Segundo a classificação CAZy (Carbohydrate Active enZymes), as glicosil hidrolases (GH) da família 93 são exo-?-1,5-arabinanases que atuam nas ligações ?-1,5 que unem os resíduos de L-arabinofuranosideo que conformam a cadeia principal de arabinana desramificada, liberando arabinose ou arabinobiose. Esta recém descrita família de enzimas, além de ter o potencial de participar junto com outras proteínas na sacarificação de resíduos industriais como a polpa de beterraba, oferece a possibilidade de sintetizar novas moléculas, pois alguns membros desta família podem catalisar reações de transarabinosilação utilizando glicerol, xilitol e sorbitol como aceptores. Embora as GH93 apresentem caraterísticas atrativas para aplicações industriais, até o momento apenas cinco enzimas desta família foram caraterizadas bioquimicamente, sendo que a maioria delas apresentou maior atividade em pHs ácidos e nenhuma com caraterísticas termofílicas. Neste trabalho uma exo-?-1,5-arabinanase abnt do fungo termofílico Thielavia terrestris foi expressa heterólogamente pela primeira vez em fungo filamentoso, utilizando Aspergillus nidulans linhagem A773 transformado com o vetor pEXPYR como sistema de expressão. A enzima foi caraterizada bioquimicamente e sua produção fermentativa avaliada, utilizando dois tipos de indutores em diferentes concentrações e condições de cultivo, escolhendo a melhor condição para o escalonamento. A proteína recombinante de 39,8 KDa mostrou ser uma glicoproteína com uma atividade especifica de 248 U.mg-1 em arabinana desramificada 0,28 mM, pH 5 e temperatura de 70 ?C (valores ótimos para enzima), um Km 0,29 mM, Vmax 0,45 ?mol.min-1, Kcat 115,4 s-1, e eficiência catalítica de 3,9 *105 s-1 M-1, mostrando também um aumento de 34% na liberação de produto quando incubada na presença de CoCl2 1mM. Esta é a primeira exo-arabinanase reportada na literatura com comportamento termofílico e prolongada estabilidade em pHs ácidos. No processo fermentativo a melhor produção de abnt foi atingida usando 3% (m/v) do indutor em condições de cultivo submerso, o escalonamento do processo não afetou a produção enzimática. O sistema de expressão A. nidulans+pEXPYR foi capaz de produzir a mesma quantidade de proteína recombinante utilizando como indutor, um composto cinquenta vezes mais barato que o normalmente utilizado. / According to CAZy (Carbohydrate Active enZymes) classification, glycosyl hydrolases (GH) from family 93 are exo-?-1,5-arabinanases acting on ?-1,5 bonds that bind L-arabinofuranose residues in the main chain of arabinan releasing arabinose or arabinobiose. This new family of enzymes was described recently and, besides having the potential to participate along with other proteins in the saccharification of agro industrial wastes such as sugar beet pulp, offers the possibility of synthesize new molecules, since some members of this family can catalyze reactions of transarabinosylation using glycerol, xylitol and sorbitol as acceptors. Although, GH93 presents attractive characteristics for industrial applications, only five enzymes have been characterized biochemically so far, most of them presenting higher activity in acidic pHs and none with thermophilic characteristics. In this work an exo-?-1,5-arabinanase abnt of the thermophilic fungus Thielavia terrestris was heterologously expressed for the first time in a filamentous fungus using Aspergillus nidulans strain A773 transformed with the pEXPYR vector as expression system. The enzyme was characterized biochemically and its fermentative production was evaluated using two types of inducers in different concentrations and conditions of cultivation, setting the best condition for scale up. The recombinant protein of 39.8 KDa showed be a glycoprotein with a specific activity of 248 U.mg-1 in 0.28 mM debranched arabinana at pH 5 and temperature of 70 °C (optimum values for enzyme), a Km 0,29 mM, Vmax 0.45 ?mol.min-1, Kcat 115.4 s-1, and catalytic efficiency of 3.9 * 105 s-1 M-1, also showed an increase of 34% in product release when incubated in the presence of 1 mM CoCl2. This, is the first exo-arabinanase reported in the literature with thermophilic behavior and prolonged stability at acidic pHs. In the fermentation process the best abnt production was achieved using 3% (m/v) of the inducer under submerged culture conditions, and the scaling process did not affect the enzymatic production. The A. nidulans+pEXPYR expression system was able to produce the same amount of recombinant protein using as an inducer, a compound fifty fold less expensive then the normally used.

