Como se ha comprobado, algunas de las investigaciones realizadas en los últimos años consideran la enfermedad ateriosclerótica carotídea como factor independiente asociado a la disfunción cognitiva, considerándose dicha alteración ya presente en estadios sub-clínicos. Varias líneas de investigación ponen de manifiesto la relación existente entre la enfermedad aterosclerótica carotídea, atrofia cerebral y el deterioro cognitivo de tipo vascular, lo que sugiere que puede existir sintomatología mucho más allá de los déficits clínicamente reconocidos (alteraciones visuales, sensoriales, motoras o en el habla). De esta manera se pone de manifiesto el carácter no tan silente de la enfermedad ateriosclerótica carotídea. Hay dos mecanismos que influyen de manera directa: microembolias y los cambios del flujo sanguíneo y que pueden explicar los cambios observados a nivel cognitivo. La intervención o tratamiento de la enfermedad arterioesclerótica carotídea está orientada en primera instancia como tratamiento preventivo de un posible ictus. Sabemos que la endarterectomía carotídea en pacientes con estenosis severa reduce la probabilidad de sufrir un ictus. Por otra parte se ha documentado cómo en este tipo de técnica existe también una afluencia de émbolos a lo largo de la intervención produciendo así lesiones isquémicas silentes. Dado que el stent carotídeo por vía transcervical con inversión de flujo no implica el arco aórtico y la lesión carotídea se atraviesa con la protección cerebral ya establecida, el número de embolias es muy inferior, por lo tanto, la afectación de las funciones cognitivas debería ser nula y puesto que se reestablece el flujo normal en la arteria carótida podría incluso observarse una mejoría en el rendimiento cognitivo. A pesar de ello, no disponemos de estudios suficientemente consistentes indicando cambios cognitivos después del tratamiento quirúrgico carotídeo de aquellos pacientes afectados de esta patología sin haber experimentado previamente un ictus; tampoco contamos con estudios en los que se ponga en evidencia el carácter profiláctico de los tratamientos de revascularización con el objetivo de prevenir un posible deterioro cognitivo en pacientes asintomáticos. Dado el carácter catastrófico y las implicaciones que conlleva el deterioro cognitivo no solo para los individuos que lo padecen sino en general para la sociedad, la identificación y tratamiento de este tipo de condición como es la ateriosclerosis carotídea tendría que ser tomada en cuenta. Es por ello que esta tesis propone analizar las repercusiones cognitivas del stent con flujo invertido transcervical en población con estenosis carotídea superior al 70 % sintomática y asintomática. / Several studies have provided evidence of a close link between atherosclerotic carotid disease, cerebral atrophy and cognitive impairment. Some reports indicate that the symptoms of carotid atherosclerosis are broader than the clinically recognized manifestations of visual, sensory, motor, and language abnormalities associated with transient ischemic attacks and established stroke. Thus becomes clear the association between carotid stenosis and cognition. There are two mechanisms that influence directly: microbleeds and changes in blood flow and may explain the observed cognitive changes. The carotid artery disease treatment is oriented primarily as a possible stroke preventive treatment. We know that carotid endarterectomy in patients with severe carotid stenosis reduces the likelihood of having a stroke. Moreover it has been documented how in this type of technique there is also a high incidence of microbleeds despite the use of distal protection devices producing silent ischemic injury. Transcervical carotid artery stenting with flow reversal does not involve the aortic arch and provide protection against cerebral embolization therefore the effect on cognitive functions should be lower or even be observed an improvement in cognitive performance. However, we do not have sufficiently consistent studies indicating cognitive changes after surgical treatment in patients with these conditions without previous stroke events. Nor have studies bringing out the prophylactic character of carotid revascularization treatments in order to prevent a possible cognitive impairment in asymptomatic patients. Given the catastrophic nature and implications of cognitive impairment not only for individuals who suffer it but for society in general, identification and treatment of conditions such as carotid atherosclerosis should be taken into account. That is why this thesis aims to analyze the cognitive impact of stent with transcervical reversed flow in population with carotid artery stenosis over 70% symptomatic and asymptomatic.

La epilepsia del lóbulo frontal es la segunda más frecuente en la mayoría de las series publicadas, después de la epilepsia temporal. Sus características clínicas y electroencefalográficas son muy variadas, lo que hace de su diagnóstico y tratamiento un reto en la práctica clínica. Las crisis frontales suelen aparecen en “clusters”, con frecuencia generalizan y el aspecto electroencefalográfico de la actividad intercrítica y crítica suele ser difícil de interpretar por la gran difusión que suele acompañar a la actividad paroxística en este tipo de epilepsia. En este trabajo se han estudiado 175 casos con alteraciones intercríticas en el electroencefalograma, realizando un análisis exhaustivo de todos sus aspectos morfológicos. Se ha dividido la muestra en función de tres aspectos morfológicos para estudiar la actividad intercrítica: Su morfología (puntas; ondas agudas simples; ondas agudas difásicas; polipuntas; ondas lentas irregulares), su voltaje (menor de 50 μV, entre 50-100 μV, 100-20 0μV y más de 200 μV) y la actividad que sigue a ésta actividad paroxística. Las ondas agudas tanto simple como difásicas de 50-200 μV fueron el grupo más frecuente