Durante situações aversivas, como choque nas patas, imobilidade ou restrição dos movimentos, há um aumento nos níveis de acetilcolina no hipocampo de ratos. Além disso, o aumento desse neurotransmissor está envolvido com a modulação comportamental do MCC, principalmente em sua porção dorsal, HD. Diante disso, é proposto neste estudo que os receptores muscarínicos presentes no HD de ratos, modulam a expressão da REC, no modelo do MCC. Ratos wistar foram submetidos às sessões de condicionamento aversivo contextual, sendo divididos nos grupos: condicionado (6 choques de 3s; 1,5 mA) e não condicionado (sem choques) . Quarenta e oito horas após esta sessão foram avaliadas a comportamental (congelamento) e respostas autonômicas (PAM, FC e queda da TC). Além disso, foi verificada a distribuição de receptores M1 e M3 nas subáreas do HD e a quantificação dos mesmos em animais condicionados, não condicionados e naive, 48 após a sessão de condicionamento. A microinjeção bilateral de hemicolínio, inibidor da captação de colina, no HD promoveu uma redução do tempo de congelamento durante a reexposição ao contexto aversivo, caracterizando um efeito do tipo ansiolítico. Além disso, este tratamento inibiu o aumento da PAM, FC e a queda da TC induzidos pelo MCC. O mesmo ocorreu com a administração de atropina, antagonista não seletivo de receptores muscarínicos, de forma dose-dependente em todas as respostas observadas. Adicionalmente, a microinjeção de diferentes doses de J104129 fumarate bloquearam o tempo de congelamento (de forma dose-dependente, semelhante a atropina), a elevação da PAM, FC e a queda da TC durante a re-exposição ao contexto aversivo. Como o J104129 fumarate bloqueia receptores muscarínicos tanto M1 quanto M3, foi utilizado um antagonista de maior afinidade para receptores do tipo M1, pirenzepina. Todas as doses utilizadas de pirenzepina inibiram as respostas autonômicas, sem afetar o tempo de congelamento induzidos pelo MCC. A análise de imunofluorescência, por duplamarcação, mostrou que receptores M1 e M3 estão distribuídos nos mesmos compartimentos celulares nas subáreas do HD. A quantificação dos receptores 48 horas após o condicionamento evidencia apenas o aumento de receptores M3 no hipocampo de ratos, sem alteração na população de receptores M1. Com este conjunto de resultados podemos concluir que a ACh no HD é essencial para a expressão da REC. Especificamente, eles sugerem que os receptores muscarínicos do tipo M1 presentes nesta estrutura estão envolvidos com as respostas autonômicas e somente os receptores M3 participam das respostas comportamentais. / During aversive and stressful situations, such as footshock, stillness and restriction of movements, there is an increase in the levels of acetylcholine in rat hippocampus. Moreover, the increasing in the synaptic level of this neurotransmitter is involved with behavioral modulation of contextual fear conditioning (CFC), especially in the dorsal portion, DH. Therefore, this study investigated the involvement of muscarinic receptors in DH of rats in the expression of conditioned emotional response (CER) in the CFC. Moreover, we verified the expression of these receptors in the DH by double labeling immunofluorescence. Male Wistar rats were subjected to aversive contextual conditioning sessions and were divided into two groups: conditioned and unconditioned. Forty-eight hours after this session were evaluated autonomic (mean arterial pressure, MAP, heart rate, HR and tail temperature, TT) and behavioral (freezing) responses. Moreover, the distribution of M1/M3 receptors in subareas of DH was observed and the quantification of these receptors were performed 48 hours after the conditioning session in conditioned, unconditioned and naive animals. The bilateral microinjection of hemicholinium, inhibitor of choline reuptake, in DH, caused a decrease of freezing during re-exposure to the aversive context, featuring an anxiolytic-like effect. Furthermore, this treatment inhibited the increase in MAP, HR and TT drop by CFC. DH muscarinic receptors antagonism evoked by atropine, a non-selective muscarinic antagonist, reduced the freezing, in a dose-dependent manner. Similar reduction was observed in autonomic responses. The selective antagonism of M1/M3 receptors evoked by J104129 fumarate also reduced freezing, in a dose-dependent manner, when compared with control animals. The same effect was observed with autonomic responses in all the tested doses. As J104129 fumarate blocks both M1 muscarinic as M3 muscarinic, was used a higher-affinity M1 antagonist, pirenzepine. All doses inhibited cardiovascular responses and decrease the TT drop, without affecting the freezing induced by CFC. The immunofluorescence analysis revealed that M1 and M3 receptors are distributed in the same cellular compartments in DH. The quantification of receptors showed an increase of M3 receptors in rat hippocampus, while no change in the density of receptors M1 was detected. These findings support that cholinergic neurotransmission present in DH is involved with the expression of responses evoked by fear contextual conditioning, through muscarinic receptors activation. In particular, M3 muscarinic receptors modulate behavioral responses, M1 and M3 muscarinic receptors modulate the autonomic responses.