A constante exposição dos diferentes organismos a agentes que danificam a estrutura da molécula do DNA fez com que a célula desenvolvesse mecanismos de reparo que se mostraram conservados durante a evolução. Em células de mamíferos, as vias de reparo ao dano ao DNA e a regulação dos pontos de checagem do ciclo celular atuam de forma coordenada no reparo do dano a fim de evitar uma progressão do ciclo celular antes do reparo e uma possível perpetuação do dano. Além disso, alguns dos componentes dessas vias metabólicas também atuam em outros processos, como replicação, transcrição, recombinação meiótica e silenciamento gênico. NER é um importante mecanismo no processo que reconhece e remove dímeros de ciclobutano e 6-4 pirimidina-pirimidona da estrutura do DNA. Em mamíferos foram identificados sete grupos de complementação para células deficientes de XP (XPA-G). Um desses grupos é XPE, conhecido por possuir forte afinidade ao dano ao DNA causado por luz UV, sendo formado por duas subunidades, DDB1 e DDB2. Uma busca no banco de dados de Aspergillus nidulans utilizando uma seqüência DDB1 de Homo sapiens, revelou uma única seqüência com similaridade relevante denominada como DdbA que não possui nenhuma similaridade com a proteína DDB2. Em Aspergillus nidulans, a proteína DdbA também está envolvida no reparo do dano ao DNA causado por luz UV e 4-NQO, no entanto, vimos aqui, que DdbA está interagindo com as proteínas UvsBATR, H2AX e CshBCSB no reparo ao dano ao DNA causado por MMS, Bleomicina, 4-NQO e luz UV. Além disso, uma análise na expressão do gene ddbA mostrou que ele é induzido por estas drogas, no estresse oxidativo e nos processos de desenvolvimento assexual e sexual de A. nidulans. Nós também vimos que a localização celular de DdbA não foi afetada durante a resposta ao dano ao DNA causado por luz UV e 4-NQO indicando que a proteína DdbA está presente no núcleo independentemente do dano. Em S. pombe, as proteínas serina-treonina quinases CHK1 e CHK2 foram identificadas como essenciais para o bloqueio do ciclo celular na fase S em resposta ao dano ao DNA ou em resposta ao estresse replicacional. Essas quinases são fosforiladas pelas quinases ATM e ATR e tem sido extensivamente caracterizadas em A. nidulans. Neste fungo, as proteínas ChkACHK1 e ChkBCHK2 estão envolvidas na reposta ao dano ao DNA e estão interagindo de forma epistática e sinergística com as proteínas quinases AtmAATM e UvsBATR. Nossos resultados também sugerem que as proteínas ChkA e ChkB podem estar envolvidas em meiose, e atuam em vias complementares durante o bloqueio da fase S do ciclo celular. Além disso, as proteínas AtmA, ChkA, ChkB e UvsB são redundantemente complementares na manutenção do crescimento polar das hifas em Aspergillus nidulans. / The constant exposure of different organisms to agents that damage the DNA structure, has provided the cells with repair mechanisms that are conserved during evolution. In mammal cells, the DNA damage repair pathways and the cell cycle checkpoint regulation act together to prevent cell cycle progression before the repair is performed avoiding mutation fixaxion. However these responses are complex and demand overlapping functions and the intersection of many metabolic pathways. NER is an important mechanism in the process that recognize and remove cyclobutane pyrimidine dimers and 6-4 pyrimidine-pyrimidone photoproduct from the DNA structure. In mammals seven complementation groups for XP deficient cells were identified. One of these groups is XPE, known for having strong affinity to the DNA damage caused by UV light and is formed by two subunits DDB1 and DDB2. A search on the Aspergilus nidulans database using a Homo sapiens DDB1 sequence, revealed a single ORF with relevant similarity. The A. nidulans homologue was deleted and named DdbA. ddbA does not have significant similarity to DDB2 protein. In A. nidulans the protein DdbA is involved on the DNA damage repair caused by UV light and 4NQO. Additionaly ddbA is genetically interacting with uvsBATR, histone H2AX and cshBCSB the damage repair caused by MMS , BLEO, 4NQO and UV light. Also, an analysis of the gene ddbA expression indicated that it is induced by MMS, BLEO, 4-NQO, oxidative stressing agents and by the assexual and sexual development processes of A. nidulans. We also verified that the sub-cellular localization of DdbA was not affected by the presence of UV light or 4-NQO indicating that the protein DdbA is constitutively present in the nucleus. In S. pombe, the serine treonine kinases CHK1 and CHK2 proteins were identified as essential to the Sphase blockage in response to the DNA damage or replicational stress. These kinases are phosphorilated by ATR and ATM kinases, respectively and have been extensively characterized in A. nidulans. In this fungus, the proteins ChkACHK1 and ChkBCHK2 are involved on the DNA damage response and are genetically interacting in an epistatic and/or synergistic manner with the AtmAATM and UvsBATR kinases. Our results also sugest that the proteins ChkA and ChkB may also be involved in meiosis and act in a complementary way during the S-phase block. Furthermore the AtmA, ChkA, ChkB e UvsB proteins are complementary redundant for the maintenance of the polar growth in A. nidulans.

