) producido por el MK-801, los que actuaban en los receptores serotonérgicos o adrenérgico sí que fueron capaces de bloquear tanto el aumento de serotonina como de glutamato. Los resultados aquí presentados muestran la importancia de la corteza prefrontal en este modelo de esquizofrenia y en el tratamiento de la enfermedad, intentando así desvelar parte del sustrato anatómico de esta compleja patología. / NMDA antagonists are used as a pharmacological model of schizophrenia because their administration to healthy individuals evokes psychotic and negative-cognitive symptoms. In experimental animals, the systemic administration of NMDA antagonists increases the extracellular concentration of dopamine, serotonin (5-HT) and glutamate in the medial prefrontal cortex (mPFC). In the present work, we have studied the effects of NMDA antagonists on the cortical transmission of serotonin and glutamate. The results show that the systemic administration of MK-801 increases mPFC levels of 5-HT and glutamate, alterations not reproduced after the unilateral perfusion of the drug in the mPFC. We then studied the brain regions where MK-801 could be exerting its actions, i.e. the hippocampus, the thalamus and the contralateral mPFC. The perfusion of MK-801 in the hippocampus, the ventral pallidum or the reticular nucleus (the latter areas are responsible for the inhibitory control of the thalamus) did not alter mPFC 5-HT. However, the bilateral perfusion of MK-801 in both mPFC (left and right) elicited an increase in 5-HT levels. The unilateral perfusion of TTX through the left probe was able to block the increase of serotonin in the right mPFC caused by the systemic administration of MK-801, thus suggesting that a bilateral perfusion is needed to induce the alterations on 5-HT neurotransmission. We also studied the mechanism of action of antipsychotic drugs. While both classical and atypical antipsychotics were able to block the MK-801-induced increase in glutamate levels, only the atypical antipsychotics were able to block cortical 5-HT. The local perfusion of antipsychotics reproduce the same effects than their systemic administration, which suggests that part of their actions are done locally in the mPFC. We also show that compounds that act on dopaminergic receptors where able to block the increase of cortical glutamate but not that of 5-HT following systemic MK-801. In contrast, compounds that act over the serotonergic or adrenergic receptors were able to block both the 5-HT and glutamate increases. The present results underscore the importance of the mPFC in this model of schizophrenia and in the pharmacological treatment of the illness.

La present tesi estudia el paper de la glucosa en la mort cel·lular i la resposta a hipòxia en un model d'isquèmia in vitro amb cèl·lules de la línia cel·lular derivada de neuroblastoma humà SH-SY5Y diferenciades amb àcid retinoic, que es sotmeten a un període d'anòxia en presència o absència de glucosa i un de posterior reoxigenació també en presència o absència de glucosa, afegint la glucosa en la reoxigenació.La privació exclusiva d'oxigen (OD, de l'anglès oxygen-deprivation) indueix una baixa mortalitat, que no s'altera després de la reoxigenació; no obstant la privació d'oxigen i glucosa (OGD, de l'anglès oxygen and glucose deprivation) indueix major mortalitat, que s'incrementa durant la reoxigenació posterior, essent significativament més elevada quan s'afegeix glucosa en la reoxigenació. L'OGD indueix l'alliberament de factors pro-apoptòtics mitocondrials com AIF (de l'anglès apoptosis inducing factor) i citocrom c, no obstant només quan la reoxigenació és en presència de glucosa en la reoxigenació s'observa l'activació de caspases. La seva inhibició indueix la reducció de la mortalitat associada a l'apoptosi. També en cultius primaris neuronals sotmesos a 1h d'OGD s'observa l'activació de caspasa 3. Els nivells energètics cel·lulars disminueixen dràsticament en acabar la OGD, no obstant es recuperen