Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Zusammenhang zwischen Eisenstoffwechsel, Adipositas, Metabolischem Syndrom und dem Inflammationsprozess peripherer Nerven. Die periphere Neuropathie ist eine Erkrankung, die sich im Rahmen von Stoffwechselentgleisungen entwickeln kann. Bekannt ist der Zusammenhang zwischen Diabetes mellitus und dem Auftreten der peripheren Neuropathie. Bislang gibt es nur wenige Studien, die den Zusammenhang zwischen der peripheren Neuropathie und anderen Stoffwechselsituationen untersuchten. Wir haben uns mit dem gleichzeitigen Auftreten der Adipositas, des MetS und der peripheren Neuropathie beschäftigt. Dabei wurde der Einfluss des Eisenstoffwechsels in diesem Zusammenhang genauer betrachtet. In dieser Studie konnte am Mausmodell gezeigt werden, dass eine Degeneration der Nervenfasern an peripheren Nerven der Fußsohle und des Nervus ischiadicus durch Eisenmangel gefördert wird. Hingegen konnte ein durch exogene Eisenaufnahme entstandener erhöhter Eisengehalt diesen degenerativen Prozess verlangsamen. Unsere Untersuchungen konnten periphere Nervenschäden aufzeigen, wobei es vor allem zu einer Gewebsdegeneration distaler Axone kam. Vermutlich stellt die umgebende Entzündungsreaktion, die wir anhand der hohen Anzahl von Monozyten und autokriner Zytokine detektierten, einen ausschlaggebenden Faktor im Pathomechanismus der peripheren Neuropathie dar. TNF-α wird von den Entzündungszellen oder von Zellen im Fettgewebe sezerniert, die zu Veränderungen an der Blut-Nervenschranke führen. Dadurch kann es zu schädigenden Effekten im Nervengewebe kommen. Außerdem kann TNF-α als Entzündungsmediator weitere immunkompetente Zellen, wie Leukozyten, Makrophagen oder T- Zellen anlocken, die in das Endoneurium eindringen (Baum et al., 2016). Es konnte festgestellt werden, dass die Ausschüttung proinflammatorischer Mediatoren an peripheren Nerven auch ohne gleichzeitigem Auftreten einer Hyperglykämie induziert wird. Des Weiteren sahen wir, dass dieser Pathomechanismus durch freies Eisen beeinflusst werden kann. Bei den ob/ob-Mäusen, die eine Mangeleisendiät bekamen, konnte eine gesteigerte Anzahl proinflammatorischer Zellen, sowie eine vermehrte Expression des TNF-α-Proteins nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis lässt uns auf einen proinflammatorischen Einfluss durch Eisenmangel schließen. Ein genauer Zusammenhang dieses Effekts zwischen Eisenmangel und Adipositas bzw. MetS ist noch unklar. Bemerkenswerterweise zeigen neueste Studien, dass Adipositas einen modulierenden Effekt auf den Eisengehalt von Adipozytenmakrophagen und der Ausschüttung von Gewebseisen hat (Orr et al., 2014). Eine hochkalorische Diät erhöhte die absolute Makrophagenzahl im Fettgewebe. Dieser Anstieg konnte vor allem bei geringem Eisengehalt nachgewiesen werden. Eine verminderte Genexpression antiinflammatorischer Faktoren und eine verstärkte Expression proinflammatorischer Mediatoren konnte bei mangelndem Eisen aufgezeigt werden (Orr et al., 2014). Ein gestörter Eisenstoffwechsel bei Makrophagen mit hohem Eisengehalt war mit einer Eisenüberladung in Adipozyten und einem Eisenmangel in der Leber verbunden. Mit zunehmender Eisenkonzentration wurden weniger entzündungsstimulierende Signale durch Makrophagen gesendet. Die Produktion und Sekretion proinflammatorischer Zytokine waren in Gegenwart von Eisen vermindert (Gan et al., 2017). In der Pathologie der peripheren Neuropathie und der modulatorischen Rolle des Eisenstoffwechsels ließ sich kein Zusammenhang zum Blutglukosespiegel herstellen. In unserer Studie konnte auch ohne Vorliegen einer Hyperglykämie eine Inflammation an peripheren Nerven beobachtet werden. Eine chronische Inflammation des Fettgewebes geht mit einer gestörten Signalübertragung des Insulinhaushaltes und einem kompromittierten Triglyzeridspeicher einher (O’Brien et al., 2017). Wir konnten aufzeigen, dass der Funktionsverlust peripherer Nerven bei länger anhaltendem Eisenmangel ausgeprägter ist als bei einer Eisenüberladung. Der Einfluss des Eisenstoffwechsels im peripheren Nervensystem ist noch relativ unklar und wenig beschrieben. Für uns ist es wichtig, die Rolle des Eisens im Entstehungsprozess der peripheren Neuropathie näher zu beleuchten, um adäquate Behandlungsstrategien beim Menschen entwickeln zu können. Um Langzeiteffekte aufzeigen zu können, waren 4 Monate des Experiments nicht ausreichend. Um jedoch Therapiestrategien zur Behandlung von Nervenschädigungen bzw. -entzündungen entwickeln zu können, wären Langzeituntersuchungen über die Wirkung des Eisenstoffwechsels auf Adipositas und MetS wichtig.:Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Adipositas 1.2. Metabolisches Syndrom 1.3. Periphere Neuropathie 1.4. Eisen 1.4.1. Eisen und Adipositas 1.4.2. Eisen und oxidativer Stress 1.4.3. Eisen und neurodegenerative Erkrankungen 2. Ziel der Arbeit 3. Material/Methoden 4. Publikation 5. Zusammenfassung 6. Literaturverzeichnis 7. Anhang 7.1. Tabellenverzeichnis 7.2. Abbildungsverzeichnis 8. Darstellung des eigenen Beitrags 9. Erklärung über die eigene Abfassung der Arbeit 10. Lebenslauf 11. Danksagung

L’identification des mutations génétiques impliquées dans les maladies rares est un prérequis pour mieux les comprendre, les traiter et accompagner les patients. Pour se faire, des modèles animaux présentant des maladies spontanées homologues aux maladies humaines sont très prometteurs. Le chien développe spontanément des maladies génétiques, rares chez l’Homme, mais fréquentes dans certaines races de chiens, ce qui simplifie les analyses génétiques. Ma thèse a porté sur deux maladies neurologiques : l’épilepsie et la neuropathie. Pour l’épilepsie, l’objectif était d’identifier des variants génétiques à partir de données de génotypage et de séquençage de génomes complets de deux races canines prédisposées. Un locus lié à la maladie a été identifié dans une race et des variants ponctuels et structuraux candidats ont été identifiés dans les deux races et sont en cours de validation par séquençage ciblé. Pour la neuropathie, l’équipe avait identifié une mutation en amont du gène GDNF, responsable d’une neuropathie sensitive chez des chiens de chasse. J’ai participé à la validation fonctionnelle de cette mutation. De plus, GDNF étant un excellent gène candidat