O principal objetivo deste trabalho é o de estabelecer uma estratégia confiável relacionada a genotoxicidade, proteção genômica e recombinação mitótica em Aspergillus nidulans. A genotoxicidade foi induzida por vapor de benzeno e, para testar a proteção genômica, a soja foi usada devido às suas propriedades anticarcinogênicas muito conhecidas. O principal resultado obtido foi que a soja transgênica mostrou maiores propriedades antigenotóxicas do que a soja tradicional. Isto foi duplamente confirmado, tanto através de estratégias de genética clássica, como molecular. Além disso, cada experimento foi repetido três vezes. Principais conclusões foram as seguintes: a) estabelecimento de um protocolo adequado para atender às complexidades dos eventos epigenéticos e, b) a aplicação desse tal protocolo e experimentos afins para testar outros agentes ambientais suspeitos de apresentarem propriedades antigenotóxicas, ou que precisem de sua identificação como tal. Evidentemente, levando-se em conta a grande preocupação relacionada aos alimentos transgênicos e aos muitos produtos de biotecnologia, que entram no mercado, o elenco de prováveis candidatos aos tipos de testes apresentados, será muito grande. Como os resultados obtidos sugerem íntima relação entre metilação de DNA eucariótico, a recombinação mitótica e outros eventos danosos às células, os eventos envolvidos serão epigeneticamente discutidos. / Main aim is to provide a reliable approach to deal with the aspects related to induced genotoxicity, genomic protection and eukaryotic mitotic recombination in Aspergillus nidulans. Genotoxicity was benzene fumes induced, and to test genomic protection soybean has been used on account of its putative anticarcinogenic properties. Main outcome is that transgenic soybean bears higher antigenotoxic properties than traditional soybean. This has been twofold confirmed through basic genetic approaches and molecular approaches, as well. In addition, each experimental approach has been three times repeated. Additional important outcomes are: a- establishment of a reliable protocol to deal with the complexities of the epigenetic events, and b- likely use of present protocol and experimental set-up to test other environmental agents of which antigenotoxic properties are either suspected, or need precise identification. Evidently, on account of present wide concern the transgenic foodstuffs, and many other biotechnological products, as well, are obvious candidates for similar approaches. Obtained results suggest close relationships among eukaryotic DNA methylation, mitotic recombination, and other cells damaging events reputedly leading to carcinogenesis.

O tratamento fotodinâmico antifúngico (APDT) é um método promissor que combina um fotossensibilizador não tóxico (FS), oxigênio e luz visível para provocar a morte seletiva das células microbianas. O desenvolvimento do APDT depende da identificação de FS que sejam eficazes para as diferentes espécies de patógenos. No presente estudo, as suscetibilidades, in vitro, de conídios de Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides (ambas são espécies fitopatogênicas) e Aspergillus nidulans ao APDT com quatro FS fenotiazínicos [azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e o novo fenotiazínico pentacíclico S137 (S137)] em combinação com a luz vermelha, foram investigadas. Nós também avaliamos a suscetibilidade dos conídios de C. acutatum e A. nidulans ao APDT com o psoraleno 8-metóxipsoraleno (8-MOP), com duas cumarinas (7- metoxicumarina e 5,7-dimetóxicumarina) e com uma furanocumarina (isopimpinelina) em combinação com a radiação solar. Ambas as cumarinas e a furanocumarinas foram extraídas, no presente trabalho, do limão Tahiti (Citrus latifolia). Os efeitos dos tratamentos com os diferentes FS nas folhas de laranja-pera (Citrus sinensis) também foram avaliados. O NMBN e o S137 foram os fenotiazínicos mais eficazes. Os APDT com o NMBN (50 ?M) e S137 (10 ?M) e dose de luz de 25 J cm-2 resultaram na redução de aproximadamente 5 logs na sobrevivência dos conídios das três espécies. O APDT com o 8-MOP e com as cumarinas resultaram em uma redução de aproximadamente 4 logs na sobrevivência dos conídios de C. acutatum e A. nidulans. O APDT com a furanocumarina foi menos efetivo e resultou em uma redução na sobrevivência dos conídios de aproximadamente dois logs para C. acutatum e de três logs para A. nidulans. Nenhum dano nas folhas foi observado quando os FS foram colocados na superfície adaxial das folhas. Os estudos histológicos mostraram que nenhum dos FS fenotiazínicos atravessou a cutícula das folhas. / Antifungal photodynamic treatment (APDT) is a promising method that combines a nontoxic photosensitizer (PS), oxygen and visible light to cause selective killing of microbial cells. The development of APDT depends on identifying effective PS for the different pathogenic species. In the present study, the in vitro susceptibilities of Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides (both are phytophatogenic species) and Aspergillus nidulans conidia to APDT with four phenothiazinium PS [methylene blue (MB), new methylene blue N (NMBN), toluidine blue O (TBO) and the novel pentacicyclic phenothiazinium S137 (S137)] in combination with red light