Megazol (1-metil-2-(5-amino-1,3,4-tiadiazolil)-5-nitroimidazol) (MZ) tem sido descrito como um composto efetivo contra Tripanossoma cruzi, agente causador da Doença de Chagas. Contudo, este composto mostrou efeitos mutagênicos e baixa solubilidade em água. O primeiro objetivo desta pesquisa foi avaliar o potencial carcinogênico de três doses de MZ através do teste de Indice de Homozigotização (HI). Este teste mostra alterações nas frequências de crossing-over mitótico eventualmente envolvidas com genes heterozigotos auxotróficos em linhagens de Aspergillus nidulans. O teste HI mostrou alterações nas frequências de crossing-over mitótico quando o tratamento com MZ foi aplicado. O segundo objetivo foi o preparo de nanopartículas de poli(<font face=\"Symbol\">e-caprolactona) contendo MZ a partir do método de nanoprecipitação. O tamanho das nanopartículas obtidas foi de 280±1,34 nm e polidispersão de 0,13±0,003 nm. A análise de Microscopia Eletrônica (MEV) revelou nanopartículas de superfície lise e esférica. Uma eficiência de encapsulação de 24% foi alcançada para as nanopartículas de MZ. / Megazol (1-metil-2-(5-amino-1,3,4-tiadiazolil)-5-nitroimidazol) (MZ) has been describe as an effective compound against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas\'s disease. Nevertheless this compound has showed mutagenic effects and lower solubility in aqueous systems. The one aim of this research was evaluate the carcinogenic potential of three doses of megazol (MZ) through of homozygation index assay (HI). This short-term assay shows alterations in mitotic crossing-over frequencies eventually involving heterozygous auxotrophic genes in diploid strains of Aspergillus nidulans. The HI assay showed to mitotic crossing-over alteration in their frequency when the MZ was present. While the second aim was prepare poly-<font face=\"Symbol\">e-caprolactone nanoparticles by nanoprecipitation method loaded with MZ. The particle size of the prepared nanoparticles was the 280±1,34 nm and polydispersity was 0,13±0,003. Scanning electron microscopy (SEM) analyze reveled a smooth surface and spherical. The encapsulation efficiency about 24% was achieved to MZ nanoparticles.