pour les neuropathies humaines, j’ai séquencé ce gène chez 111 patients et extrait les variants de GDNF d’une base de données d’exomes et de génomes de plus de 600 patients. J’ai ainsi identifié 21 variants rares ou inconnus et les ai priorisé selon leurs impacts prédits in silico. Ces deux projets, alliant analyses génétiques, génomiques et fonctionnelles, chez l’homme et le chien, montrent le potentiel du chien pour l’identification de gènes candidats dans des maladies rares et/ou complexes chez l’Homme. / The identification of genetic mutations involved in rare diseases is a prerequisite for a better understanding, therapies and care to patients. To this aim, animal models declaring spontaneous diseases, homologous to human diseases are very promising. Dogs spontaneously develop genetic diseases, rare in humans, but frequent in some dog breeds, which simplifies the genetic analyzes. My thesis focused on two neurological diseases: epilepsy and neuropathy. For epilepsy, the goal was to identify genetic variants from genotyping data and sequencing of whole genome of dogs from two predisposed breeds. A disease-related locus has been identified in one breed and candidate point mutations and structural variants were identified in the two breeds and are being validated by targeted sequencing. For neuropathy, the team previously identified a mutation upstream of the GDNF gene, responsible for sensory neuropathy in hunting dogs. I participated to the functional validation of this mutation. In addition, GDNF being an excellent candidate gene for human neuropathies, I sequenced this gene in 111 patients and extracted GDNF variants from a database of exomes and genomes from more than 600 patients. I identified 21 rare or unknown variants and prioritized them according to their in silico predicted impacts. These two projects, combining genetics, genomics and functional analyses, in humans and dogs, show the dog's potential for identifying candidate genes in rare and / or complex diseases in humans.

La fonction d’équilibration est une fonction complexe qui implique une interaction entre les systèmes somatosensoriel, vestibulaire et visuelle qui en assurent la régulation. En pathologie, le contrôle de la posture et de l’équilibre peut être atteint comme dans le cas de neuropathies périphériques qui se caractérisent par une atteinte des fibres sensitives et motrices de niveau variable. Les neuropathies à prédominance sensitive sont dénommées neuropathies ataxiantes ; elles se caractérisent au niveau des membres inférieurs par l’atteinte proprioceptive qui peut entraîner des troubles de la posture et de l’équilibre en condition statique, dynamique ou encore lors de la marche. Ce travail rapporte trois méthodes d’évaluation élaborées dans les trois conditions d’équilibration afin de mieux caractériser les troubles de l’équilibre de cette population. L’évaluation de l’équilibre en condition statique sur une plateforme de force nous a permis de caractériser le poids des atteintes sensorielles et motrices dans les neuropathies à condition d’y inclure la mesure du paramètre de limite de l’équilibre qui dissocie le plus ces deux composantes. En condition dynamique, l’analyse de l’équilibre sur une plateforme de force motorisée « IsiMove » nous a permis de créer un score composé qui discrimine les troubles de l’équilibre d’une population de sujets ataxiques caractérisé par une instabilité majeure en conditions quasi statique (basse fréquence de déstabilisation) et une instabilité moins marquée en conditions plus dynamiques (hautes fréquences). Au cours de la marche, les lunettes eye-tracker se sont avérées constituer un outil pertinent pour l’analyse de la compensation visuelle, à la fois reproductible et sensible à la pathologie. Cette technologie nous a aidés à caractériser quantitativement une stratégie visuelle mise en place par les patients ataxiques lors de la locomotion. Les résultats de ce travail de thèse ouvrent différentes perspectives en ce qui concerne l’élaboration de programmes de rééducation plus spécifiques pour cette population, et la caractérisation instrumentale de nouveaux profils de troubles de l’équilibre des patients présentant une instabilité d’origine neurologique. / The balance function is a complex function that involves interaction between the somatosensory, the vestibular and the visual systems, the latter ensuring the equilibrium function regulation. In pathology, the control of posture and balance can be impaired as in the case of peripheral neuropathies, characterized by the impairment of sensory and motor fibers of variable level. Predominantly sensory neuropathies are called ataxic neuropathies; they are characterized by proprioceptive impairment in the lower limbs that can lead to disorders of posture and balance in static or dynamic condition, or even during gait. This study reports three assessment methods developed under the three balance conditions to better characterize balance disorders concerning this population. Balance assessment under static condition on a force platform has enabled us to characterize the weight of the sensory and motor impairments in neuropathies, provided that by the inclusion of measuring the limits of equilibrium balance parameter, which separates the most these two components. Under dynamic conditions, the analysis of balance on the motorized force platform "IsiMove" allowed us to create a composed score that distinguishes balance disorders in a population of ataxic subjects, which is characterized by major instability in quasi-static conditions (low frequency instability) and a less marked instability in more dynamic conditions (high frequencies). During gait, the eye tracker glasses have proven to be a relevant tool for the analysis of visual compensation, both reproducible and sensitive to the pathology. This technology has helped us to quantitatively characterize the visual strategy implemented by ataxic patients during locomotion. The results of this thesis open different perspectives regarding the development of more specific rehabilitation programs for this population. It also opens different perspectives on the instrumental characterization of new profiles of balance disorders in patients with instability of neurological origin.