were investigated. We also evaluated the susceptibilities of C. acutatum and A. nidulans conidia to APDT with the psoralen 8-methoxypsoralen (8-MOP), with two coumarins (7-methoxicoumarin and 5,7-dimethoxycoumarin) and one furanocoumarin (isopimpinelin) in combination with solar radiation. Both the coumarins and the furanocoumarin were extracted, in the present work, from Tahiti lemon (Citrus latifolia). The effects of the treatments with all the PS on Citrus sinensis leaves were also evaluated. NMBN and S137 were the more effective phenothiazinium PS. APDT with NMBN (50 ?M) and S137 (10 ?M) and light dose of 25 J cm-2 resulted in a reduction of approximately 5 logs in the survival of the conidia of the three species. APDT with 8-MOP and with the coumarins resulted in a reduction of approximately 4 logs in the survival of C. acutatum and A. nidulans conidia. APDT with the furanocumarin was less effective and resulted in the reduction of approximately 2 logs for C. acutatum and 3 logs for A. nidulans. No damages to the leaves were observed when the PS were spotted on the adaxial surface of the leaves and the plants were exposed to solar radiation. Histological studies showed that the phenothiazinium PS did not cross the leave cuticle.

O complexo Mre11 (Mre11/Rad50/Nbs1) é uma componente chave da resposta celular ao dano ao DNA em humanos e recentes observações sugerem que estas proteínas são em parte responsáveis pela interface ente o ensoreamento do dano ao DNA, seu reparo e as funções das proteínas envolvidas nos pontos de checagem do ciclo celular. Em Aspergillus nidulans, a partir de um screening para o isolamento de letais sintéticos na ausência de dineína, o gene sldIRAD50 foi clonado como um desses letais sintéticos através da complementação do fenótipo de deficiência de conidiação do mutante. Foi identificada uma transversão G-C na posição 2509 (Ala-692-Pro) no mutante sldI1444 a qual está presente na região de dobradiça da proteína. Essa mutação causa sensibilidade a vários agentes mutagênicos. Uma linhagem mutante sldIRAD50::pyrG foi construída a qual apresentou também vários defeitos na reposta celular ao dano ao DNA incluindo sensibilidade a várias drogas mutagênicas, defeito no ponto de checagem de replicação do DNA e na viabilidade dos ascosporos. Além disso, o gene sldIRAD50 interage geneticamente com bimEAPC1 para o controle do spindle pole checkpoint durante a segregação cromossômica sugerindo um novo papel para o complexo Mre11. Em atuação paralela com o complexo Mre11, duas proteínas quinases ditas apicais, ATM e ATR coordenam a transdução do sinal do dano ao DNA para proteínas efetoras do reparo. A proteína ATM está mutada na síndrome de instabilidade cromossômica herdada Ataxia Telangiectasia. Para a caracterização do homologo de ATM em A. nidulans AtmA, uma linhagem mutante atmAATM foi isolada. Esse mutante apresentou falha na reposta ao dano ao DNA, como seus homólogos em vários outros organismos mostrando defeitos no ponto de checagem intrafase S e G2/M, além de sensibilidade a camptothecin e bleomicina. Ainda, o extrato protéico bruto desse mutante não foi capaz de fosforilar o homologo de NBS1 em A. nidulans, ScaA. Além das conhecidas funções de ATM na resposta ao dano ao DNA, foi verificado que o mutante atmAATM apresentou uma acelerada cinética de divisão nuclear e severos defeitos no estabelecimento e manutenção do eixo de crescimento polarizado, evidenciando uma função ainda não descrita para ATM no crescimento polar. Provavelmente, AtmA regula a função e/ou localização de proteínas chaves para a formação do eixo de polarização. Diante disso, para investigar as vias metabólicas que são controladas por esse gene, o perfil transcricional do mutante atmAATM, em comparação com a linhagem selvagem foi verificado em diferentes condições de crescimento. Os resultados indicaram um importante papel da via das pentoses fosfato na proliferação celular monitorada pela AtmA. Além disso, foram identificados vários genes com a expressão do mRNA diminuída envolvidos no crescimento polarizado, na síntese de ácido fosfatídico e de ergosterol e no tráfico intracelular, secreção e transporte vesicular. Buscando identificar genes que participam da resposta celular ao dano ao DNA causado pela droga anti topoisomerase I, camptothecin, foram utilizados filtros de macroarray de A. nidulans contendo 2787 genes deste organismo para monitorar a expressão gênica da linhagem selvagem e do mutante uvsBATR, num experimento de indução com CPT por 30, 60 e 120 minutos. Os resultados revelaram um total de 1512 e 1700 genes modulados na linhagem selvagem e uvsBATR respectivamente, em pelo menos um ponto experimental. Seis desses genes que apresentaram aumento da expressão de mRNA na linhagem selvagem e diminuição da linhagem uvsBATR foram caracterizados: fhdA (que codifica para uma proteína com domínio fork-head associated), tprA (uma proteína hipotética que apresenta o domínio tetratrico peptide repeat), mshA (um homólogo MutS6 envolvido em mismatch repair), phbA (um homólogo da prohibitina), uvsCRAD51 e cshA (homólogo da proteína CSB envolvida no reparo por excisão de nucleotídeos e ligada a Síndrome de Cockayne). A indução transcricional desses genes na presença de CPT requer a função de uvsBATR. Estes