progressivament en la reoxigenació posterior, essent significativa la diferència causada per la presència de la glucosa en la reoxigenació. Pensem que aquest fet pot ser el condicionant per a l'activació diferencial de les caspases tot i l'alliberament comú de factors pro-apoptòtics en acabar l'OGD.En aquest model l'anòxia estabilitza l'expressió de la subunitat induïble (subunitat α) del factor de transcripció HIF1 (de l'anglès Hypoxia inducible factor 1). La presència de glucosa durant l'anòxia indueix una major expressió de HIF1α i per tant una major activitat de HIF1, reflectida en una major expressió de gens diana com enzims del metabolisme de la glucosa i VEGF (Vascular Endotelial Growth Factor). En la reoxigenació posterior a l'OD HIF1α és ràpidament degradat pel sistema de degradació dependent d'oxigen que implica els enzims Prolilhidroxilases (PHDs) i el sistema ubiquitina-proteasoma (que inclou la proteïna Von Hippel Lindau (pVHL)). Sorprenentment, l'expressió de HIF1α es manté en presència d'oxigen hores després de la reoxigenació posterior a l'OGD. Aquest és un fenomen que depèn de la severitat i la durada de l'anòxia i no sembla estar relacionat amb alteracions del proteasoma o de pVHL, sinó amb una menor hidroxilació de HIF1α per PHDs. La OGD indueix un desequilibri en les concentracions de metabòlits del cicle de Krebs com alfacetoglutarat i fumarat. Ja que el primer es coneix com a cosubstrat de les PHDs i alguns estudis apunten que el segon pot funcionar com a inhibidor de la reacció i donat que hem observat que l'addició de fumarat indueix l'expressió de HIF1α en normòxia en les cèl·lules SH-SY5Y diferenciades, pensem que l'abundància relativa dels metabòlits en acabar la OGD és menys favorable per a la hidroxilació de HIF1α i aquest es manté en la reoxigenació tot i la presència d'oxigen. / This thesis is focused on the effects of glucose on cell death and on the cellular response to hypoxia in an in vitro model of ischemia using a neuroblastoma-derived cell line (SH-SY5Y) differentiated with retinoic acid. The model is based on an initial period of anoxia in either the presence or absence of glucose followed by a period of reoxygenation also in the presence or absence of glucose (added at the reoxygenation phase).The anoxic period in the presence of glucose (OD, oxygen-deprivation) induces a very low percentage of cell death, which does not increase after reoxygenation. However, anoxia in the absence of glucose (OGD,oxygen-glucose deprivation) causes a higher percentage of cell death, which increases after reoxygenation specially when glucose is added. OGD induces the release of apoptotic factors from mitochondria such as Apoptosis inducing factor (AIF) and cytochrome c. However, we only observe caspase 3 activation in the presence of glucose after reoxygenation and its inhibition decreases apoptotic cell death. Intracellular ATP levels decrease after OGD but recover after reoxygenation being significantly higher in the presence of glucose at reoxygenation, which we think is related with the differential activation of caspases. We also observe caspase 3 activation after OGD followed by reoxygenation in neuron primary cultures.The HIF1 inducible subunit (HIF1α) stabilizes after anoxia in this model of ischemia, especially in the presence of glucose, where its transcriptional activity correlates with HIF1α expression. After reoxygenation after OD, HIF1α is degraded by the known degradation system which involves prolylhydroxylases (PHDs) and the Ubiquitin-proteasome system (including the Von Hippel Lindau protein, VHLp). Surprisingly, HIF1α is maintained for hours after reoxygenation after OGD, which seems unrelated to alterations of the proteasome or pVHL, but to a lower hydroxylation by PHDs. This is probably related to alterations in the concentrations of metabolites of the Krebs cycle, such as alphaketoglutarate and fumarate, wich are a known cosubstrate of the PHDs reaction and a recently described inhibitor, respectively.