Charcot-Marie-Tooth-1A (CMT1A) is the most prevalent inherited peripheral neuropathy and no curing treatment is available. Even though the genetic cause (a duplication of the myelin protein PMP22) is known since the 90th, the pathological mechanisms are poorly understood. Clinically, affected patients suffer from muscular atrophies, foot deformities and sensory deficits. Histologically, diseased peripheral nerves show primary myelin abnormalities during development followed by a slowly progressing demyelination and subsequent axonal loss in adulthood, which accounts for clinical symptoms. Most specifically, CMT1A nerves exhibit onion bulb formations, which are supernumerary Schwann cells, wrapping concentrically around a central axon-Schwann cell unit. Here, we show that Schwann cells of various demyelinating neuropathies express the paracrine growth factor Neuregulin-1 type-I, which is undetectable in healthy nerves but essential for regeneration after acute nerve injury. We could demonstrate a correlation of Nrg1-I expression in Schwann cells with clinical and histological disease hallmarks in various genetically modified mouse models. Induction of glial Nrg1-I expression on a wildtype background induced symptoms reminiscent of a demyelinating neuropathy, whereas ablation of Nrg1 in Schwann cells of a CMT1A mouse model ameliorated neuropathological hallmarks. Especially, formation of onion bulbs, the key hallmark of CMT1A, could be attributed to Nrg1-I expression in Schwann cells. Furthermore, we showed that this is facilitated via the ErbB2/MEK/ERK signaling cascade. This study proposes a model in which the beneficial, transient upregulation of glial Nrg1-I after acute nerve injury turns into a detrimental constantly active repair-response, due to functional loss of axonal contact in CMT1A and supposedly in other demyelinating neuropathies. This putative common pathway in peripheral neuropathies might open up promising new therapeutic strategies that interfere with the Nrg/ErbB2/MEK/ERK pathway, especially since ErbB2 receptor inhibitors are already applied in breast cancer therapies.:Abbreviations ........................................................................................................................................... i 1 Introduction ..................................................................................................................................... 1 1.1 The central and peripheral nervous system .............................................................................1 1.2 Schwann cells and Myelination ................................................................................................3 1.3 Neuregulin ................................................................................................................................6 1.4 Acute injury of the peripheral nervous system and Wallerian degeneration ....................... 11 1.5 Diseases of the peripheral nervous system: Neuropathies ................................................... 12 1.6 Charcot-Marie-Tooth disease ................................................................................................ 13 2 Aims ............................................................................................................................................... 16 3 Material and methods ................................................................................................................... 17 3.1 Animal models ....................................................................................................................... 17 3.2 Genotyping ............................................................................................................................ 18 3.3 Phenotyping tests .................................................................................................................. 18 3.4 Histology ................................................................................................................................ 19 3.5 Molecular biology .................................................................................................................. 22 3.6 Material ................................................................................................................................. 26 4 Results ........................................................................................................................................... 29 4.1 Ablation of glial Neuregulin-1 improves the clinical phenotype in a mouse model of CMT1A ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 29 4.2 Overexpression of Neuregulin-1 type-I induces hallmarks of peripheral neuropathy ......... 34 4.3 Glial Neuregulin-1 type-I signaling promotes survival and attraction of Schwann cells ....... 36 4.4 Dedifferentiation promoting signaling pathways are induced by SC-Nrg1-I ........................ 40 5 Discussion ...................................................................................................................................... 45 6 Abstract ......................................................................................................................................... 50 7 Zusammenfassung ......................................................................................................................... 51 8 References ..................................................................................................................................... 52 9 Appendix .......................................................................................................................................... iii 9.1 List of figures ........................................................................................................................... iii 9.2 List of tables............................................................................................................................. iv 9.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit .......................................................... v Content 9.5 Publications ........................................................................................................................... viii