genes foram deletados e surpreendentemente apenas uvsCRAD51 apresentou sensibilidade a CPT, enquanto os outros mostraram sensibilidade a outros agentes que causam dano ao DNA e estresse oxidativo. Além disso, com exceção de uvsCRAD51, a deleção desses genes leva a supressão parcial da sensibilidade a menadiona e paraquat do mutante uvsBATR. Esses resultados indicaram um comportamento heterogêneo de sensibilidade durante o crescimento na presença de agentes que causam dano direto ou indireto ao DNA, evidenciando que o perfil transcricional não é determinante para predizer a função de um gene na proteção da célula a determinada droga que causa dano ao DNA. / The Mre11 protein complex (Mre11/Rad50/Nbs1) has emerged as a central component in the human cellular DNA damage response, and recent observations suggest that these proteins are at least partially responsible for the linking of DNA damage detection to DNA repair and cell cycle checkpoint functions. In Aspergillus nidulans, the sldI1444D mutant was isolated in a screen for dynein synthetic lethals. The sldIRAD50 gene was cloned by complementation of the sporulation deficiency phenotype of this mutant. A transversion G-C at the position 2509 (Ala-692-Proamino acid change) in the sldI1444D mutant causes sensitivity to several DNAdamaging agents. The mutation sldI1 occurs at the CXXC hinge domain of Rad50. An inactivation strain sldIRAD50::pyrG was constructed. Besides sensitivity to a number of DNA-damaging agents, this deletion strain was also impaired in the DNA replication checkpoint response and in ascospore viability. Also, sldIRAD50::pyrG geneticaly interacted with bimEAPC1, acting in the spindle pole checkpoint control during segregation, suggesting a new possible role of Mre11 complex. In parallel to the Mre11 complex, two apical quinases ATM and ATR respond to DNA damage and transduce the signal to effector proteins. In humans, mutations in ATM cause the devastating neurodegenerative disease Ataxia Telangiectasia. Here we characterized the homolog of ATM (AtmA) in the filamentous fungus A. nidulans. The deletion strain atmA presented defects in the DNA damage response as previously shown in other model organisms including intra S-phase and G2/M checkpoint defects, sensitivity to camptothecin and bleomycin. Also, the crude extract from the mutant strain did not phosphorylate the NBS1 homologue ScaA. In addition to its expected role in the DNA damage response, the atmA mutant showed increased nuclear division kinetics and severe defects in polarized hyphal growth, indicating a novel feature for the ATM gene. Probably, AtmA regulates the function and/or localization of landmark proteins required for the formation of a polarity axis. We extended these studies by investigating which pathways are controlled by AtmA during proliferation and polar growth by comparatively determining the transcriptional profile of A. nidulans wild type and atmA mutant strains in different growth conditions. Our results indicated an important role of the pentose phosphate pathway in the fungal proliferation during endogenous DNA damage and polar growth monitored by the AtmA kinase. Furthermore, we identified several genes that have decreased mRNA expression in the atmA mutant that are involved in the formation of polarized hyphae and control of polar growth; in the biosynthesis of phosphatidic acid and ergosterol; and intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport. In order to identify genes that responded to the DNA damage mediated by the anti- toposomerase I drug, camptothecin, we used an A. nidulans macroarray carrying sequences of 2,787 genes from this fungus to monitor gene expression of both wild-type and uvsBATR in a time-point experiment where mycelium was exposed to 60, 90 and 120 minutes to the drug. The results revealed a total of 1,512 and 1,700 genes in the wild-type and uvsBATR deletion mutant strain that displayed statistically significant difference in at least one experimental time-point. We characterized six genes that have increased mRNA expression in the presence of CPT in the wild-type strain relative to the uvsBATR mutant strain: fhdA (encoding a fork head associated domain protein), tprA (encoding a hypothetical protein that contains a tetratrico peptide repeat), mshA (encoding a MutS homologue involved in mismatch repair), phbA (encoding a prohibitin homologue), uvsCRAD51 (the homologue of the RAD51 gene), and cshA (encoding a homologue of the excision repair protein ERCC-6 [Cockaynes syndrome protein]). The induced transcript levels of these genes in the presence of CPT required uvsBATR. These genes were deleted, and surprisingly, only the uvsCRAD51 mutant strain was sensitive to CPT; however, the others displayed sensitivity to a range of DNA-damaging and oxidative stress agents. Moreover, with the exception of UvsC, deletion of each of these genes partially suppressed the sensitivity of the uvsB strain to menadione and paraquat. These results indicated a very complex and heterogeneous sensitivity behavior during growth in the presence of agents that directly or indirectly cause DNA damage and the transcriptional response to DNAdamaging agents does not necessarily identify the genes that protect against these agents.