Carotid artery atherosclerosis is a major factor in the pathogenesis of focal cerebral ischemia and accounts for a substantial number of deaths and severe disability. Although the severity of stenosis is associated with the risk of developing ipsilateral ischemic symptoms, it is the neither the sole deteminant of such risks nor the only factor influencing whether the lesions becomes clinically significant. Plaques that are predominantly echolucent on B- mode ultrasonography and that contain a high content of intraplaque hemorrhage are more likely to produce symptoms, whereas those composed primarily of fibrous tissue are echogenic, more stable, and considered to be low-risk lesions.A number of studies have attemped to define the histological features of an unstable carotid plaque that are associated with the onset of ipsilateral cerebral ischemic symptomd. The histological features considered include intraplaque hemorrhage, the age of hemorrhage, the presence or absenceof plaque ulceration, mural thrombus and the amount and type of lipid within the plaque. In contrast, it has been established that macrophage and T- lynfocytes acumulation within the plaque cap is associated with plaque instability and rupture in coronary and aortic lesions. Furthermore, abundant HLA- DR antigen expression by these inflammatory cells indicates that an active inflammatory process is present at these of instability. The aim of this study was to obtain a better understanding of the atherosclerotic at carotid level and their role in ischemic neurologic events.Subjects and methods: From February 1998 to Maig 1999 we microscopically analysed 102 plaques and correlated the pathologic and immunohistochemical aspects to the previous neurologic symptoms. The endarterectomy plaques was systematically set aside for pathological analysis by standard ligth microscopic techniques. The plaques were also stained with monoclonal antimacrophage antibody ( CD 68 ), T- antilymphocytes (CD3 ) and HLA DR.Statistical analysys : Results are expressed as the media; probability values less than 0.05 were considered. For comparison of the clinical and demographic data Chi square, T- Student, Mann Whitney and Pearson tests were used.Results: 52.9 %(54) of patients presented cerebral ischemics events (66.6 % as transient ischemic attacksand 33.3 % as stroke). The 44.1 % of the carotid plaques presented ulceration, 48.8 % recent intraplaque hemorrhage, 8.8 % trombus and the 92.2 % microcalcification. The ulceration and intraplaque hemorrhage (instables plaques) are asociatted with stroke (p<0.001). The ulcerated plaques presented 32.7+/-11.96 macrophages /10 areas, 8.91+/-5.65 T-lymphocytes y 3.82+/-3.89 T- lymphocytes DR +. Recent intraplaque hemorrhage the results are : 27.4+/-15.3, 7.34 +/-5.62 y 2.86 +/- 3.22/ 10 areas. The instables plaques are asociatted with a major number of this cells.(p<0.001).Conclusion: 1.Ulceration plaque and intraplaque haemorrhage (instables plaques) are the patological aspects asociatted with the presence of stroke.2. The macrophages and T- lymphocytes are associated with the presence of this patological aspects. The presence of these inflammatory cells indicates that an active inflammatory process is present at these sites of instability. / La afectación de la arteria carótida interna por la placa de ateroma produce estenosis de la misma con el consiguiente déficit hemodinámico a nivel cerebral; pero además, es una potencial fuente embolígena debido a los fenómenos de disrupción endotelial, hemorragia intraplaca y calcificación de la placa aterosclerótica. Estos dos mecanismos, hemodinámico y embólico, junto con el estado de la circulación intracerebral son los principales determinantes para la aparición de ictus isquémico en el territorio carotídeo. El mayor conocimiento de los factores de riesgo implicados en la patogenia de la aterosclerosis y el estudio de los acontecimientos hemodinámicos y microembólicos que tienen lugar en la afectación de las arterias cerebrales extra e intracraneales han contribuido a una disminución de la incidencia del ictus isquémico en los últimos tiempos. Respecto al mecanismo hemodinámico producido por la estenosis se han llevado a cabos estudios multicéntricos aleatorizados que demuestran el beneficio del tratamiento quirúrgico (tromboendarterectomía carotídea) frente al tratamiento médico (control de factores de riesgo y antiagregantes) para estenosis de la arteria carótida interna superiores al 70 %. Así mismo y según las mismas series, las estenosis inferiores al 30 % se beneficiarían más del tratamiento médico. La mejor opción terapéutica en aquellos casos comprendidos en el rango del 50 % al 70 % sigue siendo tema de debate. El estudio de la placa inestable, es decir, aquella que presenta mayor probabilidad