Die Behandlung von Patienten mit chronischen Schmerzen ist noch immer ein medizinisches Problem hoher Relevanz, da die bisher zur Verfügung stehenden Schmerzmittel nicht optimal für die Therapie chronischer Schmerzen geeignet sind und die Behandlungserfolge in vielen Fällen nicht befriedigend ausfallen. Daher ist die Entwicklung neuer Schmerzmittel speziell für die Behandlung chronischer Schmerzen unumgänglich. Mehrere experimentelle Studien haben gezeigt, dass die glycinerge Neurotransmission eine entscheidende Rolle bei der Modulation der Schmerzantwort einnimmt und daher ein vielversprechendes Ziel für die Behandlung chronischer Schmerzen darstellt. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten mit GlyT1-Inhibitoren wurde in diesem Projekt N,N-Diethylglycin (DEG), ein Metabolit des Propacetamols, hinsichtlich seines Effektes auf Glycintransporter (GlyTs) und Glycinrezeptoren (GlyRs) untersucht. Sollte DEG die glycinerge Neurotransmission effektiv beeinflussen und anti-allodynische/anti-hyperalgetische Eigenschaften in weiteren Versuchen zeigen, bestünde nicht nur die Möglichkeit der Weiterentwicklung des Propacetamols zur Behandlung chronischer neuropathischer Schmerzen, sondern es würde auch den Ansatz der Veränderung der herkömmlich genutzten Schmerzmittel durch Addition eines Effektors dieser neuen pharmakologischen Behandlungsstrategie bestätigen. In dieser Arbeit wurde die spezifische Wirkung des Propacetamols und seines Metaboliten DEG an GlyTs und GlyRs mittels eines elektrophysiologischen Ansatzes in Xenopus laevis Oozyten untersucht. Es wurde gezeigt, dass der nach Hydrolyse des Propacetamols entstehende aktive Metabolit DEG sowohl auf GlyT1 und GlyT2 substratartig als auch auf den GlyRα1 in partialagonistischer Form wirkt und damit eine Beeinflussung der glycinergen Neurotransmission in vitro möglich ist. In einem Nebenprojekt dieser Arbeit wurden zusätzlich mehrere humane GlyT1 Mutationen funktionell charakterisiert, die bei GlyT1-assoziierten Enzephalopathie Patienten identifiziert wurden und hier als ursächlich für die Erkrankung angesehen werden. Alle untersuchten Mutationen zeigten zumeist eine deutlich verringerte Aktivität, sowohl in ihrer maximalen Transportkapazität als auch Affinität für Glycin. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Mutationen im GlyT1 Gen in der Tat ursächlich für den Krankheitsphänotyp der GlyT1-assoziierten Enzephalopathie sind.:I Vorbemerkung ... 1 II Abstract ... 2 III Abkürzungsverzeichnis ... 3 IV Abbildungsverzeichnis ... 5 1 Einführung ... 6 1.1 Chronischer Schmerz und Schmerztherapie ... 6 1.2 Glycinerge Neurotransmission ... 9 1.3 Beeinflussung glycinerger Neurotransmission und therapeutische Nutzung ... 13 1.4 GlyT1 Enzephalopathie und Pathophysiologie ... 15 1.5 Methodik ... 19 1.6 Fragestellung ... 20 2 Publikation ... 21 3 Zusammenfassung ... 35 4 Literaturverzeichnis ... 39 5 Anhang ... 46 6 Darstellung des eigenen Beitrages ... 49 7 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ... 50 8 Lebenslauf ... 51 9 Danksagung ... 52

Die TIND (Treatment induced neuropathy of diabetes) ist eine iatrogene verursachte subakute smal fibre Neuropathie, die bei einer HbA1C-Senkung von mehr als 2 Prozentpunkten innerhalb 3 Monaten nach Therapiebeginn mit Insulin oder oralen Antidiabetika eintreten kann. Der Verlauf ist selbstlimitierend. In der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob sich bei Diabetikern mit hohem HbA1C unter rascher und starker HbA1C–Senkung durch antidiabetische Therapien eine TIND durch verschiedene klinische oder elektrophysiologische Parameter nachweisen lässt. Dabei wurde eine Verschlechterung der Parameter nach 3 Monaten unter rascher Blutzuckersenkung erwartet. Es erfolgte im Rahmen der Studie eine Ermittlung des klinischen Untersuchungsbefundes durch NES (Neurological examination score) und der Symptome durch NSS (Neurological symptomatic score), die sich als nicht ausreichend sensitiv darstellten. Auch Patienten mit einem drastischen HbA1C-Abfall gaben subjektiv nach 3 Monaten eine Besserung der sowohl autonomen als auch neuropathischen Beschwerden an. Dies lässt vermuten, dass die TIND subjektiv nicht wahrgenommen wird, und verdeutlicht den hohen Stellenwert elektrophysiologischer Parameter zur Erfassung und Objektivierung einer TIND. Die TIND kann sich sowohl durch eine periphere als auch autonome small fibre Neuropathie präsentieren. Für die Objektivierung wurden verschiedene elektrophysiologische Tests durchgeführt. Eine autonome Neuropathie kann sich durch eine verminderte Herzfrequenzvariabilität, Pathologien in der Pupillographie, verminderte Schweißsekretion oder verlängerte Latenz-gemessen durch den quantitativen sudomotorischen Axonreflex- QSART, sowie einer verlängerten Latenz, oder Ausfall des sympathischen Hautreflexes (SSR) zeigen. Zur