A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório / Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

Os receptores nicotínicos são encontrados no Sistema Nervoso Central e exercem papel na modulação sináptica, na plasticidade neuronal e em diversas funções cognitivas. A diversidade dos receptores nicotínicos associada ao seu possível envolvimento em diferentes processos fisiológicos e patológicos vem sendo amplamente estudado. Vários estudos demonstraram que a administração de agonistas nicotínicos por via sistêmica, intratecal ou intracerebroventricular causa antinocicepção, sendo que este efeito parece depender da ativação de centros supraespinais. O presente estudo examinou o efeito da injeção sistêmica, da microinjção no núcleo pretectal anterior (NPtA) e na substância cinzenta periaquedutal ventrolateral (SCPvl) da epibatidina, um agonista de receptores nicotínicos neuronais, sobre a alodínia mecânica induzida por ligadura dos troncos dos nervos espinais L5 e L6. Também se avaliou o efeito da microinjeção de atropina ou mecamilamina sobre o efeito antinociceptivo induzido pela microinjeção de epibatidina na SCPvl e o efeito da mecamilamina sobre o efeito antialodínico observado após injeção sistêmica da epibatidina. Inicialmente se observou que a ligadura dos troncos L5 e L6 dos nervos espinais induz alodínia mecânica já no 2º dia após cirurgia, mantendo-se constante até pelo menos o 28º dia após a ligadura. Nenhuma alteração no limiar de resposta a estímulos mecânicos foi observada nos animais sham ou na pata contralateral. A injeção sistêmica (3,0 g/kg, i.p.) de epibatinida induz efeito antialodínico, porém essa mesma dose não altera o desempenho dos animais no teste do rota-rod. Além disso, a microinjeção na SCPvl, mas não no NPtA (0,3 g/0,3 L) de epibatidina induziu efeito antialodínico. Mecamilamina microinjetada na SCPvl aboliu o efeito antinociceptivo induzido pela epibatidina microinjetada neste mesmo núcleo e o efeito da epibatidina administrada por via sistêmica. Estes resultados permitem concluir que a injeção sistêmica e central de epibatidina induz efeito antialodínico no modelo de dor neuropática e esse efeito depende da interação dessa substância com receptores nicotínicos localizados na SCPvl. / Nicotinic receptors are found in the central nervous system (CNS) and have an important function in modulating neural synaptic, CNS plasticity and many others cognite functions. A variety of subtypes nicotinic receptores are related with phisiological and pathological process. Recentely, studies have been demostrating that nicotinic agonists injected either systemically ou centrally have an antinociceptive effetc. The present study examined; 1) the effect of epibatidene injected systemically and centrally into the anterior pretectal nucleus (APtN) and into the ventro lateral periaqueductal gray (vlPAG) on the mechanical allodinia induzed by ligation of trunk lombar (L5-L6) spinal nerve; 2) the effect of microinjection of nicotinic antagonist (atropine and mecamylamine) on the antinocicptive effect induzed by epibetidine microinjection into the vlPAG. 3) the effect of mecamylamine on the antiallodinic effect, observed after sistemic administration of epibatadine. It was demostrated that the ligation of trunk lombar (L5-L6) spinal nerve produce mechanical allodinia after two days pos-operative and it was maintained for 28 days. Shan group and the contralataeral paw had no change in the threshold response. Systemic injection of epibatidine (3,0 g/kg, i.p.) induzed antiallodinic effect, without affect motor function. Central injection of epibatidine into the vlPAG (0,3 g/0,3 L) also had an antiallodinic effect, but no effect on APtN was observed. Mecamylamine injected into the vlPAG abolish the antiallodinic effect of epibatidine injected systemic and centrally (vlPAG). These results shows that the epibatidine injected either systemically or into the vlPAG produced antiallodinic effect on the neuropatic pain model and also infer that this antiallodinic effect produced by epibatidine requires the interation of epibatidae with vlPAG nicotinic receptors.