de producir microembolias e ictus ha sido menos prolífico. La determinación de los distintos patrones morfológicos de la placa aterosclerótica y su relación con la presencia o ausencia de ictus, asi como el conocimiento de las alteraciones celulares y metabólicas que tienen lugar durante la formación y evolución de la misma, nos permitirá comprender mejor la historia natural de esta patología. Ello facilitará la elección de la opción terapéutica más racional y adecuada en cada caso, es decir, permitirá un manejo individualizado de cada paciente lo que, sin duda, implica una mejora en la calidad asistencial de uno de los mayores problemas de salud en nuestro medio : el ictus isquémico. Objetivos:1)Establecer la relación entre características morfológicas de la placa carotídea e ictus. 2) Presencia de macrófagos, linfocitos T y linfocitos T activados en la placa y su relación con la morfología de la misma y la presencia de ictus.Material y métodos:1)Recogida de variables epidemiológicas, clínicas y paraclínicas de 102 pacientes con estenosis carotídea > 70 % sometidos a cirugía carotídea en nuestro centro.2)Estudio histopatológico e inmunohistoquímico de la placa carotídea con anticuerpos monoclonales para macrófagos (CD68), linfocitos T (CD3) y linfocitos T activados (HLA-DR).3)Descriptivo de variables con frecuencia, media y desviación estandar. Medida de la asociación mediante Chi cuadrado, t-Student y Mann Withney. Resultados: El 52.9 % de pacientes tenían antecedente de ictus. Las características histológicas fueron: 44.1 % ulceración, 48.8 % hemorragia intraplaca reciente, 31.3 % ambas características, 8.8 % trombo reciente y 92.2 % microcalcificación. La ulceración y la hemorragia intraplaca(placas inestables) se asociaron a ictus (p<0.001). En las placas ulceradas se objetivaron 32.7+/-11.96, macrófagos/10campos, 8.91+/-5.65 linfocitos T y 3.82+/-3.89 linfocitos T activados. En la placas con hemorragia intraplaca reciente los valores fueron: 27.4+/-15.3, 7.34 +/-5.62 y 2.86 +/- 3.22/ 10 campos respectivamente. Las placas inestables se asociaron a mayor número de estos tres tipos celulares (p<0.001).Conclusiones: 1.La ulceración y la hemorragia intraplaca reciente son las dos características morfológicas de la placa carotídea asociadas a presencia de ictus.2. Las células responsables de la inmunidad celular están presentes en mayor número en las placas inestables lo que apoya la hipótesis que relaciona aterosclerosis e inmunidad celular.

Introducción:La valoración funcional de la microcirculación (arteriolas) puede proporcionar una valiosa información referente a la extensión del proceso de arteriolosesclerosis difusa en pacientes con enfermedad de pequeño vaso (microangiopatía cerebral).Objetivo:Evaluar el estado funcional de la microcirculacion cerebral en pacientes con un primer infarto lacunar sintomatico mediante el estudio de la reactividad cerebrovascular por Doppler transcraneal.Material y Métodos:Se realizaron estudios de reactividad cerebrovascular en 46 pacientes con un primer infarto lacunar sintomático y en 46 individuos sanos de similar edad y sexo con los pacientes. El estudio de reactividad cerebrovascular se llevo a cabo mediante la cuantificación del porcentage de incremento en la velocidad media de fluhjo determinada por Doppler transcraneal, tras la administración endovenosa de 15mg/kg de acetazolamida.Resultados:La reactividad cerebrovascular fue significativamente (p<0,001) menor en los pacientes con infartos lacunares (50± 12,7%) en comparación con los controles sanos (65,2±12,4%). El analisis de regresión logistica puso de manifiesto que el sexo masculino (OR 2,3 ; p<0,02) la edad (OR 3,6; p<0,005) y la presencia de infartos lacunares en la resonancia magnética (OR 5,3 ; p<0,001) fueron factores que se asociaban de forma independiente con la reducción de la reactividad cerebrovascular. Se identificó mediante una curva ROC un valor de reactividad cerebrovascular de 55,6% como el punto de corte que mejor discriminaba entre tener o no infartos lacunares en la resonancia magnética (sensibilidad 67%, especificidad 82%) . Además, se pudo observar que la reactividad cerebrovascular fue significativamente (p=0,02) menor en los pacientes con multiples infartos lacunares (46,38±12,6%) en comparación con aquellos que mostraban un infarto lacunar único en la resonancia magnética (54,83±11,58%). Asimismo, se observó una tendencia hacia una correlación negativa entre la reactividad cerebrovascular y el número total de infartos lacunares en la resonancia magnética. Un analisis de regresión logistica identificó el antecedente de hipertensión arterial (OR 7,24; IC 95% 2,95-17,79) y la reactividad cerebrovascular (OR 0,8; IC 95% 0,81-0,93) como factores predictores independientes para presentar un primer infarto