genauen Untersuchung der Herzfrequenzvariabilität wurde die Herzleistung durch eine Spektralanalyse und damit im VLF (Very low frequency) und LF (low frequency), sowie HF (high frequency) ermittelt. Eine von der maximal erreichbaren Herzfrequenzhöhe unabhängige Bewertung erfolgte durch den RMSSD-Parameter (Root Mean Square of successive differences). Weiterhin wurden kardiovaskulärer autonome Reflextests (CARTs) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei der Messung der Herzfrequenzvariabilität, insbesondere der Herzleistung im VLF, LF sowie den CARTs (30:15-ratio, Valsalva-Ratio, Expiration/Inspiration-Ratio (E/I)) einer TIND erwartete Verläufe dargestellt werden konnten. Bei der Herzleistung im VLF und der E/I-Ratio fanden sich auch signifikante Ergebnisse. Bei RMSSD und der Herzleistung in HF sind hingegen keine zu erwartenden Veränderungen gefunden worden. Bei der Pupillographie war bei der Messung des Pupillendurchmessers in der Dunkelheit und der Pupillenlichtreaktion (Parameter Konstriktionslatenz) ebenfalls eine signifikante Verschlechterung als Hinweis auf die Entwicklung einer TIND nachweisbar. Weitere Parameter der Pupillenlichtreaktion wie die Konstriktionsgeschwindigkeit zeigte nur eine Tendenz zur Verschlechterung. Die Reflexamplitude zeigte hingegen keine zu erwartende Änderung. Des Weiteren konnte bei der Messung der Vibrations-, Temperaturschmerz- und Wärmempfindungsschwelle der Verlauf einer TIND nicht gezeigt werden. Tendenzielle Ergebnisse waren bei der Kälteempfindungsschwelle messbar. Die Latenz des SSRs konnte ebenfalls keine TIND nachweisen. Bei der Erhebung der Schweißrate und der Latenz der Schweißproduktion im Rahmen des QSARTs konnte bei der Wertung von ausgefallenen Antworten bei einzelnen Probanden eine TIND ausgemacht werden. Insgesamt waren erwartete Verschlechterungen bei den VLF, LF, CARTS, Pupillendurchmesser, Konstriktionslatenz, -geschwindigkeit, sowie der Kälteempfindungsschwelle in den ersten 3 Monaten nach Behandlung nachzuweisen. Bei allen Parametern kam es zudem nach 6 Monaten zu einer Verbesserung. Damit konnte der selbstlimitierte Verlauf der TIND, der in der Literatur beschrieben wurde, ebenfalls nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Pilotstudie müssen aufgrund der kleinen Stichprobe vorsichtig bewertet werden. Aufgrund einer überraschend niedrigen Adhärenz wurde die Stichprobe zusätzlich limitiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen für Folgestudien, dass ein Untersuchungszeitraum von 1 Jahr mit insgesamt 4 Untersuchungszeitpunkten für die Bewertung von TIND typischen Verläufen erforderlich ist. Dabei können die folgenden Parameter für eine Folgeuntersuchung vorgeschlagen werden: Die Herzleistung in VLF und LF, sowie die CARTs, der Pupillendurchmesser, die Konstriktionslatenz-, Konstriktionsgeschwindigkeit, die Kälteempfindungsschwelle, sowie der QSART. Eine statistische Hochrechnung ergab beispielsweise bei der 30:15-Ratio einen geforderten Einschluss von 500 Probanden, um einen minimalen klinisch wichtigen Unterschied (MCID) darstellen zu können. Um diese Anzahl zu erreichen, wäre eine multizentrische Studie erforderlich.:Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Einordnung der Neuropathien 1 1.2 Die behandlungsinduzierte diabetische Neuropathie (TIND) 3 1.2.1 Symptomatik der TIND 4 1.2.2 Diagnostik der TIND 6 1.2.2.1 HbA1C-Wert 7 1.2.2.2 Messung autonomer Funktionsstörungen 7 1.2.2.3 Messung peripherer Nervenfunktionen 12 1.2.2.4 Untersuchungsscores 13 2 Fragestellung der Arbeit 15 3 Patienten und Methoden 16 3.1 Studienpopulation 16 3.1.1 Rekrutierung der Probanden 16 3.1.2 Flussdiagramm der Probanden 16 3.1.3 Studiendesign 18 3.2 Die Untersuchungen 19 3.2.1 Herzfrequenzvariabilität 19 3.2.2 Pupillographie 19 3.2.3 Sympathischer Hautreflex 19 3.2.4 Quantitative sudomotorische Axonreflextest 20 3.2.1 Vibratometrie und Thermographie 20 3.2.2 NSS und NES 20 3.2.3 Laborwerte 21 3.2.4 Verwendete Geräte 22 3.3 Statistische Auswertung der Studie 24 4 Auswertung der Ergebnisse 25 4.1 HbA1C-Wert 26 4.2 Autonome Funktionsmessungen 28 4.2.1 Herzfrequenzvariabilität 28 4.2.1.1 Root Mean Square of successive differences (RMSSD) 28 4.2.1.2 Spektralanalyseparameter 29 4.2.1.3 30:15-Ratio 32 4.2.1.4 E/I-Ratio 33 4.2.1.5 Valsalva-Ratio 34 4.2.2 Pupillographie 35 4.2.2.1 Mittlerer Pupillendurchmesser 35 4.2.2.2 Parameter des Pupillenlichtreflexes 37 4.2.3 SSR 39 4.2.3.1 SSR der oberen Extremität 40 4.2.3.2 SSR der unteren Extremität 42 4.2.4 Quantitative sudomotorischer Axonreflex 43 4.2.4.1 Latenz (/min) 44 4.2.4.2 Die Schweißrate (nl/min) 45 4.3 Periphere Funktionsmessungen 46 4.3.1 Vibrationsempfinden 46 4.3.1.1 Vibrationsschwelle (μm) dorsal metatarsal 2-3 46 4.3.1.2 Vibrationsschwelle (μm) palmar 2-3 metatarsal 47 4.3.2 Temperaturempfinden 48 4.3.2.1 Kälteempfinden 48 4.3.2.2 Wärmeempfinden 50 4.4 Ergebnisse des Fragebogens und der klinischen Untersuchung 53 4.4.1 NSS 53 4.4.2 NES 54 4.5 Korrelationsanalyse der Parameter 55 5 Diskussion 56 5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 56 5.2 Interpretation der Ergebnisse 60 5.2.1 HbA1C-Wert 60 5.2.2 Überprüfung autonomer Funktionen 61 5.2.2.1 Herzfrequenzvariabilität (HRV) 61 5.2.2.2 Kardiovaskuläre Reflextests (CARTs) 66 5.2.2.3 Pupillographie 69 5.2.2.4 SSR 74 5.2.2.5 Quantitativer sudomotorische Axonreflextest 77 5.2.3 Überprüfung peripherer Funktionen 79 5.2.3.1 Vibratometrie 79 5.2.3.2 Thermographie 80 5.2.4 Überprüfung der Fragebögen 83 5.2.4.1 NSS 83 5.2.4.2 NES . 85 5.3 Ausblick 87 5.3.1 Hindernisse bei der Patientenrekrutierung 87 5.3.1.1 Vorschläge zur Optimierung der Rekrutierung 88 5.3.2 Parameter für die Folgestudie 88 5.3.2.1 Anpassung an größere Stichproben 89 6 Zusammenfassung . 92 7 Literaturverzeichnis IX 8 Tabellenverzeichnis XIX 9 Abbildungsverzeichnis XX 10 Diagrammverzeichnis XXI 11 Anhang XXII 11.1 NSS-Score XXII 11.2 NES-Score XXIII 11.3 Plakat für den Diabetikertag 2019 XXIV 11.4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XXV 11.5 Danksagung XXVI