Os receptores nicotínicos são encontrados no Sistema Nervoso Central e exercem papel na modulação sináptica, na plasticidade neuronal e em diversas funções cognitivas. A diversidade dos receptores nicotínicos associada ao seu possível envolvimento em diferentes processos fisiológicos e patológicos vem sendo amplamente estudado. Vários estudos demonstraram que a administração de agonistas nicotínicos por via sistêmica, intratecal ou intracerebroventricular causa antinocicepção, sendo que este efeito parece depender da ativação de centros supraespinais. O presente estudo examinou o efeito da injeção sistêmica, da microinjção no núcleo pretectal anterior (NPtA) e na substância cinzenta periaquedutal ventrolateral (SCPvl) da epibatidina, um agonista de receptores nicotínicos neuronais, sobre a alodínia mecânica induzida por ligadura dos troncos dos nervos espinais L5 e L6. Também se avaliou o efeito da microinjeção de atropina ou mecamilamina sobre o efeito antinociceptivo induzido pela microinjeção de epibatidina na SCPvl e o efeito da mecamilamina sobre o efeito antialodínico observado após injeção sistêmica da epibatidina. Inicialmente se observou que a ligadura dos troncos L5 e L6 dos nervos espinais induz alodínia mecânica já no 2º dia após cirurgia, mantendo-se constante até pelo menos o 28º dia após a ligadura. Nenhuma alteração no limiar de resposta a estímulos mecânicos foi observada nos animais sham ou na pata contralateral. A injeção sistêmica (3,0 g/kg, i.p.) de epibatinida induz efeito antialodínico, porém essa mesma dose não altera o desempenho dos animais no teste do rota-rod. Além disso, a microinjeção na SCPvl, mas não no NPtA (0,3 g/0,3 L) de epibatidina induziu efeito antialodínico. Mecamilamina microinjetada na SCPvl aboliu o efeito antinociceptivo induzido pela epibatidina microinjetada neste mesmo núcleo e o efeito da epibatidina administrada por via sistêmica. Estes resultados permitem concluir que a injeção sistêmica e central de epibatidina induz efeito antialodínico no modelo de dor neuropática e esse efeito depende da interação dessa substância com receptores nicotínicos localizados na SCPvl. / Nicotinic receptors are found in the central nervous system (CNS) and have an important function in modulating neural synaptic, CNS plasticity and many others cognite functions. A variety of subtypes nicotinic receptores are related with phisiological and pathological process. Recentely, studies have been demostrating that nicotinic agonists injected either systemically ou centrally have an antinociceptive effetc. The present study examined; 1) the effect of epibatidene injected systemically and centrally into the anterior pretectal nucleus (APtN) and into the ventro lateral periaqueductal gray (vlPAG) on the mechanical allodinia induzed by ligation of trunk lombar (L5-L6) spinal nerve; 2) the effect of microinjection of nicotinic antagonist (atropine and mecamylamine) on the antinocicptive effect induzed by epibetidine microinjection into the vlPAG. 3) the effect of mecamylamine on the antiallodinic effect, observed after sistemic administration of epibatadine. It was demostrated that the ligation of trunk lombar (L5-L6) spinal nerve produce mechanical allodinia after two days pos-operative and it was maintained for 28 days. Shan group and the contralataeral paw had no change in the threshold response. Systemic injection of epibatidine (3,0 g/kg, i.p.) induzed antiallodinic effect, without affect motor function. Central injection of epibatidine into the vlPAG (0,3 g/0,3 L) also had an antiallodinic effect, but no effect on APtN was observed. Mecamylamine injected into the vlPAG abolish the antiallodinic effect of epibatidine injected systemic and centrally (vlPAG). These results shows that the epibatidine injected either systemically or into the vlPAG produced antiallodinic effect on the neuropatic pain model and also infer that this antiallodinic effect produced by epibatidine requires the interation of epibatidae with vlPAG nicotinic receptors.