lacunar sintomático.Conclusion:La reactividad cerebrovascular determinada por Doppler transcraneal constituye un marcador de riesgo para un primer infarto lacunar sintomático. El estudio de la reactividad cerebrovascular permitiría evaluar la gravedad y extensión del proceso de arterioloesclerosis difusa en pacientes con microangiopatía cerebral. / Background and purpose: Functional assessment of small arteries and arterioles could provide valuable information regarding the extend of diffuse arteriolosclerosis in patients with small-vessel disease. Therefore, we attempted to clarify the role of cerebrovascular reactivity as a risk marker for first-ever symptomatic lacunar infarction.Methods: Forty-six patients with lacunar infarction and 46 sex and age matched controls were prospectively evaluated. Cerebral hemodynamics were studied with transcranial Doppler ultrasonography. Cerebrovascular reactivity was examined by calculating the percent increase in mean flow velocity occurring after 15 mg/Kg acetazolamide administration (Diamox Test).Results : CVR was significantly (p< 0,0001, student's t test) lower in cases (50,0 ± 12,7 %) as compared with controls (65,2 ± 12,4%). A multiple logistic regression analysis identified male sex (OR 2,3, p=0,02), age (OR 3,6, p<0,005) and the presence of LI on MRI (OR 5,3, p<0,001) as significant and independent factors associated with a reduction of CVR. Moreover, a cut-point of 55,6% (sensibility 67%, specificity 82%) was established as threshold value for distinguishing between pathological and normal CVR. CVR was significantly (p=0,02) lower in patients with multiple (46,38 ± 12,6%) than with single (54,83 ± 11,58%) lacunar infarction. In addition, a trend of negative correlation was found between CVR and the number of LI (r= - 0,26, p=0,08). In the multiple logistic model, history of hypertension ( OR 7,24; 95%IC 2,95- 17,79) and CVR (OR 0,8; 95%IC 0,81-0,93) emerge as significant and independent predictors of first-ever LI.Conclusion: These data suggest that impaired cerebrovascular reactivity is a predictor of first-ever lacunar infarction.

El ictus cardioembólico o embolia cerebral de origen cardíaco es la oclusión de una arteria cerebral por un émbolo procedente del corazón. Con frecuencia origina infartos cerebrales de tamaño importante, presenta elevadas tasas de recanalización espontánea y se asocia con transformación hemorrágica. Todo ello, lo convierte en el subtipo de ictus humano más parecido al de los modelos animales de isquemia focal transitoria/permanente.Las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) son una familia de enzimas proteolíticas (Zn-dependientes) que se encargan del remodelado de la matriz extracelular (MEC) y que en conjunto pueden degradar todos los constituyentes de la misma. Entre las MMPs, la gelatinasa A (MMP-2) y la gelatinasa B (MMP-9), que serán objeto de nuestro estudio, son capaces de digerir la lámina basal endotelial, que juega un papel fundamental en el mantenimiento de la barrera hematoencefálica.En estudios de isquemia cerebral animal se ha demostrado el papel deletéreo de estas gelatinasas y cómo su bloqueo farmacológico o las cepas knock out de MMP-9 muestran infartos cerebrales de menor tamaño.Sin embargo no existen estudios "in vivo" en el ser humano que hayan analizado la expresión de estas moléculas en el ictus isquémico.Por ello nuestros objetivos son determinar el perfil temporal de la expresión de MMPs durante la fase aguda del ictus y relacionar los niveles plasmáticos de estas moléculas con la situación neurológica de los pacientes, con su evolución clínica, con la duración de la oclusión arterial y tamaño final de infarto asicomo con la aparición de transformación hemorrágica en el seno del mismo. Estudiaremos también la relación de estas moléculas con otras marcadores neuroinflamatorios.Los resultados más relevantes de estos estudios son:1.- Hemos descrito por primera vez una sobreexpresión de MMP-9 en la fase aguda del ictus isquémico en humanos. 2.- Los niveles de MMP-2 son máximos en el momento basal y los de MMP-9 alcanzan su pico a las 24 horas.3.- Existe una correlación estrecha entre la expresión de MMP-9 y la situación neurológica del paciente en la fase aguda. Niveles elevados de MMP-9 y MMP-2 se asocian con deterioro neurológico.4.- La duración de la oclusión arterial y su localización influyen en la expresión de MMPs. Los pacientes con oclusiones proximales de la ACM durante todo el periodo del estudio son los que tienen niveles más elevados de MMPs.5.- Además, la expresión de MMP-9 se correlaciona con el tamaño del infarto cerebral medido en la Tomografía Computarizada craneal.6.