No description available.

O tratamento fotodinâmico antifúngico (APDT) é um método promissor que combina um fotossensibilizador não tóxico (FS), oxigênio e luz visível para provocar a morte seletiva das células microbianas. O desenvolvimento do APDT depende da identificação de FS que sejam eficazes para as diferentes espécies de patógenos. No presente estudo, as suscetibilidades, in vitro, de conídios de Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides (ambas são espécies fitopatogênicas) e Aspergillus nidulans ao APDT com quatro FS fenotiazínicos [azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e o novo fenotiazínico pentacíclico S137 (S137)] em combinação com a luz vermelha, foram investigadas. Nós também avaliamos a suscetibilidade dos conídios de C. acutatum e A. nidulans ao APDT com o psoraleno 8-metóxipsoraleno (8-MOP), com duas cumarinas (7- metoxicumarina e 5,7-dimetóxicumarina) e com uma furanocumarina (isopimpinelina) em combinação com a radiação solar. Ambas as cumarinas e a furanocumarinas foram extraídas, no presente trabalho, do limão Tahiti (Citrus latifolia). Os efeitos dos tratamentos com os diferentes FS nas folhas de laranja-pera (Citrus sinensis) também foram avaliados. O NMBN e o S137 foram os fenotiazínicos mais eficazes. Os APDT com o NMBN (50 ?M) e S137 (10 ?M) e dose de luz de 25 J cm-2 resultaram na redução de aproximadamente 5 logs na sobrevivência dos conídios das três espécies. O APDT com o 8-MOP e com as cumarinas resultaram em uma redução de aproximadamente 4 logs na sobrevivência dos conídios de C. acutatum e A. nidulans. O APDT com a furanocumarina foi menos efetivo e resultou em uma redução na sobrevivência dos conídios de aproximadamente dois logs para C. acutatum e de três logs para A. nidulans. Nenhum dano nas folhas foi observado quando os FS foram colocados na superfície adaxial das folhas. Os estudos histológicos mostraram que nenhum dos FS fenotiazínicos atravessou a cutícula das folhas. / Antifungal photodynamic treatment (APDT) is a promising method that combines a nontoxic photosensitizer (PS), oxygen and visible light to cause selective killing of microbial cells. The development of APDT depends on identifying effective PS for the different pathogenic species. In the present study, the in vitro susceptibilities of Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides (both are phytophatogenic species) and Aspergillus nidulans conidia to APDT with four phenothiazinium PS [methylene blue (MB), new methylene blue N (NMBN), toluidine blue O (TBO) and the novel pentacicyclic phenothiazinium S137 (S137)] in combination with red light were investigated. We also evaluated the susceptibilities of C. acutatum and A. nidulans conidia to APDT with the psoralen 8-methoxypsoralen (8-MOP), with two coumarins (7-methoxicoumarin and 5,7-dimethoxycoumarin) and one furanocoumarin (isopimpinelin) in combination with solar radiation. Both the coumarins and the furanocoumarin were extracted, in the present work, from Tahiti lemon (Citrus latifolia). The effects of the treatments with all the PS on Citrus sinensis leaves were also evaluated. NMBN and S137 were the more effective phenothiazinium PS. APDT with NMBN (50 ?M) and S137 (10 ?M) and light dose of 25 J cm-2 resulted in a reduction of approximately 5 logs in the survival of the conidia of the three species. APDT with 8-MOP and with the coumarins resulted in a reduction of approximately 4 logs in the survival of C. acutatum and A. nidulans conidia. APDT with the furanocumarin was less effective and resulted in the reduction of approximately 2 logs for C. acutatum and 3 logs for A. nidulans. No damages to the leaves were observed when the PS were spotted on the adaxial surface of the leaves and the plants were exposed to solar radiation. Histological studies showed that the phenothiazinium PS did not cross the leave cuticle.