Segundo a classificação CAZy (Carbohydrate Active enZymes), as glicosil hidrolases (GH) da família 93 são exo-?-1,5-arabinanases que atuam nas ligações ?-1,5 que unem os resíduos de L-arabinofuranosideo que conformam a cadeia principal de arabinana desramificada, liberando arabinose ou arabinobiose. Esta recém descrita família de enzimas, além de ter o potencial de participar junto com outras proteínas na sacarificação de resíduos industriais como a polpa de beterraba, oferece a possibilidade de sintetizar novas moléculas, pois alguns membros desta família podem catalisar reações de transarabinosilação utilizando glicerol, xilitol e sorbitol como aceptores. Embora as GH93 apresentem caraterísticas atrativas para aplicações industriais, até o momento apenas cinco enzimas desta família foram caraterizadas bioquimicamente, sendo que a maioria delas apresentou maior atividade em pHs ácidos e nenhuma com caraterísticas termofílicas. Neste trabalho uma exo-?-1,5-arabinanase abnt do fungo termofílico Thielavia terrestris foi expressa heterólogamente pela primeira vez em fungo filamentoso, utilizando Aspergillus nidulans linhagem A773 transformado com o vetor pEXPYR como sistema de expressão. A enzima foi caraterizada bioquimicamente e sua produção fermentativa avaliada, utilizando dois tipos de indutores em diferentes concentrações e condições de cultivo, escolhendo a melhor condição para o escalonamento. A proteína recombinante de 39,8 KDa mostrou ser uma glicoproteína com uma atividade especifica de 248 U.mg-1 em arabinana desramificada 0,28 mM, pH 5 e temperatura de 70 ?C (valores ótimos para enzima), um Km 0,29 mM, Vmax 0,45 ?mol.min-1, Kcat 115,4 s-1, e eficiência catalítica de 3,9 *105 s-1 M-1, mostrando também um aumento de 34% na liberação de produto quando incubada na presença de CoCl2 1mM. Esta é a primeira exo-arabinanase reportada na literatura com comportamento termofílico e prolongada estabilidade em pHs ácidos. No processo fermentativo a melhor produção de abnt foi atingida usando 3% (m/v) do indutor em condições de cultivo submerso, o escalonamento do processo não afetou a produção enzimática. O sistema de expressão A. nidulans+pEXPYR foi capaz de produzir a mesma quantidade de proteína recombinante utilizando como indutor, um composto cinquenta vezes mais barato que o normalmente utilizado. / According to CAZy (Carbohydrate Active enZymes) classification, glycosyl hydrolases (GH) from family 93 are exo-?-1,5-arabinanases acting on ?-1,5 bonds that bind L-arabinofuranose residues in the main chain of arabinan releasing arabinose or arabinobiose. This new family of enzymes was described recently and, besides having the potential to participate along with other proteins in the saccharification of agro industrial wastes such as sugar beet pulp, offers the possibility of synthesize new molecules, since some members of this family can catalyze reactions of transarabinosylation using glycerol, xylitol and sorbitol as acceptors. Although, GH93 presents attractive characteristics for industrial applications, only five enzymes have been characterized biochemically so far, most of them presenting higher activity in acidic pHs and none with thermophilic characteristics. In this work an exo-?-1,5-arabinanase abnt of the thermophilic fungus Thielavia terrestris was heterologously expressed for the first time in a filamentous fungus using Aspergillus nidulans strain A773 transformed with the pEXPYR vector as expression system. The enzyme was characterized biochemically and its fermentative production was evaluated using two types of inducers in different concentrations and conditions of cultivation, setting the best condition for scale up. The recombinant protein of 39.8 KDa showed be a glycoprotein with a specific activity of 248 U.mg-1 in 0.28 mM debranched arabinana at pH 5 and temperature of 70 °C (optimum values for enzyme), a Km 0,29 mM, Vmax 0.45 ?mol.min-1, Kcat 115.4 s-1, and catalytic efficiency of 3.9 * 105 s-1 M-1, also showed an increase of 34% in product release when incubated in the presence of 1 mM CoCl2. This, is the first exo-arabinanase reported in the literature with thermophilic behavior and prolonged stability at acidic pHs. In the fermentation process the best abnt production was achieved using 3% (m/v) of the inducer under submerged culture conditions, and the scaling process did not affect the enzymatic production. The A. nidulans+pEXPYR expression system was able to produce the same amount of recombinant protein using as an inducer, a compound fifty fold less expensive then the normally used.