en la morfología intercrítica. A continuación, mucho menos frecuentes, las puntas, especialmente de menos de 50 μV. En cuanto a la actividad crítica se han estudiado en detalle sus características morfológicas al inicio de la crisis y sus frecuencias, con el propósito de disponer de una clasificación útil desde el punto de vista electroencefalográfico en el estudio de este tipo de crisis. Morfológicamente el ritmo reclutante fue la característica morfológica más frecuentemente observada al inicio de las crisis, seguida de un ritmo reclutante de baja amplitud. Las crisis registradas fueron cortas, frecuentemente de segundos de duración, comenzando con un ritmo reclutante de 15 Hz de frecuencia media y progresivo enlentecimiento desde el inicio. El enlentecimiento frontal observado en el postcrítico ayudó a localizar el foco. Algunos presentaron clusters de varias crisis en el mismo registro y los cambios en la poligrafía respiratoria y ECG fueron frecuentes durante las crisis frontales registradas. Encontramos que la localización del foco predice la localización del inicio crítico y que el patrón crítico desde un punto morfológico se mantiene a lo largo del tiempo para cada paciente. Una parte fundamental del trabajo se encuentra en el anexo incluido a modo de “atlas”, en el que se exponen alguno de los casos objeto de estudio, detallando observaciones electroencefalográficas de interés. / Frontal lobe epilepsy (FLE) is the second most common type of epilepsy after temporal lobe one. Clinical and electroencephalographic (EEG) features are also very varied, being its diagnose usually a challenge in clinical practice. Frontal lobe seizures appear frequently in cluster, with secondary generalization, and its EEG appearance is usually difficult to determine, due to the widespread the interictal and ictal activity usually achieves. This is an electroencephalographic study, where 175 cases with frontal lobe EEG interictal epileptiform activity have been carefully studied regarding an electroencephalographic point of view, with special emphasis in the morphology of the waveforms. We have divided the sample regarding three different aspect for studying the interictal activity: Its morphology (spike; simple sharp wave; diphasic sharp waves; poly-spikes; irregular slow waves) its voltage (less than 50 μV, 50-100 μV, 100-200 μV and more than 200 μV) and the activity that follows the waveform. The main interictal waveform in our sample was the sharp wave group, both simple and diphasic between 50 to up to 200 μV. Afterwards, much less frequently, the spikes, specially of less than 50 μV. Regarding the ictal activity, some morphologic details at onset are studied with the aim to make available a practical EEG classification for these seizures. Morphologically the synchronized rhythm was the most frequent morphology observed at seizure onset, followed by a low amplitude synchronized rhythm. –recorded seizures were short, frequently of seconds of duration, and they started with a synchronized rhythm of 15 Hz mean frequency, with a progressive slowing after onset. Postictal frontal slowing activity was meaningful, adding value information for locating the focal epileptiform activity. Some patients presented clusters of several seizures within the same recording and changes in breathing polygraphy and EKG were very common during the frontal lobe recorded seizures. We found that the focus location predicts the location of seizure onset, and that the seizure pattern from a morphological point of view remains the same for each patient along time. A major point of interest of this work is included in the graphical appendix, where some interesting EEG features are detailed.

La proteína de adhesión vascular 1 (VAP-1) es una proteína pro-inflamatoria que facilita el reclutamiento leucocitario a través de su actividad amino oxidasa sensible a semicarbazida (SSAO, E.C 1.4.3.21). La SSAO plasmática incrementa en pacientes con infarto cerebral o “stroke” isquémico y hemorrágico, y su actividad predice la aparición de hemorragias después del tratamiento con tPA. Además, la SSAO/VAP-1 se encuentra incrementada en plasma y tejido cerebral de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA). Así pues, creemos que la SSAO/VAP-1 puede contribuir al daño vascular en stroke y EA. Sin embargo, los mecanismos moleculares y su posible contribución al nexo stroke-EA se desconocen. En este trabajo hemos establecido un modelo de isquemia sencillo usando células endoteliales periféricas que expresan la SSAO/VAP-1 humana (HUVEC hSSAO/VAP-1) en condiciones de deprivación de oxígeno y glucosa (OGD). Mediante este modelo encontramos que la expresión de SSAO/VAP-1 incrementa la susceptibilidad de las células endoteliales a la OGD, y la oxidación de sus sustratos aumenta el daño vascular. Las caspasas 3 y 8 se activan durante esta muerte celular. Además, la OGD constituye un estímulo para la liberación de SSAO/VAP-1 soluble. También, una OGD corta induce la unión de leucocitos al endotelio dependiente de SSAO/VAP-1, parcialmente mediada por su actividad enzimática. Para evaluar mejor los efectos beneficiosos de nuevos compuestos inhibidores de la actividad SSAO/VAP-1 en isquemia cerebral generamos una línea celular endotelial cerebral humana que expresa la SSAO/VAP-1 (hCMEC/D3 hSSAO/VAP-1), como modelo de barrera hematoencefálica (BHE), y establecimos también las condiciones óptimas de OGD. Mediante el uso de las células HUVEC y hCMEC/D3 que expresan SSAO/VAP-1 probamos que el DPH-4, un nuevo compuesto multidiana diseñado para la EA, es capaz de proteger ambas células y disminuir la adhesión leucocitaria dependiente de SSAO en OGD con reoxigenación (OGD-Reox). El DPH-4 también fue efectivo contra el daño inducido por OGD-Reox en presencia de beta amiloide, como modelo de patología de EA. Para determinar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos beneficiosos