O complexo Mre11 (Mre11/Rad50/Nbs1) é uma componente chave da resposta celular ao dano ao DNA em humanos e recentes observações sugerem que estas proteínas são em parte responsáveis pela interface ente o ensoreamento do dano ao DNA, seu reparo e as funções das proteínas envolvidas nos pontos de checagem do ciclo celular. Em Aspergillus nidulans, a partir de um screening para o isolamento de letais sintéticos na ausência de dineína, o gene sldIRAD50 foi clonado como um desses letais sintéticos através da complementação do fenótipo de deficiência de conidiação do mutante. Foi identificada uma transversão G-C na posição 2509 (Ala-692-Pro) no mutante sldI1444 a qual está presente na região de dobradiça da proteína. Essa mutação causa sensibilidade a vários agentes mutagênicos. Uma linhagem mutante sldIRAD50::pyrG foi construída a qual apresentou também vários defeitos na reposta celular ao dano ao DNA incluindo sensibilidade a várias drogas mutagênicas, defeito no ponto de checagem de replicação do DNA e na viabilidade dos ascosporos. Além disso, o gene sldIRAD50 interage geneticamente com bimEAPC1 para o controle do spindle pole checkpoint durante a segregação cromossômica sugerindo um novo papel para o complexo Mre11. Em atuação paralela com o complexo Mre11, duas proteínas quinases ditas apicais, ATM e ATR coordenam a transdução do sinal do dano ao DNA para proteínas efetoras do reparo. A proteína ATM está mutada na síndrome de instabilidade cromossômica herdada Ataxia Telangiectasia. Para a caracterização do homologo de ATM em A. nidulans AtmA, uma linhagem mutante atmAATM foi isolada. Esse mutante apresentou falha na reposta ao dano ao DNA, como seus homólogos em vários outros organismos mostrando defeitos no ponto de checagem intrafase S e G2/M, além de sensibilidade a camptothecin e bleomicina. Ainda, o extrato protéico bruto desse mutante não foi capaz de fosforilar o homologo de NBS1 em A. nidulans, ScaA. Além das conhecidas funções de ATM na resposta ao dano ao DNA, foi verificado que o mutante atmAATM apresentou uma acelerada cinética de divisão nuclear e severos defeitos no estabelecimento e manutenção do eixo de crescimento polarizado, evidenciando uma função ainda não descrita para ATM no crescimento polar. Provavelmente, AtmA regula a função e/ou localização de proteínas chaves para a formação do eixo de polarização. Diante disso, para investigar as vias metabólicas que são controladas por esse gene, o perfil transcricional do mutante atmAATM, em comparação com a linhagem selvagem foi verificado em diferentes condições de crescimento. Os resultados indicaram um importante papel da via das pentoses fosfato na proliferação celular monitorada pela AtmA. Além disso, foram identificados vários genes com a expressão do mRNA diminuída envolvidos no crescimento polarizado, na síntese de ácido fosfatídico e de ergosterol e no tráfico intracelular, secreção e transporte vesicular. Buscando identificar genes que participam da resposta celular ao dano ao DNA causado pela droga anti topoisomerase I, camptothecin, foram utilizados filtros de macroarray de A. nidulans contendo 2787 genes deste organismo para monitorar a expressão gênica da linhagem selvagem e do mutante uvsBATR, num experimento de indução com CPT por 30, 60 e 120 minutos. Os resultados revelaram um total de 1512 e 1700 genes modulados na linhagem selvagem e uvsBATR respectivamente, em pelo menos um ponto experimental. Seis desses genes que apresentaram aumento da expressão de mRNA na linhagem selvagem e diminuição da linhagem uvsBATR foram caracterizados: fhdA (que codifica para uma proteína com domínio fork-head associated), tprA (uma proteína hipotética que apresenta o domínio tetratrico peptide repeat), mshA (um homólogo MutS6 envolvido em mismatch repair), phbA (um homólogo da prohibitina), uvsCRAD51 e cshA (homólogo da proteína CSB envolvida no reparo por excisão de nucleotídeos e ligada a Síndrome de Cockayne). A indução transcricional desses genes na presença de CPT requer a função de uvsBATR. Estes genes foram deletados e surpreendentemente apenas uvsCRAD51 apresentou sensibilidade a CPT, enquanto os outros mostraram sensibilidade a outros agentes que causam dano ao DNA e estresse oxidativo. Além disso, com exceção de uvsCRAD51, a deleção desses genes leva a supressão parcial da sensibilidade a menadiona e paraquat do mutante uvsBATR. Esses resultados indicaram um comportamento heterogêneo de sensibilidade durante o crescimento na presença de agentes que causam dano direto ou indireto ao DNA, evidenciando que o perfil transcricional não é determinante para predizer a função de um gene na proteção da célula a