Le diabète, caractérisé notamment par une atteinte neuro-vasculaire, représente aujourd’hui un réel problème de santé publique. Cependant plus de 30% des patients, ne peuvent bénéficier des traitements actuels (chirurgie et pharmacothérapie) d’où, la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. L’objectif de ce travail a été de caractériser un modèle murin de neuro-angiopathie diabétique, représentatif de la pathologie humaine puis, d’évaluer les effets des molécules guidance neuronale dans la récupération de la fonction neuro-vasculaire. Dans un premier temps, nous avons mis en place un modèle et des techniques exploratoires de l’étude de la fonction neuro-vasculaire chez les souris diabétiques. Nous avons observé que suite à l’ischémie du membre inférieur, la revascularisation est altérée chez les animaux diabétiques par comparaison aux animaux non-diabétiques. A ce défaut de la fonction vasculaire, s’ajoute également un défaut de la fonction nerveuse. En effet, les paramètres électrophysiologiques, le flux sanguin nerveux, le nombre de capillaires dans le nerf sciatique et la régénération nerveuse sont fortement impactés chez les animaux diabétiques. Afin de palier au défaut de revascularisation et/ou de régénération nerveuse, nous avons proposé que le ciblage thérapeutique des molécules de guidance neuronale, éphrine-B2 et Sémaphorine-3A (Séma-3A) améliorerait la fonction neuro-vasculaire. Après ischémie, les cellules mononuclées du sang périphérique (CM-SP) provenant de patients diabétiques ou de sujets contrôles, traitées préalablement avec l’éphrine-B2/Fc, ont été ensuite injectées aux animaux diabétiques. Une nette amélioration de la revascularisation a été observée dans les groupes d’animaux traités avec l’éphrine-B2/Fc par rapport aux animaux non-traités ou traités avec des CM-SP non stimulées. Enfin, nous avons administré un inhibiteur de Séma-3A, SM-345431 (Vinaxanthone) à des animaux contrôles et diabétiques après ischémie du membre inférieur. Ce qui nous a permis de montrer que cette inhibition améliore significativement la revascularisation et régule notamment la voie de signalisation des MAPK, Erk1/2 et p38 ainsi que, les niveaux de VEGF et de TGF-β1. Dans l’ensemble, l’effet sur la fonction nerveuse périphérique n’a pas montré de différences majeures entre les groupes traités et non-traités. En somme, nos travaux ont permis de montrer que la thérapie cellulaire utilisant les CM-SP stimulées avec l’éphrine-B2/Fc, ou bien l’injection intramusculaire d’un inhibiteur de Séma-3A, à visée pro-angiogénique et/ou pro-neurorégénérative, apparaît comme une stratégie prometteuse et susceptible d’améliorer la qualité de vie des malades atteints de diabète. / Diabetes, characterized by neuro-vascular damages, is a real public health problem. More than 30% of diabetic patients can benefit from existing therapies (surgery and drug therapy), therefore, the need to develop new innovative therapeutic approaches. The objective of this work was to characterize a diabetic neuro-angiopathy mouse model, reproducible of human pathology and to assess the effects of neuronal guidance molecules in recovery of the neuro-vascular function. Firstly, we characterized a model and exploratory techniques to study the neuro-vascular functions in diabetic mice. After hindlimb ischemia induction, we observed that revascularization were impaired in diabetic animals compared to non diabetic animals. This alteration is associated of the nerve function defect. Indeed, the electrophysiological parameters, nerve blood flow, the number of capillaries in sciatic nerve and nerve regeneration are strongly affected in diabetic animals. Then, to rescue the revascularization or nerve regeneration, we proposed that the therapeutic targeting of molecules of neuronal guidance, ephrin-B2 and Semaphorin-3A (Sema-3A) would improve neuro-vascular functions. After ischemia induction, peripheral mononuclear blood mononuclear cells (PBMNC) from diabetic patients or subjects controls, pre-treated with ephrin-B2/Fc, were then injected in diabetic animals. A significant improvement of revascularization was observed in both groups, animals treated with ephrin-B2/Fc compared to untreated animals or treaties with PBMNC unstimulated. Finally, after hindlimb ischemia, we administrated a pharmacological inhibitor of Sema-3A, the SM-345431 (Vinaxanthone) in diabetic and control animals. We showed this selective inhibition significantly improved the post-ischemic revascularization, regulates the MAPK Erk1/2 and p38 signaling pathway, increased the levels of CXCL12, VEGF and TGF-β1. In our experiment conditions, we did not observe the significant effects of SM-345431 on peripheral nerve function between treated and untreated animal groups. Finally, our work showed that cell therapy using PBMNC stimulated with ephrin-B2/Fc, or the intramuscular injection of Sema-3A inhibitor referred to pro-angiogenic and/or pro-neuroregenerative, appears as a strategy promising and likely to improve the quality of life of diabetic patients.