Durante situações aversivas, como choque nas patas, imobilidade ou restrição dos movimentos, há um aumento nos níveis de acetilcolina no hipocampo de ratos. Além disso, o aumento desse neurotransmissor está envolvido com a modulação comportamental do MCC, principalmente em sua porção dorsal, HD. Diante disso, é proposto neste estudo que os receptores muscarínicos presentes no HD de ratos, modulam a expressão da REC, no modelo do MCC. Ratos wistar foram submetidos às sessões de condicionamento aversivo contextual, sendo divididos nos grupos: condicionado (6 choques de 3s; 1,5 mA) e não condicionado (sem choques) . Quarenta e oito horas após esta sessão foram avaliadas a comportamental (congelamento) e respostas autonômicas (PAM, FC e queda da TC). Além disso, foi verificada a distribuição de receptores M1 e M3 nas subáreas do HD e a quantificação dos mesmos em animais condicionados, não condicionados e naive, 48 após a sessão de condicionamento. A microinjeção bilateral de hemicolínio, inibidor da captação de colina, no HD promoveu uma redução do tempo de congelamento durante a reexposição ao contexto aversivo, caracterizando um efeito do tipo ansiolítico. Além disso, este tratamento inibiu o aumento da PAM, FC e a queda da TC induzidos pelo MCC. O mesmo ocorreu com a administração de atropina, antagonista não seletivo de receptores muscarínicos, de forma dose-dependente em todas as respostas observadas. Adicionalmente, a microinjeção de diferentes doses de J104129 fumarate bloquearam o tempo de congelamento (de forma dose-dependente, semelhante a atropina), a elevação da PAM, FC e a queda da TC durante a re-exposição ao contexto aversivo. Como o J104129 fumarate bloqueia receptores muscarínicos tanto M1 quanto M3, foi utilizado um antagonista de maior afinidade para receptores do tipo M1, pirenzepina. Todas as doses utilizadas de pirenzepina inibiram as respostas autonômicas, sem afetar o tempo de congelamento induzidos pelo MCC. A análise de imunofluorescência, por duplamarcação, mostrou que receptores M1 e M3 estão distribuídos nos mesmos compartimentos celulares nas subáreas do HD. A quantificação dos receptores 48 horas após o condicionamento evidencia apenas o aumento de receptores M3 no hipocampo de ratos, sem alteração na população de receptores M1. Com este conjunto de resultados podemos concluir que a ACh no HD é essencial para a expressão da REC. Especificamente, eles sugerem que os receptores muscarínicos do tipo M1 presentes nesta estrutura estão envolvidos com as respostas autonômicas e somente os receptores M3 participam das respostas comportamentais. / During aversive and stressful situations, such as footshock, stillness and restriction of movements, there is an increase in the levels of acetylcholine in rat hippocampus. Moreover, the increasing in the synaptic level of this neurotransmitter is involved with behavioral modulation of contextual fear conditioning (CFC), especially in the dorsal portion, DH. Therefore, this study investigated the involvement of muscarinic receptors in DH of rats in the expression of conditioned emotional response (CER) in the CFC. Moreover, we verified the expression of these receptors in the DH by double labeling immunofluorescence. Male Wistar rats were subjected to aversive contextual conditioning sessions and were divided into two groups: conditioned and unconditioned. Forty-eight hours after this session were evaluated autonomic (mean arterial pressure, MAP, heart rate, HR and tail temperature, TT) and behavioral (freezing) responses. Moreover, the distribution of M1/M3 receptors in subareas of DH was observed and the quantification of these receptors were performed 48 hours after the conditioning session in conditioned, unconditioned and naive animals. The bilateral microinjection of hemicholinium, inhibitor of choline reuptake, in DH, caused a decrease of freezing during re-exposure to the aversive context, featuring an anxiolytic-like effect. Furthermore, this treatment inhibited the increase in MAP, HR and TT drop by CFC. DH muscarinic receptors antagonism evoked by atropine, a non-selective muscarinic antagonist, reduced the