determinada droga que causa dano ao DNA. / The Mre11 protein complex (Mre11/Rad50/Nbs1) has emerged as a central component in the human cellular DNA damage response, and recent observations suggest that these proteins are at least partially responsible for the linking of DNA damage detection to DNA repair and cell cycle checkpoint functions. In Aspergillus nidulans, the sldI1444D mutant was isolated in a screen for dynein synthetic lethals. The sldIRAD50 gene was cloned by complementation of the sporulation deficiency phenotype of this mutant. A transversion G-C at the position 2509 (Ala-692-Proamino acid change) in the sldI1444D mutant causes sensitivity to several DNAdamaging agents. The mutation sldI1 occurs at the CXXC hinge domain of Rad50. An inactivation strain sldIRAD50::pyrG was constructed. Besides sensitivity to a number of DNA-damaging agents, this deletion strain was also impaired in the DNA replication checkpoint response and in ascospore viability. Also, sldIRAD50::pyrG geneticaly interacted with bimEAPC1, acting in the spindle pole checkpoint control during segregation, suggesting a new possible role of Mre11 complex. In parallel to the Mre11 complex, two apical quinases ATM and ATR respond to DNA damage and transduce the signal to effector proteins. In humans, mutations in ATM cause the devastating neurodegenerative disease Ataxia Telangiectasia. Here we characterized the homolog of ATM (AtmA) in the filamentous fungus A. nidulans. The deletion strain atmA presented defects in the DNA damage response as previously shown in other model organisms including intra S-phase and G2/M checkpoint defects, sensitivity to camptothecin and bleomycin. Also, the crude extract from the mutant strain did not phosphorylate the NBS1 homologue ScaA. In addition to its expected role in the DNA damage response, the atmA mutant showed increased nuclear division kinetics and severe defects in polarized hyphal growth, indicating a novel feature for the ATM gene. Probably, AtmA regulates the function and/or localization of landmark proteins required for the formation of a polarity axis. We extended these studies by investigating which pathways are controlled by AtmA during proliferation and polar growth by comparatively determining the transcriptional profile of A. nidulans wild type and atmA mutant strains in different growth conditions. Our results indicated an important role of the pentose phosphate pathway in the fungal proliferation during endogenous DNA damage and polar growth monitored by the AtmA kinase. Furthermore, we identified several genes that have decreased mRNA expression in the atmA mutant that are involved in the formation of polarized hyphae and control of polar growth; in the biosynthesis of phosphatidic acid and ergosterol; and intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport. In order to identify genes that responded to the DNA damage mediated by the anti- toposomerase I drug, camptothecin, we used an A. nidulans macroarray carrying sequences of 2,787 genes from this fungus to monitor gene expression of both wild-type and uvsBATR in a time-point experiment where mycelium was exposed to 60, 90 and 120 minutes to the drug. The results revealed a total of 1,512 and 1,700 genes in the wild-type and uvsBATR deletion mutant strain that displayed statistically significant difference in at least one experimental time-point. We characterized six genes that have increased mRNA expression in the presence of CPT in the wild-type strain relative to the uvsBATR mutant strain: fhdA (encoding a fork head associated domain protein), tprA (encoding a hypothetical protein that contains a tetratrico peptide repeat), mshA (encoding a MutS homologue involved in mismatch repair), phbA (encoding a prohibitin homologue), uvsCRAD51 (the homologue of the RAD51 gene), and cshA (encoding a homologue of the excision repair protein ERCC-6 [Cockaynes syndrome protein]). The induced transcript levels of these genes in the presence of CPT required uvsBATR. These genes were deleted, and surprisingly, only the uvsCRAD51 mutant strain was sensitive to CPT; however, the others displayed sensitivity to a range of DNA-damaging and oxidative stress agents. Moreover, with the exception of UvsC, deletion of each of these genes partially suppressed the sensitivity of the uvsB strain to menadione and paraquat. These results indicated a very complex and heterogeneous sensitivity behavior during growth in the presence of agents that directly or indirectly cause DNA damage and the transcriptional response to DNAdamaging agents does not necessarily identify the genes that protect against these agents.