de la simvastatina en el stroke, utilizamos las células hCMEC/D3 que expresan SSAO/VAP-1 en OGD, así como dos modelos animales de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Los resultados revelaron que la simvastatina impide la liberación de SSAO/VAP-1 soluble al plasma o medio de cultivo, la cual induce la expresión de E-selectina y VCAM-1, y amplifica la inflamación y el daño subsiguiente en el cerebro infartado. Finalmente, se estudió del posible papel de la SSAO/VAP-1 en el nexo existente entre el stroke y la EA con las células hCMEC/D3. Resultados preliminares mostraron que en las células que expresan SSAO/VAP-1, la OGD-Reox induce la expresión de BACE1 y la disminución de LRP-1, y que su sustrato es capaz de incrementar los niveles de APP. Además, el metabolismo de la metilamina por la SSAO/VAP-1 induce una muerte celular adicional cuando se co-trata con Aβ1-40D, en OGD-Reox. De estos resultados concluimos que la expresión de SSAO/VAP-1 en endotelio puede incrementar el daño asociado a la OGD, y que la OGD induce la liberación de SSAO/VAP-1 soluble. También, que la oxidación de su sustrato media parte del daño vascular y que la adhesión leucocitaria dependiente de la SSAO/VAP-1 agrava la progresión de la patología aumentando la inflamación en isquemia. La inhibición de SSAO/VAP-1 por el DPH-4 puede aportar un beneficio terapéutico para el retraso y/o prevención del stroke, así como para su progresión a EA. La modulación de los niveles de SSAO/VAP-1 media parte de los efectos beneficiosos de la simvastatina en isquemia cerebral. Además, la presencia de SSAO/VAP-1 en el endotelio cerebral puede facilitar la generación de β-amiloide, incrementando el riesgo y el empeoramiento neurológico de la EA. / Vascular adhesion protein 1 (VAP-1) is a pro-inflammatory protein that mediates leukocyte recruitment through its semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO, E.C 1.4.3.21) activity. Plasmatic SSAO increases in ischemic and in hemorrhagic stroke patients, and its activity predicts the appearance of parenchymal hemorrhages after tPA treatment in ischemic stroke patients. Moreover, SSAO/VAP-1 is also increased in AD patients’ plasma and brain tissue. Hence, we believe that SSAO/VAP-1 could contribute to the vascular damage in both stroke and AD. However, the molecular mechanisms of SSAO/VAP-1 in stroke and its possible contribution to the nexus of ischemic stroke and AD have not been studied in detail. In this work, an easy ischemic model was set up by using peripheral endothelial cells expressing the human SSAO/VAP-1 protein (HUVEC hSSAO/VAP-1) under oxygen-glucose deprivation (OGD) conditions. Based on this model, it was found that SSAO/VAP-1 expression increases the susceptibility of endothelial cells to OGD, and that its substrates oxidation through its enzymatic activity increases the vascular cell damage. Caspase-3 and caspase-8 are activated during the death process. In addition, OGD constitutes a stimulus for the soluble SSAO/VAP-1 release, partly mediated by metalloproteinase-2-dependent shedding. Also, short-time OGD induces SSAO/VAP-1-dependent leukocyte binding on endothelial cells, which is partly dependent on its enzymatic activity. In order to better evaluate the beneficial effects of new pharmaceutical compounds by SSAO/VAP-1 activity inhibition under cerebral ischemia conditions, a human brain endothelial cell line expressing the human SSAO/VAP-1 (hCMEC/D3 hSSAO/VAP-1) was further generated as a model of the brain blood barrier (BBB). OGD conditions were established with these cells as well. By using hSSAO/VAP-1 HUVEC and hCMEC/D3 cells, a novel multitarget-directed ligand (MTDL) DPH-4, designed for AD therapy, was proved able to protect both endothelial cells, as well as to decrease the SSAO-dependent leukocyte adhesion under OGD with reoxygenation. DPH-4 was also effective against the damage induced by OGD and reoxygenation in the presence of beta amyloid as a model of AD pathology. With regard to determine the molecular mechanisms underlying the beneficial effect of simvastatin on ischemic stroke, hCMEC/D3 hSSAO/VAP-1 cells subjected to OGD conditions and two middle cerebral arterial occlusion (MCAO) rat models were used. Results revealed that simvastatin could suppress the release of soluble SSAO/VAP-1 into the plasma or cell culture media, which induces the expression of the adhesion molecules E-selectin and VCAM-1, and amplifies the inflammation and the consequent damage in the infarcted brain. At last, hCMEC/D3 hSSAO/VAP-1 cells were used so as to study the possible role of SSAO/VAP-1 in the nexus between ischemic stroke and AD. Preliminary results showed that in SSAO/VAP-1-expressing cells, OGD with reoxygenation induces the expression of BACE1 and decreases the expression of LRP-1, and that the substrate of SSAO/VAP-1 can further up-regulate the levels of APP under OGD with reoxygenation. Furthermore, the metabolism of methylamine by SSAO/VAP-1 activity induces additional cell death when co-treated with Aβ1-40D under OGD with reoxygenation. In summary, these results conclude that the expression of SSAO/VAP-1 in endothelial cells can increase the OGD-associated cell damage. OGD induces soluble SSAO/VAP-1 release. The oxidation of its substrate mediates part of the tissue damage. SSAO/VAP-1 activity-dependent leukocyte binding further exacerbates the disease progression by augmenting inflammation in cerebral ischemia. The inhibition of SSAO/VAP-1 activity by DPH-4 can provide a therapeutic benefit to the delay and/or prevention of ischemic stroke as well as its progression to AD. The modulation of the SSAO/VAP-1 levels mediates part of the beneficial effect of simvastatin on cerebral ischemia. In addition of ischemic condition, the presence of SSAO/VAP-1 in brain endothelium may facilitate the generation of β-amyloid, hence increasing the risk and neurological worsening of AD.