freezing, in a dose-dependent manner. Similar reduction was observed in autonomic responses. The selective antagonism of M1/M3 receptors evoked by J104129 fumarate also reduced freezing, in a dose-dependent manner, when compared with control animals. The same effect was observed with autonomic responses in all the tested doses. As J104129 fumarate blocks both M1 muscarinic as M3 muscarinic, was used a higher-affinity M1 antagonist, pirenzepine. All doses inhibited cardiovascular responses and decrease the TT drop, without affecting the freezing induced by CFC. The immunofluorescence analysis revealed that M1 and M3 receptors are distributed in the same cellular compartments in DH. The quantification of receptors showed an increase of M3 receptors in rat hippocampus, while no change in the density of receptors M1 was detected. These findings support that cholinergic neurotransmission present in DH is involved with the expression of responses evoked by fear contextual conditioning, through muscarinic receptors activation. In particular, M3 muscarinic receptors modulate behavioral responses, M1 and M3 muscarinic receptors modulate the autonomic responses.

L’amygdale est une structure du système nerveux central impliquée dans l’intégration des émotions comme la peur et l’anxiété. Des études ont également montré que l’amygdale peut moduler de façon positive ou négative la douleur par le biais des projections de son noyau de sortie, le noyau central de l’amygdale (CeA), sur les structures impliquées dans les contrôles nociceptifs descendants. Le complexe basolatéral de l’amygdale (BLA), placé en amont du noyau central, est intimement connecté à ce dernier et peut ainsi réguler son fonctionnement. Les données obtenues au cours de ma thèse ont montré l’existence d’un contrôle tonique amygdalien de la nociception et de la douleur, directement dépendant de l’équilibre entre l’excitation et l’inhibition au sein de la structure. Ainsi la modulation de l’une ou l’autre des neurotransmission influence directement la sortie douloureuse, chez des animaux sains ou neuropathiques. Par ailleurs, nous nous sommes également intéressés à l’étude précise du mode d’action d’une molécule anxiolytique non benzodiazépinique, l’étifoxine (EFX), et à son effet sur le comportement douloureux. Les résultats des injections d’EFX dans le BLA indiquent qu’elle induit une action analgésique chez les animaux neuropathiques, mais ne modifie pas les seuils de sensibilité des animaux sains. Cette action analgésique est dépendante de l’effet indirect neurostéroïdogène de l’EFX. Ceci, associé au fait que l’EFX ne présente pas ou peu d’effets secondaires, en fait une molécule particulièrement intéressante pour un traitement alternatif des douleurs neuropathiques. Dans une dernière partie, nous avons cherché à observer les mécanismes en jeu au niveau cellulaire lorsque l’EFX est appliquée sur les neurones du BLA. Ainsi, nous avons montré que l’EFX potentialise l’inhibition au sein de la structure, via trois mécanismes indépendants ; l’augmentation de la fréquence des courants post-synaptiques inhibiteurs miniatures (mCPSIs), l’augmentation de leur amplitude, et l’augmentation de leur constante de déactivation. Ces deux derniers effets sont dépendants de l’action neurostéroïdogène de l’EFX, tandis que l’effet sur la fréquence des mCPSIs est du à l’action de l’EFX sur le récepteur GABAA. Les résultats de ma thèse ont ainsi permis de montrer l’existence d’un contrôle tonique amygdalien de la douleur, dans le cadre d’animaux neuropathiques, mais également de la nociception, chez des animaux sains. Par ailleurs, la place du complexe basolatéral de l’amygdale, souvent peu prise en compte dans les études sur la douleur, a été redéfinie. Ce complexe doit être pris en considération dans le circuit de la douleur et son rôle de pilote du noyau central de l’amygdale ne doit pas être négligé. / The amygdala is a major control center of the emotions, but also integrates sensory, especially nociceptive information. Cortical afferents to the amygdala largely target its basolateral complex. The basolateral amygdala (BLA) then projects to the