Generation and phenotypic analyses of stzA gene deletion strains of Aspergillus nidulans implies that stzA is allelic to sltA, with the encoded transcription factor regulating tolerance to cations, DNA-damaging agents and high arginine concentrations. The similar severe sensitivity of a sltA1 mutant (GO281) and stzA deletion mutants to these stresses indicated that the premature termination codon in sltA1 represents a total loss-of-function mutation. It was also verified that StzA has no regulatory role in the utilisation of carbon sources. Findings were supported by phenotypic analyses of recombinant progeny resulting from sexual crosses between sltA1 and sltA+ strains. Bioinformatic analysis of genes involved in the osmotic stress response revealed that their promoters were significantly enriched for StzA binding site motifs compared to those of the control group, indicating that StzA may regulate many of these genes that comprise the High Osmolarity Glycerol (HOG) pathway. Although this pathway is activated by fludioxonil, stzA deletants and stzA+ strains showed similar sensitivities to this fungicide. Phenotypic analyses indicate that StzA does not regulate tolerance to sources of oxidative stress, non-ionic osmotic stress or components of the Cell Wall Integrity (CWI) pathway. A. nidulans StzA appears to have no role in cellulase or xylanase expression as revealed by the results of a dinitrosalicylic acid (DNS) assay. Trichoderma reesei ace1 deletant and wild-type strains showed similar sensitivities to cations, DNA-damaging agents, arginine, neomycin, acidic and alkaline pH. These results confirm that A. nidulans StzA and T. reesei Ace1 regulate the distinct phenotypes of abiotic stress tolerance and cellulase and xylanase expression, respectively, despite these two proteins sharing 58% overall amino acid similarity. All twenty-nine StzA orthologues identified are restricted to filamentous ascomycetes of the Pezizomycotina subphylum and may therefore represent specific and novel antifungal drug targets. The C-termini of StzA proteins are highly variable in both length and sequence, with no apparent conservations in amino acids or predicted secondary structure. This region is considered most likely to influence the divergent functions of StzA proteins. Conservations of individual residues in the N-termini correspond to conserved secondary structure (alpha helices) among StzA proteins, implying shared functions for StzA proteins in this region. Regulators of two major nitrogen metabolic pathways (CpcA and AreA) may regulate stzA expression. Statistically significant putative CpcA binding sites were positionally conserved in 26 out of 29 stzA orthologue promoters, indicating an interaction between stzA and CpcA, a transcription factor that mediates the cross pathway control of amino acid biosynthesis. REALALE sequences, likely to be of retrotransposon origin, containing putative overlapping binding sites for StzA and AreA, were found in eleven stzA promoters of the Eurotiomycetes class, indicating an interaction between stzA and the global nitrogen metabolite repressor AreA. Intriguingly, REALALE-containing promoters identified across the genome of A. nidulans were significantly enriched for StzA binding site motifs when compared to a control group of genes. Hence, REALALE may have regulatory significance that extends to other A. nidulans genes.

A humanidade tem aumentado drasticamente o uso de antibióticos, antifúngicos, inseticidas, herbicidas e agentes quimioterápicos para tratar infecções, câncer e obter ganho econômico com a produção agrícola e industrial. O repetido uso destas substâncias leva freqüentemente à sua ineficiência devido à seleção de organismos resistentes ou tolerantes, com graves conseqüências econômicas e sociais. Os mecanismos envolvidos no processo de resistência à antifúngicos são pouco conhecidos. A compreensão destes mecanismos auxiliará no desenvolvimento de estratégias para a identificação de isolados clínicos resistentes, no tratamento de infecções fúngicas, na prevenção do surgimento de isolados resistentes, na definição de novas estratégias de utilização de antifúngicos, na revelação de novos alvos terapêuticos e portanto, no controle dos patógenos. Para o entendimento das bases moleculares da resistência à acriflavina e outros agentes inibidores em fungos nós clonamos, por transformação, um gene que confere esta resistência em Aspergillus nidulans e o caracterizamos molecularmente. Construímos uma biblioteca a partir de uma linhagem duplo-resistente e isolamos um clone que se mostrou capaz de transformar uma linhagem receptora sensível em resistente à acriflavina. A seqüência deste clone proveniente do mutante resistente, e de seu alelo selvagem revelou um gene de aproximadamente 2276 nucleotídeos traduzido em 697 aminoácidos, com alta similaridade com a trealose sintase/fosforilase (glicosiltransferase) de vários organismos. Esta seqüência foi depositada no “GenBanK" (AY102266). As enzimas trealose sintase e fosforilase participam da síntese da trealose que, além de ser fonte de carbono, está relacionada com a proteção das proteínas de membrana e das enzimas, e contra o estresse térmico e oxidativo em fungos filamentosos. As seqüências nucleotídicas dos alelos selvagem e mutante não apresentaram diferenças nas regiões estruturais ou promotoras. No entanto, a seqüência do cDNA da linhagem selvagem apresenta um íntron extra quando comparada com o cDNA da linhagem mutante. Portanto, o mRNA do gene da linhagem mutante não estaria sendo