- Las MMPs están implicadas en el desarrollo de transformación hemorrágica tras el ictus cardioembólico. Los niveles basales de MMP-9 influyen en la aparición de un infarto hemorrágico en fase tardía. Su pico a las 24 horas se asocia con la presencia de un hematoma parenquimatoso.7.- Existen una relación estrecha entre la expresión de MMPs y la de citocinas proinflamatorias como la IL-6, tras la isquemia cerebral.Estos resultados son especialmente útiles ya que permitirán abrir nuevas vías terapéuticas en la patología cerebral isquémica. En la actualidad se ha aprobado el uso de t-PA en el tratamiento del ictus isquémico de <3 horas de evolución, por lo que este tipo de pacientes comenzarán a ser tratados con fármacos trombolíticos, que mejoran el pronóstico clínico del paciente recanalizando la arteria cerebral ocluida pero que tienen como principal efecto adverso la aparición de complicaciones hemorrágicas que a nivel cerebral conducen en muchas ocasiones a la muerte del paciente. Será relevante saber si los niveles de MMPs predicen estas complicaciones hemorrágicas y ayudan a mejorar la seguridad de dichos tratamientos trombolíticos. / Cardioembolic stroke is due to the occlusion of a brain artery by an offending clot proceding from the heart. Usually, large cerebral infarctions with high rates of spontaneous recanalization and hemorrhagic transformations are observed in this subtype of ischemic stroke. Therefore, these patients are quite similar to the animal models of focal transient or permanent cerebral ischemia in which neuroinflammation has been studied. Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of zinc-binding proteolytic enzymes that normally remodel the extracellular matrix (ECM) and pathologically attack substrates as part of the neuroinflammatory response. MMP-2 (72-kDa, Gelatinase A) and MMP-9 (92-kDa, Gelatinase B) specifically attack type IV collagen, laminin and fibronectin, which are the major components of the basal lamina around cerebral blood vessels. MMPs participate in many physiologic tissue remodeling processes, including embryologic and bone remodeling, wound healing, angiogenesis, ovulation, and implantation. However, uncontrolled expression of MMPs can result in tissue destruction and inflammation. Recently, abnormal MMPs activity has been implicated in cerebral ischemia. In animal models, MMP-2 and MMP-9 expression has been shown to increase early after ischemic onset. Treatment with MMPs inhibitors and MMPs-neutralizing antibodies has also been shown to reduce both vasogenic edema formation and infarct size in a rat model of focal cerebral ischemia. In addition, reduced ischemic lesion volumes have been observed in MMP-9 knockout mice as compared with wild-type littermates. These studies suggest that the MMP family participates in the pathophysiology of cerebral ischemia. As this hypothesis has not been tested for humans in vivo, we aimed to determine the temporal profile of MMP expression in patients with acute ischemic stroke and to investigate its relationship with stroke severity, location of arterial occlusion and total infarct volume. We also evaluated the relationship of MMPs with other neuroinflammatory markers.The main results of these studies are:1.- We have described for the first time an over expression of MMP-9 in the acute phase of human ischemic stroke.2.- MMP-2 levels are higher in the baseline measurement. Peak levels of MMP-9 were found at the 24-hour determination.3.- Stroke severity was correlated to MMP-9 levels at different time points after symptom onset. An association between MMP-9-MMP-2 levels and neurological deterioration was found. 4.- MMP expression was related to the time and location of MCA occlusion. Patients with a proximal MCA occlusion during the complete study period have the highest MMPs level. 5.- In addition, a positive correlation between mean MMP-9 and total infarct volume measured by means of CT scan was found.6.- MMPs have shown to be involved in some subtypes of hemorrhagic transformation after human cardioembolic stroke. Baseline MMP-9 level predicts late-hemorrhagic infarctions and a 24h-peak precedes early-parenchymal hemorrhages. 7.- MMP expression correlates with the inflammatory cascade activation after acute cardioembolic stroke. From all measured timepoints, the best correlation was that of MMP-9 with IL-6 at 24 hours.These findings suggest a deleterious role for MMP-9 in the development of brain damage after human ischemic stroke and raise the possibility to modulate this molecule in a therapeutic manner. Because hemorrhagic infarction and hematoma are feared events that may follow ischemic stroke and thrombolytic agents that are beneficial for acute stroke treatment are increasingly used after approval even though increase the risk of hemorrhagic transformation, it is critical to identify the underlying mechanisms of this complication, to make tPA a safer stroke therapy.