La toxicologia és l'estudi dels efectes adversos que causen compostos químics en organismes vius. Certs tòxics són específics per a neurones o grups de neurones resultant en el seu dany o la seva mort. La present tesi doctoral tracta aspectes neurotoxicològics de plaguicides organoclorats i compostos de mercuri. Els pesticides organoclorats produeixen en mamífers un síndrome d'hiperexcitabilitat acompanyat de convulsions mentre que el mercuri produeix malalties neurodegeneratives. Al sistema nerviós central de mamífers el glutamat és el neurotransmissor excitador principal, mentre que l'àcid gamma-aminobutíric (GABA) i glicina són els neurotransmissors inhibidors principals. Els pesticides organoclorats inhibeixen els corrents induïts per GABA interaccionant al lloc de la picrotoxinina del receptor GABAA, i d'altra banda els compostos de mercuri afecten a la transmissió sinàptica a través de múltiples accions en receptors i canals iònics, actuant selectivament sobre les cèl·lules granulars de cerebel in vivo. Els objectius de la tesi van ser: (1) l'estudi del bloqueig del receptor de glicina en comparació al receptor GABAA per part dels compostos organoclorats i (2) l'alteració del sistema GABAèrgic i glutamatèrgic així com la viabilitat neuronal per part dels compostos de mercuri. Cultius primaris de cèl·lules granulars de cerebel glutamatèrgiques que expressen funcionalment el receptor GABAA i el receptor de glicina van ser utilitzats al llarg de tot l'estudi. La inhibició del flux de clorur induït per glicina diferencia el lindà dels ciclodiens. El lindà va inhibir amb potència similar tant el flux de clorur induït per GABA com l'induït per glicina, mentre que l'-endosulfà i el dieldrin van ser molt més potents al receptor GABAA que al receptor de glicina. Un model farmacofòric obtingut mitjançant anàlisis computacionals va mostrar una regió formadora de ponts d'hidrogen responsable de l'acció diferencial dels ciclodiens al receptor GABAA, mentre que cinc regions hidrofòbiques estarien mediant l'acció dels ciclodiens i el lindà en ambdós receptors. Metilmercuri i clorur de mercuri alteraren la farmacologia del receptor GABAA potenciant la unió de flunitrazepam al lloc modulador de les benzodiazepines. A més a més, ambdós compostos de mercuri van inhibir el transport de glutamat i van produir paral·lelament a aquest efecte un increment del glutamat alliberat al medi i la oligomerització del transportador de glutamat neuronal EAAT3. La pèrdua de viabilitat mitocondrial produïda per metilmercuri i clorur de mercuri va ser prèvia a la neuronal i no relacionada amb excitotoxicitat. El metilmercuri va produir una mort neuronal dependent de mitocondri però independent de caspases a través de la translocació del factor iniciador de l'apoptosis (AIF) del mitocondri cap al nucli. Al llarg d'aquest treball els efectes d'ambdós compostos de mercuri han estat mimetitzats per un agent alquilant de grups sulfhidril i revertits per agents reductors indicant un mecanisme d'acció universal d'oxidació de les cisteïnes per a aquests compostos. Malgrat aquest mecanisme comú, metilmercuri i clorur de mercuri tenen accions diferencials en alguns dels seus efectes així com en la seva potència, que podria estar determinada per la capacitat del mercuri en un o dos llocs d'acomplexació (CH3Hg+ i Hg+2). Ambdós compostos de mercuri van causar un increment de clorur intracel·lular, i la omissió de clorur al medi d'assaig o bé la presència d'un bloquejant de canals de clorur no dependent de receptor van determinar alguns dels efectes dels compostos de mercuri observats. En conclusió, els pesticides organoclorats produeixen una neurotoxicitat mediada per receptor actuant sobre la neurotransmissió inhibidora mentre que els compostos de mercuri tenen un ampli ventall d'accions en diferents dianes tant al sistema de neurotransmissió inhibidor com excitador així com a nivell de les vies de mort neuronal.

La actual investigación en el campo de las células madre está ofreciendo nuevas posibilidades de terapia para enfermedades incurables del sistema nervioso, como es el caso de la corea de Huntington. Esta es una enfermedad hereditaria caracterizada por una degeneración selectiva de las neuronas GABAérgicas del Núcleo Estriado. Para poder desarrollar terapias de reemplazo celular basadas en los transplantes de células madre es necesario controlar el proceso de diferenciación de las células madre hacia el fenotipo neuronal GABAérgico. En la presente tesis hemos estudiado los mecanismos de supervivencia de las células madre en cultivo y los factores implicados en la diferenciación selectiva hacia el fenotipo GABAérgico. Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación in vitro basado en la adición secuencial de ácido retinoico (RA) y cloruro potásico (KCl). El RA promueve la supervivencia celular e induce un fenotipo neuronal. El tratamiento con KCl induce selectivamente el fenotipo GABAérgico. Mediante este procedimiento se generan un elevado número de neuronas GABAérgicas maduras, post-mitóticas y funcionales, de forma eficaz y homogénea, a partir de una línea de células madre en cultivo.El transplante de estas células pre-diferenciadas in vitro en el cerebro adulto de rata y en un modelo excitotóxico de la enfermedad de Huntington demuestran un buen grado de diferenciación, supervivencia e integración funcional. Las células muestran una supervivencia a largo plazo, conservan el fenotipo neuronal GABAérgico y elaboran procesos neuríticos asociados a posibles contactos pre- y post-sinápticos. Estos resultados apoyan la posibilidad de desarrollar terapias celulares basadas en la diferenciación de células madre para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. / "CELL THERAPY IN MODELS OF HUNTINGTON'S DISEASE"The implementation of cell replacement therapies for Huntington's disease using multipotent neural stem cells requires the specific differentiation into gamma-aminobutyric acid (GABA) neuronal subtype prior to transplantation. In the present thesis we present an efficient culture procedure that induces stable GABAergic neurons from the immortalized striatal neural stem cell line ST14A. This process requires sequential retinoic acid treatment and KCl depolarization. Initial addition of retinoic acid increased cell survival and promoted neuronal differentiation. Subsequent stimulation with KCl induced specific differentiation into GABAergic neurons, yielding 74% of total cultured cells. KCl-evoked Ca2+ influx reduced cell proliferation and nestin expression, and induced neurite outgrowth and GABAergic markers as well as GABA contents, release and uptake. Characterization of the integration, survival and phenotype of these pre differentiated GABAergic neurons following transplantation into the adult brain in a model of Huntington's disease revealed long-term survival in quinolinate-lesioned striata. Under these conditions, cells maintained their GABAergic phenotype and elaborated neurite processes with synaptic contacts with endogenous neurons.We present an in vitro procedure that generates a homogeneous population of functional GABAergic neurons from a neural stem cell line, which survive and maintain their acquired fate in vivo. This data may lend support to the possibility of cell replacement therapies for Huntington's disease using neural stem cells.