adequadamente processado, provavelmente por uma alteração no mecanismo envolvido neste processamento, inviabilizando a funcionalidade da trealose sintase / fosforilase produzida. O nocaute deste gene e a análise do fenótipo dos mutantes nulos na presença de acriflavina ou brometo de etídio confirmaram que ele não é essencial para o fungo. Através de genética clássica verificou-se que não há interação gênica ou sinergismo entre as mutações acrA1, que confere resistência à acriflavina e a outros inibidores, e tebA1, que confere resistência ao antimicótico terbinafina no fungo A. nidulans. / Mankind has drastically increased the use of antibiotics, antifungals, insecticides, herbicides and chemotherapeutic agents to treat infections and cancer and to obtain economic gains with agricultural and industrial production. The continuous use of these substances frequently leads to their inefficiency due to the selection of resistant or tolerant organisms, with serious economic and social consequences. The mechanisms involved in the process of antifungal resistance are little known. Understanding these mechanisms will help in the development of strategies for the identification of resistant clinical isolates, the treatment of fungal infections, the prevention of the occurrence of resistant isolates, the definition of new strategies for the use of antifungal agents, and the discovery of new therapeutic targets, and therefore the control of pathogens. To better understand the molecular basis of resistance to acriflavine and other inhibitory agents among fungi we cloned by transformation a gene that confers this resistance to Aspergillus nidulans and characterized it molecularly. We constructed a library from a double-resistant strain and isolated a clone that proved to be able to transform a receptor strain sensitive into an acriflavine-resistant strain. The sequence of this clone obtained from the resistant mutant and of its wild allele revealed a gene of approximately 2276 nucleotides translated into 697 amino acids, with high similarity to the trehalose synthase/phosphorylase (glycosyltransferase) of various organisms. This sequence was deposited in GenBanK (AY102266). The enzymes trehalose synthase and trehalose phosphorylase are related to the synthesis of trehalose, which in addition to being a carbon source is related to protection of the membrane proteins and of the enzymes against thermal and oxidative stress in filamentous fungi. The nucleotide sequences of the wild and mutant alleles did not show differences in the structural or promoter regions. However, the cDNA sequence of the wild strain presents an extra intron compared to the cDNA of the mutant strain. Thus, the mRNA of the gene of the mutant strain may not be adequately processed, probably due to an alteration in the mechanism involved in this processing, leading to inviability of the functionality of the trehalose synthase/phosphorylase produced. Knock out of this gene and analysis of the null mutant phenotypes in the presence of acriflavine or ethidium bromide confirmed that this gene is not essential for the fungus. Using classical Genetics, no gene interaction or synergism was observed between the acrA1 mutation, which confers resistance to acriflavine and to other inhibitors, and the tebA1 mutation, which confers resistance to the antimycotic agent terbinafine in the fungus A. nidulans.

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Conidiation is a common and critical asexual reproductive mode in fungi. The ascomycetes, the largest group in the kingdom Fungi undergo conidiation. The wide array of morphological difference in a conidiophore and conidial size, shape, and cellular organization demonstrates the importance of evolution in driving the morphological and functional diversity. An important unanswered question is how these conidiation processes evolve. We hypothesized that a conidiation regulatory pathway was present in the ancestral species, and became specialized in the extant species to lead to morphological and functional diversity. To address this hypothesis we assessed the conserved function of conidiation regulators in two distantly related ascomycetes, Aspergillus nidulans and Neurospora crassa. Using sequence similarity analysis, N. crassa orthologs were characterized to seven main conidiation regulatory genes in A. nidulans (fluG, flbC, flbD, abaA, wetA, medA, and stuA). Expression of the N. crassa orthologs complemented defective conidiation in the A. nidulans fluG, flbD, wetA, medA, and stuA mutants. In contrast, abaA and flbC and the N. crassa orthologs did not share conserved biochemical function. Taken in context of other recent studies of conidiation regulators, there are four distinct evolutionary patterns: (i) Non-homologous genes with analogous roles in conidiation (‘brlA’ and ‘fl’), (ii) Orthologs with retained biochemical function that lack analogous role in conidiation (‘fluG’, ‘flbD’, and ‘wetA’), (iii) Orthologs with retained biochemical function and analogous roles in conidiation (‘medA’ and ‘stuA’), and (iv) Orthologs with biochemical function not conserved but with analogous roles in conidiation (‘abaA’ and ‘flbC’). These studies set the stage for long-term studies of how evolution proceeded during the evolution of conidiation at different levels of phylogenetic diversity. An understanding of how evolutionary mechanisms shape the dynamics of developmental pathways will be significant for our understanding of fungal evolution of other novel adaptations such as pathogenesis.