Introducción:La aterosclerosis intracraneal de gran vaso causa aproximadamente un 8% de los ictus isquémicos en pacientes de raza caucásica, y la estenosis intracraneal es la lesión vascular más frecuentemente hallada en pacientes asiáticos con ictus isquémico. Los pacientes con aterosclerosis intracraneal sintomática tienen un riesgo elevado de recurrencia clínica y muerte vascular. No obstante, los conocimientos para seleccionar los pacientes de mayor riesgo y para fundamentar estrategias efectivas de prevención secundaria son limitados. Esta Tesis se centrará en dos procesos que pueden tener impacto pronóstico en aterosclerosis intracraneal. Primero, la progresión de las estenosis intracraneales sintomáticas. Segundo, el papel de la inflamación, estudiado a través de la proteína C reactiva de alta sensibilidad (hs-CRP).Objetivos:1) Evaluar la relación entre la progresión de las estenosis sintomáticas de la arteria cerebral media (ACM) y el riesgo de recurrencia clínica. 2) Determinar los factores asociados con la progresión de las estenosis sintomáticas de la ACM. 3) Investigar la relación entre la concentración de hs-CRP y el riesgo de presentar nuevos episodios isquémicos en pacientes con aterosclerosis intracraneal de gran vaso tras su primer ictus isquémico. Métodos:Criterios de inclusión: pacientes consecutivos con un primer ictus isquémico en los que se detectan estenosis intracraneales por Doppler transcraneal (DTC), confirmadas mediante Angiografía por Resonancia Magnética o Tomografía Computerizada. Criterios de exclusión: coexistencia de otras causas potenciales de ictus, estenosis intracraneales no ateroscleróticas, enfermedades inflamatorias, neoplasias, muerte o grave discapacidad por el ictus. En el primer trabajo, se seleccionó a 40 de 140 pacientes con estenosis sintomática de la ACM, a los que se siguió clínica y sonográficamente. Se definió progresión de las estenosis de la ACM como un incremento superior a 30 cm/seg en la velocidad media máxima registrada por DTC. En el segundo trabajo, se incluyó a 71 de 127 pacientes con un primer ictus isquémico y estenosis intracraneales. La concentración de hs-CRP se determinó un mínimo de tres meses tras el ictus isquémico, y los pacientes fueron seguidos clínicamente durante un año a partir de entonces. Resultados: 1) Progresión de estenosis de ACM: Durante una mediana de seguimiento de 26.5 meses, 13 (32.5%) estenosis de la ACM progresaron. La anticoagulación oral se asoció independientemente a una menor progresión de las estenosis de ACM (OR 7.25, CI 1.1 to 48.1, P=0.019). En 8 (20%) casos se documentó recurrencia ipsilateral, y 13 pacientes presentaron un episodio vascular mayor. La progresión de las estenosis de ACM detectada por DTC se asoció independientemente a la aparición de nuevos episodios isquémicos, ya ipsilaterales a la estenosis (OR 2.89, CI 1.09 to 7.71, P=0.031), ya en cualquier territorio vascular (OR 7.03, CI 1.6 to 30.9, P=0.007).2) Hs-CRP: Trece pacientes (18.3%) padecieron un episodio isquémico: 9 ictus isquémicos, 7 atribuíbles a aterosclerosis intracranial, y 4 infartos de miocardio. Los pacientes en el quintil superior de la distribución de hs-CRP mostraron una mayor OR ajustada para la aparición de nuevos episodios isquémicos comparados con los pacientes del quintil inferior (OR 8.66, CI 1.39 to 53.84, P=0.01). Una concentración de hs-CRP > 1.41 mg/dl se comportó como predictor independiente tanto de nuevos episodios isquémicos en cualquier territorio vascular (HR 7.14, CI 1.77 to 28.73, P=0.005) como de nuevos episodios causados por la aterosclerosis intracraneal (HR 30.67, CI 3.6 to 255.5, P=0.0015). Las curvas de Kaplan Meier mostraron que los pacientes con una concentración basal de hs-CRP > 1.41 mg/dl tuvieron una menor supervivencia libre de nuevos episodios isquémicos (P<0.0001).Conclusiones:1) La progresión de las estenosis sintomáticas de la ACM detectada por DTC predice la recurrencia clínica. 