L'esquizofrènia és una malaltia cerebral crònica, greu i incapacitant que afecta l'1% de la població i que s'expressa en forma de funcions mentals anormals i alteracions en el comportament. Només amb l'aparició dels primer fàrmacs antipsicòtics va millorar sensiblement la situació d'aquests malalts. Els antipsicòtics clàssics presenten efectes secundaris greus, mentre que els antipsicòtics atípics amb una eficàcia terapèutica igual o superior que els clàssics no indueixen aquest efecte adversos.Els fàrmacs antipsicòtics atípics tenen afinitat per multitud de receptors, entre ells destaquen els receptors de serotonina 5-HT2A i 5-HT1A. Aquest receptors s'expressen de forma molt abundant a les neurones piramidals i GABAérgiques de l'escorça prefrontal medial (EPFm) que és una àrea del cervell implicada en processos cognitius superiors com el llenguatge, la intel·ligència o la memòria de treball i que s'ha demostrat que presenta alteracions anatòmiques, metabòliques i funcionals en els malalts esquizofrènics. L'escorça prefrontal medial està interconnectada amb multitud d'altres àrees corticals i subcorticals, en particular destaca l'interès de les connexions recíproques de l'escorça prefrontal medial amb els nuclis aminèrgics del mesencèfal (àrea tegmental ventral i nuclis del rafe) ja que segons les hipòtesis sobre l'etiopatogènia de l'esquizofrènia aquest nuclis estarien implicats en el desenvolupament o en el tractament de la malaltia.L'objecte d'aquesta tesi es esbrinar el paper dels receptors 5-HT1A i 5HT2A presents a l'escorça prefrontal medial en la regulació de l'activitat de les neurones serotoninèrgiques i dopaminèrgiques, així com estudiar l'efecte dels antipsicòtics en aquestes mateixes vies.Per dur a terme el treball s'han utilitzat tècniques in vivo com l'electrofisiologia extracel·lular, en la qual podem mesurar l'activitat elèctrica després de l'administració local o sistèmica de fàrmacs, d'una neurona de la que podem caracteritzar el fenotip i la microdiàlisi intracerebral que ens permet mesurar la concentració de neurotransmissor alliberat a les sinàpsis de la zona del cervell a estudiar. Les conclusions d'aquesta tesi son:1. L'estimulació dels receptors 5-HT2A incrementa l'activitat de les neurones piramidals de l'EPFm activant així el circuit EPFm-DR i per tant incrementant l'alliberament de 5-HT a l'escorça. La deshinibició del tàlem indueix el mateix efecte en l'activitat piramidal i en l'alliberament de 5-HT. En contra de treballs previs aquest efectes no semblen estar mitjançats per receptors 5-HT2A de terminals talàmics ja que la lesió del tàlem no els impedeix. 2. L'increment en l'alliberació de 5-HT induït per l'activació dels receptors 5-HT2A corticals involucra a la transmissió glutamatèrgica mitjançada per receptors AMPA del glutamat, aquest fenomen es dona igual en rata i en ratolí, la qual cosa permet el treball en models murins que no existeixen en rata. 3. L'activació dels receptors 5-HT2A corticals incrementa l'activitat de les neurones dopaminèrgiques de l'ATV i l'alliberament cortical i a ATV de DA de forma paral·lela a l'increment induït a les neurones piramidals del'EPFm, posant de manifest un control del sistema mesocortical pels receptors 5-HT2A corticals.4. Igualment existeix un control del sistema mesocortical pels receptors 5-HT1A corticals ja que l'activació dels receptors 5-HT1A de l'EPFm també incrementa l'activitat de les neurones dopaminèrgiques de l'ATV i l'alliberament cortical i a ATV de DA de forma paral·lela a l'increment induït a les neurones piramidals de l'EPFm que projecten a l'ATV. En aquest efecte semblen estar implicades les interneurones GABAèrgiques de l'EPFm. 5. Els fàrmacs antipsicòtics reverteixen l'efecte excitador sobre el sistema 5-HT produït pel DOI mentre que els antipsicòtics atípics incrementen l'activitat del sistema dopaminèrgic mesocortical per un mecanisme que sembla implicar els receptors 5-HT1A de les interneurones GABAèrgiques del'EPFm. Aquests efectes poden estar jugant un paper clau en el mecanisme terapèutic pels quals els antipsicòtics atípics milloren l'esquizofrènia sense produir efectes adversos extrapiramidals. / THESIS SUMMARY:The atypical antipsychotic drugs have affinity for crowd of receptors; among them highlight the receptors of serotonin 5-HT2A and 5-HT1A. These receptors are expressed in very abundant way in pyramidal and GABAergic neurons of medial prefrontal cortex that it is an area of the brain that is implicated in superior cognitive processes and it is demonstrated that has anatomic, metabolic and functional alterations in the schizophrenic patients. Medial prefrontal cortex is interconnected with the aminergic nuclei of the mesencephalon (nuclei of the raphe and ventral tegmental area) and according to the hypotheses about the physiopathology of schizophrenia this nuclei would be implied in the development or the treatment of the illness.The objective of this thesis is to study the role of the 5-HT1A and 5-HT2A receptors present in medial prefrontal cortex in the regulation of the activity of the serotoninergic and dopaminergic neurons, as well as to study the effect of the antipsychotic drugs in these same ways. To carry out this work, we have used two different techniques in vivo: extracellular electrophysiological recordings and intracerebral microdialysis.The most important conclusions of this study are:As much the activation of the cortical 5-HT2A as of the 5-HT1A receptors increase the activity of the dopaminergic neurons from ventral tegmental area and the cortical release in medial prefrontal cortex and in ventral tegmental area of dopamine neurons in according to the increase induced on the cortical pyramidal neurons showing a control of the mesocortical system for these cortical receptors.The atypical antipsychotic drugs increase the activity of the dopaminergic mesocortical system for a mechanism that seems to imply the 5-HT1A receptors of the cortical GABAèrgic interneurons. These effects can be playing a nail role in the therapeutic mechanism for which the atypical antipsychotic drugs improve schizophrenia without producing extrapyramidal adverse effects.