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative. / Human sensory and autonomic neuropathy type 2 (HSNA2) is a rare human hereditary pathology characterized by an early onset severe sensory loss (for all modalities) in the distal limbs. It is due to autosomal recessive mutations confined to exon HSN2 of the WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1) serine-threonine kinase; the specific exon confers nervous system specificity to target isoform WNK1/HSN2. While this kinase is widely studied in the kidneys, little is known about its role in the nervous system. Due to its role in HSAN type 2, we hypothesized that the truncating mutations present in the HSN2 exon lead to a loss-of-function of the WNK1 kinase, impairing development of the peripheral sensory system. In order to investigate the mechanisms by which the lack of the WNK1/HSN2 isoform acts to cause HSAN type 2, we examined its expression pattern in our zebrafish model and observed strong expression in neuromasts of the peripheral sensory lateral line system. We then knocked down the HSN2 exon in zebrafish embryos using antisense morpholino oligonucleotides. Our three approaches to knockdown the WNK1/HSN2 isoform led to embryos with a defective lateral line. In order to establish a pathogenic pathway involving the WNK1/HSN2 isoform, we investigated the reported interaction between the WNK1 kinase and neuronal potassium chloride co-transporter KCC2. This transporter is a target of WNK1 phosphorylation and also has a known role in promoting neurogenesis. We have also showed its expression in mature neuromasts of the posterior lateral line, and observed an increased expression of KCC2 in WNK1/HSN2 knockdown embryos by semi-quantitative RT-PCR, lending credence to our interaction hypothesis. Furthermore, overexpression of human KCC2 RNA in embryos led to an impaired mechanosensory lateral line system, phenocopying the WNK1/HSN2 knockdown. We then validated these results by obtaining double knockdown embryos, both for WNK1/HSN2 and KCC2, which alleviated the lateral line defect phenotype. These results led us to suggest a pathway in which WNK1/HSN2 is upstream of the KCC2 co-transporter. WNK1 is believed to regulate the level of activation, and possibly level of expression, of KCC2 and we therefore hypothesize that the loss-of-function of the specific isoform causes an imbalance in the levels of activated KCC2. This would then lead to decreased progenitor proliferation and hindered differentiation of neurons, causing the defects associated with HSAN type 2.

La Neuropathie à Axones Géants (NAG) est une maladie neurodégénérative rare et fatale caractérisée par une détérioration du système nerveux central et périphérique, impliquant les fonctions motrices et sensorielles. La détérioration massive du système nerveux est accompagnée d'une désorganisation générale des Filaments Intermédiaires ce qui la différencie de nombreuses maladies neurodégénératives où seuls les neurofilaments(NFs) sont affectés. La protéine déficiente, la gigaxonine, est la sous-unité d'une ubiquitine ligase E3, responsable de la reconnaissance spécifique des substrats MAP1B, MAP1S et TBCB, seuls connus à ce jour.Dans le but d'étudier le rôle de la gigaxonine sur la survie neuronale, la désorganisation du cytosquelette et d'avoir un modèle animal suffisamment fort pour envisager des tests thérapeutiques, j'ai caractérisé un modèle murin de NAG. Pour ce faire, j'ai réalisé une étude comportementale des fonctions motrices et sensorielles ainsi qu'une étude histopathologique. Les souris NAG (129/SvJ) développent un phénotype moteur modéré dès 60 semaines alors que les souris NAG (C57BL/6) présentent un phénotype sensoriel dès 60 semaines. Les données histopathologiques ne présentent pas de mort neuronale mais les NFs sont sévèrement altérés. Les NFs sont plus abondant, leur diamètre est augmenté et leur orientation hétérogène, comme c'est observé chez les patients NAG.Nos résultats montrent que l'absence de gigaxonine induit un phénotype moteur et sensoriel modéré mais par contre reproduit la désorganisation massive des NFs observée chez les patients. Ce modèle va nous permettred'étudier le rôle de la gigaxonine, une ligase E3, sur l'organisation des NFs et ainsi comprendre les processus pathologiques impliqués dans d'autres maladies neurodégénératives caractérisée par une accumulation des NFs et un dysfonctionnement du système ubiquitine-protéasome comme les maladies d'Azheimer, de Parkinson etd'huntington ou la sclérose latérale amyotrophique. / Giant Axonal Neuropathy (GAN) is a rare and fatale neurodegenerative disorder characterized by a deterioration of the peripheral and central nervous system. The broad deterioration of the nervous system is accompanied with a general disorganization of the Intermediate Filaments which makes it different from other neurodegenerative disorders wherein only neurofilaments (NFs) are affected. The defective protein, gigaxonin, is the substrate adaptator of an E3 ubiquitin ligase, in charge of the specific recognition of MAP1B, MAP1S and TBCB. In order to study the role of gigaxonin on neuronal survival, the cytoskeleton disorganization and to have a relevant GAN animal model to evaluate efficacy of GAN treatments, I have characterized a GAN mouse model. I did a motor and sensory behavioural study and an histopathologic study. The GAN mice (129/SvJ) shown mild motordeficits starting at 60 weeks of age while sensory deficits were evidenced in C57BL/6 GAN mice. No apparent neurodegeneration was evidenced in GAN mice, but dysregulation of NFs was massive. NFs were more abundant, they shown the abnormal increased diameter and misorientation that are characteristics of the human pathology. Our results show that gigaxonin depletion induces mild motor and sensory deficits but recapitulates the severe NFs dysregulation seen in patients. Our model will allow us to study the role of the gigaxonin-E3 ligase in organizing NFs and understand the pathological processes engaged in other neurodegenerative disorders characterized by accumulation of NFs and dysfunction of the Ubiquitin Proteasome System, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis, Huntington's, Alzheimer's and Parkinson's diseases.