central amygdala nucleus, which in turn projects densely to the periaqueductal gray and thus can drive a behavioural output via the spinal cord. Data obtained during my thesis have shown that the balance between excitation and inhibition in the BLA triggers an tonic control of pain. Therefore modulating one of the neurotransmission directly influences the pain threshold of control or nociceptive mice. My thesis work also focused on the functioning of an anxiolytic and non benzodiazepinic drug ; Etifoxin (EFX). This molecule as a positive modulator of GABAA receptors and indirectly by increasing the synthesis of neurosteroids, also known as strong modulator of these receptors. In our team, we already showed that EFX has anti-nociceptive effects when injected intraperitonealy in rats. Here we wanted to determine the action of EFX on pain descending control drive by BLA. We showed that EFX infusion in the BLA seems to be anti-nociceptive, inducing a recover of the pre-cuff mechanical threshold level. We also used a patch-clamp approach to study directly in vitro the modulation of the inhibitory synaptic transmission produced by EFX. We showed that EFX potentiate the inhibition in BLA neurons via different and complementary mechanisms. These potentiating effects are mostly dependent of a neurosteroidogenesis increase.

A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório / Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

Acid-sensing ion channels (ASIC) are a class of ligand gated plasma membrane ion channels that are activated by low extracellular pH. During ischemia, ASIC1a are activated and contribute to the demise of neurons. Pharmacological block of ASIC1a provides neuroprotection at delayed time points. However, no endogenous receptors have been implicated in the modulation of ASIC1a activity. The hypothesis presented is that sigma receptor activation inhibits ASIC1a function and ASIC1a-induced [Ca²?]i elevations during acidosis and ischemia, which may be a mechanism by which sigma ligands provide neuroprotection following stroke. This hypothesis is based on the following observations: First, sigma receptors regulate multiple ion channels that become activated during ischemia. Second, ASIC1a remain functionally active hours beyond the ischemic insult and sigma receptors have been shown to be neuroprotective at delayed time points following stroke. Ratiometric Ca²+ fluorometry and whole-cell patch clamp experiments showed that sigma-1 receptor activation depresses elevations in [Ca²+]i and membrane currents mediated by ASIC1a channels in cortical neurons. Furthermore, most of the elevations in [Ca²+]i triggered by acidosis are the result of Ca²+ channels opening downstream of ASIC1a activation. Stimulation of sigma-1 receptors effectively suppressed these secondary Ca²+ fluxes both by inhibiting ASIC1a and the other channels directly. The signaling cascade linking sigma-1 receptors and ASIC1a was determined to involve a pertussis toxin-sensitive G protein and A-Kinase Anchoring Protein 150/calcineurin complex, which resulted in a decrease of acid-induced [Ca²+]i elevations and ASIC1a-mediated currents. Furthermore, immunohistochemical studies confirmed that sigma-1 receptors, ASIC1a and AKAP150 colocalize in the plasma membrane of cortical neuron cell bodies and in the dendritic processes of these cells. Additionally, concurrent exposure to acidosis and ischemia resulted in synergistic potentiation of [Ca²+]i dysregulation. Although ASIC1a activation does not induce long-lived priming of synaptic vesicles for release, channel activation does have a temporal effect on ischemia-mediated [Ca²+]i increases after ischemia onset. Moreover, presynaptic ASIC1a channels promote synaptic transmission during ischemia by overcoming block of neurotransmission and thus enhance postsynaptic [Ca²+]i elevations. Sigma-1 receptor activation decreased ischemia-mediated Ca²+ dysregulation at pH values of 7.4 - 6.0 and prevented the synergistic interaction between ischemia and acidosis.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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