Durante el desarrollo del sistema nervioso, la muerte celular programada es un proceso que afecta a todas las poblaciones neuronales. Este mecanismo es esencial para la correcta formación de los circuitos neuronales que definen nuestras funciones sensoriales, motoras o cognitivas. La muerte celular programada está regulada a través de diversos mecanismos, entre los que destacan los factores tróficos, ya que estas proteínas son sintetizadas en cantidades limitantes, de manera que las neuronas que no los captan mueren por apoptosis. Los factores tróficos activan varias vías de señalización intracelular relacionadas con la supervivencia, la diferenciación neuronal y la plasticidad. Además de la muerte apoptótica durante el desarrollo, este fenómeno se da también en neuronas maduras, a causa de una lesión o por estrés. Los factores tróficos han sido implicados en estos procesos degenerativos ya que su patrón de expresión o el de sus receptores está alterado. Esta tesis se ha centrado en el estudio de las vías de señalización intracelular de muerte neuronal y en las que median los efectos biológicos y neuroprotectores de los factores tróficos, concretamente del BDNF, el GDNF y la BMP-6. Estos estudios se han realizado en el núcleo estriado, zona que degenera en la enfermedad de Huntington, con el propósito de aportar nuevos datos para el desarrollo de nuevas terapias neuroprotectoras. El BDNF promueve la maduración de las neuronas estriatales en cultivo a través de las vías de señalización intracelular PI3K y ERK/MAPK. Además, el BDNF también incrementa la supervivencia neuronal, aunque en este caso solo está implicada la vía de la PI3K. Respecto al GDNF este factor solo promueve la diferenciación morfológica de las neuronas estriatales a través de la activación de la vía de la ERK/MAPK, aunque es necesario que exista una activación basal de la vía de la PI3-K para que el GDNF pueda mediar dichos efectos. Por último, la BMP-6, la cual induce la diferenciación de los precursores neurales hacia el fenotipo neuronal GABAérgico, pero no afecta ni a la supervivencia ni a la proliferación de las células estriatales. Además, hemos descubierto que estos efectos están mediados a través de la glía. Trabajos anteriores del laboratorio habían demostrado que el BDNF es un buen agente neuroprotector frente a estímulos excitotóxicos inducidos en el núcleo estriado. Nos planteamos si las proteínas de la familia de la Bcl-2 estaban implicadas en dicho efecto. En primer lugar observamos que la estimulación excitotóxica intraestriatal de los receptores NMDA o no-NMDA provoca una regulación diferencial de Bax, ya que sólo la inyección de quinolinato induce un aumento en los niveles de esta proteína pro-apoptótica. Sin embargo, únicamente la activación de los receptores no-NMDA regula los dímeros Bax:Bcl-xL. Respecto al BDNF, éste protege de la lesión excitotóxica bloqueando los cambios en los miembros de la familia de la Bcl-2 tras la inyección de quinolinato o kainato y estos efectos neuroprotectores están mediados por la activación de la vía de la PI3-K. Finalmente, debido a la regulación diferencial de Bax observada, analizamos su papel durante el desarrollo postnatal y frente a la excitotoxicidad. Así pues, el patrón de expresión de Bax es similar durante el desarrollo de la corteza cerebral y del núcleo estriado. Sin embargo su ausencia produce una regulación diferencial de Bim o Bak en estas dos zonas, indicando que la expresión de estas proteínas durante la muerte celular programada es dependiente de la región cerebral. Además, la muerte excitotóxica inducida a través de la inyección de QUIN en el núcleo estriado es regulada por Bim y Bax y en ausencia de Bax existe un mecanismo compensatorio parcial por parte de Bak y Bcl-xL. / INTRACELLULAR SIGNALING MECHANISMS OF SURVIVAL AND NEURONAL DEATH REGULATED BY TROPHIC FACTORSThe main goal of this thesis is to study which intracellular death signaling pathways as well as survival pathways are involved in biological and neuroprotective effects of trophic factors such as BDNF, GDNF and BMP-6. These studies have been peformed in the striatum since it is the region affected in Huntington's disease, in order to contribute new data for the development of new neuroprotective therapies.BDNF promotes striatal neurons maturation through PI3K and ERK/MAPK intracellular signaling pathways. Furthermore, BDNF also increases cell survival but only PI3K signaling pathway is involved. In contrast, GDNF only induce an increase of neuritic differentiation through ERK/MAPK pathway, although a basal PI3K activity is needed to GDNF can mediate effects. The last trophic factor analyzed is BMP-6, which promotes striatal neurons maturation but is not involved in neuronal survival. BMP-6 are mediated by glia.Previous works in our laboratory demonstrated a neuroprotective effect of BDNF against striatal excitotoxicity. We further analyzed whether members of Bcl-2 family were involved in BDNF effects. Excitotoxic stimulation of NMDA or non-NMDA receptors regulates pro-apoptotic protein Bax in a differential manner since only quinolinate injection increases Bax protein levels. Nevertheless, only non-NMDA receptors activation regulates Bax:Bcl-xL heterodimers. BDNF blocks all these changes in Bcl-2 protein family through PI3K signaling pathway activation.Finally, due to differential regulation of Bax against excitotoxicity, the role of this protein was examined in the striatum and cerebral cortex during different postnatal ages, as well as after a quinolinate intrastriatal injection. Bax expression pattern is similar in both areas analyzed. However, Bax deficiency promotes a differential regulation of Bim and Bak in these two areas analyzed. This result suggest there is a different specific expression pattern during programmed cell death in the striatum and cortex. Exicitotoxicity is regulated by Bim and Bax, and the lack of Bax promotes a partial compensatory mechanism induced by Bak and Bcl-xL.