Le diabète, caractérisé notamment par une atteinte neuro-vasculaire, représente aujourd’hui un réel problème de santé publique. Cependant plus de 30% des patients, ne peuvent bénéficier des traitements actuels (chirurgie et pharmacothérapie) d’où, la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. L’objectif de ce travail a été de caractériser un modèle murin de neuro-angiopathie diabétique, représentatif de la pathologie humaine puis, d’évaluer les effets des molécules guidance neuronale dans la récupération de la fonction neuro-vasculaire. Dans un premier temps, nous avons mis en place un modèle et des techniques exploratoires de l’étude de la fonction neuro-vasculaire chez les souris diabétiques. Nous avons observé que suite à l’ischémie du membre inférieur, la revascularisation est altérée chez les animaux diabétiques par comparaison aux animaux non-diabétiques. A ce défaut de la fonction vasculaire, s’ajoute également un défaut de la fonction nerveuse. En effet, les paramètres électrophysiologiques, le flux sanguin nerveux, le nombre de capillaires dans le nerf sciatique et la régénération nerveuse sont fortement impactés chez les animaux diabétiques. Afin de palier au défaut de revascularisation et/ou de régénération nerveuse, nous avons proposé que le ciblage thérapeutique des molécules de guidance neuronale, éphrine-B2 et Sémaphorine-3A (Séma-3A) améliorerait la fonction neuro-vasculaire. Après ischémie, les cellules mononuclées du sang périphérique (CM-SP) provenant de patients diabétiques ou de sujets contrôles, traitées préalablement avec l’éphrine-B2/Fc, ont été ensuite injectées aux animaux diabétiques. Une nette amélioration de la revascularisation a été observée dans les groupes d’animaux traités avec l’éphrine-B2/Fc par rapport aux animaux non-traités ou traités avec des CM-SP non stimulées. Enfin, nous avons administré un inhibiteur de Séma-3A, SM-345431 (Vinaxanthone) à des animaux contrôles et diabétiques après ischémie du membre inférieur. Ce qui nous a permis de montrer que cette inhibition améliore significativement la revascularisation et régule notamment la voie de signalisation des MAPK, Erk1/2 et p38 ainsi que, les niveaux de VEGF et de TGF-β1. Dans l’ensemble, l’effet sur la fonction nerveuse périphérique n’a pas montré de différences majeures entre les groupes traités et non-traités. En somme, nos travaux ont permis de montrer que la thérapie cellulaire utilisant les CM-SP stimulées avec l’éphrine-B2/Fc, ou bien l’injection intramusculaire d’un inhibiteur de Séma-3A, à visée pro-angiogénique et/ou pro-neurorégénérative, apparaît comme une stratégie prometteuse et susceptible d’améliorer la qualité de vie des malades atteints de diabète. / Diabetes, characterized by neuro-vascular damages, is a real public health problem. More than 30% of diabetic patients can benefit from existing therapies (surgery and drug therapy), therefore, the need to develop new innovative therapeutic approaches. The objective of this work was to characterize a diabetic neuro-angiopathy mouse model, reproducible of human pathology and to assess the effects of neuronal guidance molecules in recovery of the neuro-vascular function. Firstly, we characterized a model and exploratory techniques to study the neuro-vascular functions in diabetic mice. After hindlimb ischemia induction, we observed that revascularization were impaired in diabetic animals compared to non diabetic animals. This alteration is associated of the nerve function defect. Indeed, the electrophysiological parameters, nerve blood flow, the number of capillaries in sciatic nerve and nerve regeneration are strongly affected in diabetic animals. Then, to rescue the revascularization or nerve regeneration, we proposed that the therapeutic targeting of molecules of neuronal guidance, ephrin-B2 and Semaphorin-3A (Sema-3A) would improve neuro-vascular functions. After ischemia induction, peripheral mononuclear blood mononuclear cells (PBMNC) from diabetic patients or subjects controls, pre-treated with ephrin-B2/Fc, were then injected in diabetic animals. A significant improvement of revascularization was observed in both groups, animals treated with ephrin-B2/Fc compared to untreated animals or treaties with PBMNC unstimulated. Finally, after hindlimb ischemia, we administrated a pharmacological inhibitor of Sema-3A, the SM-345431 (Vinaxanthone) in diabetic and control animals. We showed this selective inhibition significantly improved the post-ischemic revascularization, regulates the MAPK Erk1/2 and p38 signaling pathway, increased the levels of CXCL12, VEGF and TGF-β1. In our experiment conditions, we did not observe the significant effects of SM-345431 on peripheral nerve function between treated and untreated animal groups. Finally, our work showed that cell therapy using PBMNC stimulated with ephrin-B2/Fc, or the intramuscular injection of Sema-3A inhibitor referred to pro-angiogenic and/or pro-neuroregenerative, appears as a strategy promising and likely to improve the quality of life of diabetic patients.