2) El uso de anticoagulantes orales se asocia independientemente a una menor progresión de las estenosis sintomáticas de la ACM.3) Una concentración elevada de hs-CRP, determinada un mínimo de tres meses tras el ictus, predice la aparición de nuevos episodios isquémicos en pacientes con aterosclerosis intracraneal de gran vaso tras su primer ictus isquémico. / Background:Intracranial large-artery atherosclerosis is the leading cause of approximately 8% of all ischemic strokes in Caucasians, and represents the most commonly found vascular lesion in Asian ischemic stroke patients. Patients affected by this condition are at high risk of suffering recurrent ischemic events and vascular death. However, scientific evidence to discriminate which patients are at a higher risk and to fundament effective preventive strategies is limited. This Thesis focuses on two processes that may have a relevant prognostic impact on intracranial atherosclerosis. First, the progression of symptomatic intracranial stenosis. Second, the role of inflammation, assessed by the inflammatory marker C-reactive protein, a powerful predictor of future vascular events in other arterial territories.Objectives:1) To evaluate the relationship between the progression of symptomatic middle cerebral artery (MCA) stenosis and the risk of clinical recurrence. 2) To determine which factors are associated with the progression of symptomatic MCA atherosclerotic stenosis. 3) To investigate the relationship between high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) level and the risk of further ischemic events in first ever transient ischemic attack (TIA) or stroke patients with intracranial large-artery atherosclerosis.Methods:Inclusion criteria comprised: consecutive first-ever TIA or ischemic stroke patients with intracranial stenoses detected by transcranial Doppler (TCD) and confirmed by Magnetic Resonance or Computed Tomography Angiography. Exclusion criteria were: coexistence of other potential cause of stroke, nonatherosclerotic causes of intracranial stenosis, inflammatory diseases, malignancies, and stroke-related death or severe disability. In the first work, 40 out of 140 patients with symptomatic MCA stenosis fulfilled all criteria and were clinically and sonographically followed-up. Progression of MCA stenosis was defined as an increase greater than 30 cm/sec in TCD-detected maximum mean blood flow velocity. Logistic regression models were used to identify predictors of MCA stenosis progression and clinical recurrence. In the second work, 71 out of 127 TIA or stroke patients with intracranial stenoses were included. Hs-CRP level was determined a minimum of three months after stroke onset, and patients were clinically followed-up during one year thereafter. Cox-regression models and survival analyses were performed to evaluate the prognostic impact of hs-CRP level.Results: 1) MCA stenosis progression: With a median follow-up of 26.5 months, 13 (32.5%) MCA stenoses progressed. Oral anticoagulation was independently associated with a lower progression rate (OR 7.25, CI 1.1 to 48.1, P=0.019). Ipsilateral recurrence occurred in 8 (20%) cases, and 13 patients had a major vascular event. TCD-detected progression of MCA stenosis was independently associated with the occurrence of a new ipsilateral ischemic event (OR 2.89, CI 1.09 to 7.71, P=0.031) and of any major vascular event (OR 7.03, CI 1.6 to 30.9, P=0.007).2) Hs-CRP: Thirteen patients (18.3%) experienced an end point event: 9 cerebral ischemic events, 7 attributable to intracranial atherosclerosis, and 4 myocardial infarctions. Patients in the highest hs-CRP quintile had a significantly higher adjusted OR for new events compared with those in the first quintile (OR 8.66, CI 1.39 to 53.84, P=0.01). A hs-CRP level > 1.41 mg/dl emerged as an independent predictor of new end point events (HR 7.14, CI 1.77 to 28.73, P=0.005) and of further intracranial atherosclerosis-related ischemic events (HR 30.67, CI 3.6 to 255.5, P=0.0015). Kaplan Meier curves showed that a significantly lower proportion of patients with a hs-CRP > 1.41 mg/dl remained free of a new ischemic event (P<0.0001).Conclusions:1) TCD-detected progression of symptomatic MCA stenosis predicts clinical recurrence. 2) Preventive therapy with oral anticoagulants is independently associated with a lower progression rate of MCA symptomatic stenosis.3) High hs-CRP level predicts further intracranial atherosclerosis-related and any major ischemic events in first-ever TIA or stroke patients with intracranial large-artery atherosclerosis.