Aquesta tesi estudia les MMPs: MMP-9, MMP-2 i MMP-3 en relació amb la isquèmia cerebral en la rata i també un possible paper de la MMP-9 en la divisió cel·lular.Es mostra l'activació de les gelatinases (MMP-2 i MMP-9) en el cervell de la rata després d'una isquèmia cerebral focal transitòria d'una hora en el territori de l'artèria cerebral mitja. S'observa que la MMP-9 presenta un pic a les 24 hores postisquèmia i que està associada a les neurones i als tractes de fibres mielinitzades, mentre que la MMP-2 té un augment d'activitat a les 4 hores i un increment enorme als 4 dies, localitzant-se principalment en la micròglia reactiva.Es demostra, per primera vegada, l'alliberament de la MMP-9 a l'espai extracel·lular del cervell mitjançant la tècnica de la microdiàlisi in vivo. La isquèmia provoca un alliberament a l'espai extracel·lular de dímers i de la proforma de la MMP-9, però no de la forma de 88 KD observada prèviament en el teixit. Aquest augment està relacionat amb la infiltració de neutròfils de la sang al teixit lesionat després de la isquèmia.Aquesta tesi mostra la contribució dels neutròfils en l'augment de la MMP-9 al cervell induïda per la isquèmia focal transitòria (de la proforma de 95-kDa, no de la forma de 88-kDa) però no en l'increment el volum de l'infart cerebral a les 24 hores en el nostre model.També veiem que la isquèmia cerebral produeix una activació de la MMP-3 en el cervell a les 24 hores i als 4 dies postisquèmia, localitzant-se en neurones (a les 24 hores), en la microvasculatura, en la microglia reactiva/macròfags (a partir del 4 dies) i en els oligodendròcits (augmentada als 14 dies postisquèmia). La MMP-3 degrada in vitro un possible substrat: l'agrina neuronal present en homogenats de cervell. Després de la isquèmia (als 1, 4 i 7 dies) disminueix el contingut d'agrina de la membrana cel·lular i es genera una forma de pes molecular més baix de la forma neuronal de l'agrina, deguda segurament a proteolisi per la MMP-3. L'agrina es localitza al cervell en: les neurones, els astròcits reactius als 7 dies, acúmuls al voltant dels vasos sanguinis als 4 dies i en les vesícules de fagocitosi de la microglia reactiva als 4 i als 14 dies. Finalment, la MMP-9, o una proteïna molt semblant a la MMP-9, podria tenir un paper intracel·lular en la divisió cel·lular. En cultius de cèl·lules de neuroblastoma veiem que les cèl·lules en mitosi presenten una immunoreactivitat més alta (estudis en citometria de flux) i un increment de l'activitat gelatinasa (estudis de zimografia in situ), així com una expressió precisa, dinàmica i ben orquestrada d'aquesta proteïna en les diferents etapes de la divisió cel·lular. Per altra banda, el creixement cel·lular es veu afectat per l'ús d'inhibidors de les MMPs, sense afectar-ne la viabilitat (estudis de creixement dels cultius) i augmenta el percentatge de cèl·lules que estan en fase S i G2 reduïnt-se el de les que estan en G1 (estudis realitzats per citometria de flux). Per últim observem que l'estimulació del creixement cel·lular amb el factor de creixement transformant (TGF-a) és depenent de l'activació de la MMP-9 cel·lular. / Matrix metalloproteinases may participate in the pathogenesis of stroke. We studied MMP-2 (gelatinase A), MMP-9 (gelatinase B) and MMP-3 in rat brain after focal cerebral ischemia. The expression of MMP-9 increased in brain after ischemia/reperfusion from 4 h to 4 days (mainly 95-kDa proform and dimers and, to a lesser extent, 88-kDa form). For MMP-2, the results suggest a discrete production immediately after reperfusion (detected at 4 h), while a very enhanced expression and activation of MMP-2 attributable to microglia/macrophages occurs on day 4.The results using microdialysis in vivo suggest that certain forms of MMP-9 (95-kd proform, dimers and cleaved active forms (70 kd), but not the 88-kd form found in tissue) are released and accumulate in the extracellular space 24 hours after ischemia, and that vascular alterations and neutrophil recruitment elicit MMP-9 activation in the brain after focal ischemia and trauma. Treatments preventing neutrophil infiltration shows that neutrophils highly contributes to enhanced MMP-9 in the ischemic brain by releasing MMP-9 proform and dimers (but not the 88-kDa MMP-9 form). The results show MMP-3 activation and neuronal transmembrane agrin cleavage after ischemia/reperfusion. In addition, the finding that MMP-3 cleaves brain agrin strongly suggests that ischemia-induced MMP-3 activation causes agrin cleavage.MMP-9, or a protein with features of MMP-9, participates in cell division and might be involved in cellular content reorganization and chromatid segmentation.

DE LA TESIS:El objetivo de esta tesis ha sido el de determinar los diferentes mecanismos intracelulares de muerte neuronal así como en su posible modulación mediante factores tróficos. Estos estudios se han realizado en el núcleo estriado, zona que degenera en la enfermedad de Huntington, con el propósito de identificar nuevas dianas sobre las que actuar para detener la neurodegeneración específica y desarrollar nuevos tratamientos neuroprotectores para la enfermedad.Comenzamos el trabajo con el estudio de las vías intracelulares que median los efectos biológicos del GDNF sobre las neuronas estriatales, estudio para el que se emplearon cultivos primarios de neuronas estriatales. Seguidamente, nos centramos en el estudio de mecanismos de muerte y supervivencia in vivo, y más concretamente en la regulación de las proteínas de la familia de Bcl-2 en el núcleo estriado analizando tres paradigmas diferentes: (1) El desarrollo postnatal; (2) un modelo excitotóxico de la enfermedad de Huntington donde se produce una lesión estriatal aguda; y (3) un modelo transgénico de la enfermedad donde se produce una degeneración estriatal paulatina. En un trabajo previo de nuestro grupo se describió un papel esencial de la proteína Bax en el proceso apoptótico de las neuronas estriatales activado por la inyección de agonistas de los receptores de glutamato, por lo que nos interesamos en estudiar específicamente a esta proteína pro-apoptótica, y comenzamos por analizar su participación en el proceso apoptótico utilizando un animal KO para la proteína. Finalmente, la escasa muerte neuronal que se produce en el modelo transgénico, nos condujo a estudiar la activación de la vía de supervivencia AKT en respuesta a la toxicidad inducida por la expresión de htt mutada, y su posible participación en la compensación de las vías de muerte neuronal.En esta tesis se ha determinado la importancia del GDNF en la modulación de la arborización de las neuronas estriatales, describiendo además los precisos mecanismos intracelulares que median estos efectos. Además se han descrito la participación de las diferentes proteínas de la familia de Bcl-2 en diferentes paradigmas, desde el desarrollo postnatal, a modelos de enfermedad de Huntington agudos y crónicos. Con estos estudios se ha demostrado la participación esencial de la proteína pro-apoptótica multidominio Bax en la muerte de las neuronas estriatales, además de una relación directa de la expresión de formas mutadas de la proteína huntingtina con la regulación de las miembros pro-apoptóticos de la subfamilia solo-BH3, observándose que el gran incremento y localización mitocondrial de estas proteínas influye en la disfunción neuronal descrita durante el desarrollo de la enfermedad. Fruto de estos analísis se propone a la proteína pro-apoptótica Bim como sensor frente a un amplio rango de estímulos nocivos dentro del núcleo estriado, subrayando la gran importancia de su regulación en las primeras etapas de los procesos de muerte, y además, señalando que los incrementos de esta proteína podrían reflejar en parte un soporte molecular al adelanto de las alteraciones motoras descritas en los modelos de Huntington tras la reducción de los niveles de BDNF. Por último, se ha demostrado que diferentes modelos de enfermedad de Huntington que expresan el exon 1 de la proteína huntingtina mutada mantienen una elevada actividad de la quinasa AKT que mantiene su naturaleza anti-apoptótica hasta las etapas más avanzadas de la enfermedad. Se postula que la subsistencia de esta actividad permitiría que las neuronas estriatales pudieran sobrevivir durante un largo tiempo con la expresión de la htt mutada. Estos datos subrayan la relevancia de la vía anti-apoptótica durante la progresión de la enfermedad, y apoyan la importancia de mantener unos niveles elevados de AKT fosforilada y su uso en terapias combinadas como un medio efectivo de retrasar la pérdida irreversible de las neuronas estriatales.

La instauración de terapias de sustitución celular en enfermedades neurodegenerativas requiere disponer de una población homogénea del tipo celular concreto que ha de ser reemplazado. Para ello va a ser necesario una diferenciación controlada de células madre hacia el fenotipo de interés. Una buena aproximación a la hora de de guiar la diferenciación de células madre es seguir los mecanismos que gobiernan la generación de dichas células durante el desarrollo del sistema nervioso. Por lo tanto va a ser necesario estudiar las poblaciones de precursores neurales que van a dar lugar a la generación de la inmensa diversidad celular existente en el cerebro, así como los factores de transcripción y factores solubles que modulan la determinación de esos precursores hacia linajes específicos.La enfermedad de Huntington cursa con la degeneración selectiva de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales, es por ello que el objetivo de la presente tesis ha sido el estudio de factores solubles así como de factores de transcripción que están implicados en la diferenciación de dichas neuronas. Para ello se han utilizado diferentes aproximaciones. En primer lugar se han utilizado ESC de ratón para el estudio de la implicación del ácido retinoico y LIF, dos factores solubles, en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas estriatales. El ácido retinoico es un potente factor neurogénico que ha sido ampliamente utilizado para inducir la diferenciación neuronal de ESC (Bain y col., 1996; Okada y col., 2004). Por su parte LIF es un factor que se utiliza para mantener las células madre embrionarias en un estado indiferenciado. Sin embargo, diversos autores lo utilizan también en sus protocolos de diferenciación neuronal de dichas células (Tropepe y col., 2001; He y col., 2006). Nosotros hemos estudiado la interrelación entre estos dos factores en la diferenciación neuronal de ESC de ratón en cultivos a corto y largo plazo. Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento con LIF inhibe la diferenciación neuronal inducida por ácido retinoico. En segundo lugar, el tratamiento con elevadas concentraciones de ácido retinoico en ausencia de factores de crecimiento induce una diferenciación neuronal madura que supone una reducción en la viabilidad de las ESC diferenciadas a largo plazo. Además el elevado número de neuronas derivadas de la diferenciación de las ESC tratadas con ácido retinoico in vitro no se observa tras el trasplante cerebral de éstas.En una segunda aproximación al estudio de los factores implicados en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales y teniendo en cuenta que durante el desarrollo de los precursores estriatales intervienen diversos factores de transcripción, en la presente tesis se ha estudiado el papel del factor de transcripción Ikaros durante el desarrollo del núcleo estriado y en concreto en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas estriatales. Nuestros resultados muestran que Ikaros es esencial para la correcta generación de neuronas encefalinérgicas estriatales a partir de la diferenciación de precursores neurales Dlx-2 positivos de la LGE. La salida de ciclo de los precursores que van a poblar la matriz del núcleo estriado requiere Ikaros y la falta de éste afecta a las poblaciones de células madre de la zona germinal, no sólo durante el desarrollo sino también en el adulto. En consecuencia, el embrión deficiente de Ikaros presenta una zona germinal mayor a expensas de una reducción en el volumen estriatal. El menor tamaño del núcleo estriado observado en el ratón deficiente de Ikaros en comparación con el ratón normal es debido a la disminución en el número de neuronas totales y en particular de la subpoblación encefalinérgica de neuronas de proyección. Es decir, que Ikaros induce la diferenciación neuronal encefalinérgica en precursores neurales tal y como se confirma mediante experimentos de sobre-expresión de Ikaros-1. El estudio de la implicación del ácido retinoico y LIF, como factores solubles, y de Ikaros, como factor de transcripción, en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales nos acerca un poco más al establecimiento de un método reproducible y controlado de diferenciación de células madre que permita la generación ex vivo de neuronas GABAérgicas funcionales que puedan ser utilizadas para el trasplante en terapias sustitutivas de la enfermedad de Huntington.