Megazol (1-metil-2-(5-amino-1,3,4-tiadiazolil)-5-nitroimidazol) (MZ) tem sido descrito como um composto efetivo contra Tripanossoma cruzi, agente causador da Doença de Chagas. Contudo, este composto mostrou efeitos mutagênicos e baixa solubilidade em água. O primeiro objetivo desta pesquisa foi avaliar o potencial carcinogênico de três doses de MZ através do teste de Indice de Homozigotização (HI). Este teste mostra alterações nas frequências de crossing-over mitótico eventualmente envolvidas com genes heterozigotos auxotróficos em linhagens de Aspergillus nidulans. O teste HI mostrou alterações nas frequências de crossing-over mitótico quando o tratamento com MZ foi aplicado. O segundo objetivo foi o preparo de nanopartículas de poli(<font face=\"Symbol\">e-caprolactona) contendo MZ a partir do método de nanoprecipitação. O tamanho das nanopartículas obtidas foi de 280±1,34 nm e polidispersão de 0,13±0,003 nm. A análise de Microscopia Eletrônica (MEV) revelou nanopartículas de superfície lise e esférica. Uma eficiência de encapsulação de 24% foi alcançada para as nanopartículas de MZ. / Megazol (1-metil-2-(5-amino-1,3,4-tiadiazolil)-5-nitroimidazol) (MZ) has been describe as an effective compound against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas\'s disease. Nevertheless this compound has showed mutagenic effects and lower solubility in aqueous systems. The one aim of this research was evaluate the carcinogenic potential of three doses of megazol (MZ) through of homozygation index assay (HI). This short-term assay shows alterations in mitotic crossing-over frequencies eventually involving heterozygous auxotrophic genes in diploid strains of Aspergillus nidulans. The HI assay showed to mitotic crossing-over alteration in their frequency when the MZ was present. While the second aim was prepare poly-<font face=\"Symbol\">e-caprolactone nanoparticles by nanoprecipitation method loaded with MZ. The particle size of the prepared nanoparticles was the 280±1,34 nm and polydispersity was 0,13±0,003. Scanning electron microscopy (SEM) analyze reveled a smooth surface and spherical. The encapsulation efficiency about 24% was achieved to MZ nanoparticles.

O principal objetivo deste trabalho é o de estabelecer uma estratégia confiável relacionada a genotoxicidade, proteção genômica e recombinação mitótica em Aspergillus nidulans. A genotoxicidade foi induzida por vapor de benzeno e, para testar a proteção genômica, a soja foi usada devido às suas propriedades anticarcinogênicas muito conhecidas. O principal resultado obtido foi que a soja transgênica mostrou maiores propriedades antigenotóxicas do que a soja tradicional. Isto foi duplamente confirmado, tanto através de estratégias de genética clássica, como molecular. Além disso, cada experimento foi repetido três vezes. Principais conclusões foram as seguintes: a) estabelecimento de um protocolo adequado para atender às complexidades dos eventos epigenéticos e, b) a aplicação desse tal protocolo e experimentos afins para testar outros agentes ambientais suspeitos de apresentarem propriedades antigenotóxicas, ou que precisem de sua identificação como tal. Evidentemente, levando-se em conta a grande preocupação relacionada aos alimentos transgênicos e aos muitos produtos de biotecnologia, que entram no mercado, o elenco de prováveis candidatos aos tipos de testes apresentados, será muito grande. Como os resultados obtidos sugerem íntima relação entre metilação de DNA eucariótico, a recombinação mitótica e outros eventos danosos às células, os eventos envolvidos serão epigeneticamente discutidos. / Main aim is to provide a reliable approach to deal with the aspects related to induced genotoxicity, genomic protection and eukaryotic mitotic recombination in Aspergillus nidulans. Genotoxicity was benzene fumes induced, and to test genomic protection soybean has been used on account of its putative anticarcinogenic properties. Main outcome is that transgenic soybean bears higher antigenotoxic properties than traditional soybean. This has been twofold confirmed through basic genetic approaches and molecular approaches, as well. In addition, each experimental approach has been three times repeated. Additional important outcomes are: a- establishment of a reliable protocol to deal with the complexities of the epigenetic events, and b- likely use of present protocol and experimental set-up to test other environmental agents of which antigenotoxic properties are either suspected, or need precise identification. Evidently, on account of present wide concern the transgenic foodstuffs, and many other biotechnological products, as well, are obvious candidates for similar approaches. Obtained results suggest close relationships among eukaryotic DNA methylation, mitotic recombination, and other cells damaging events reputedly leading to carcinogenesis.

A esterigmatocistina (ST) é uma micotoxina policetônica produzida por diferentes espécies de Aspergillus e outros gêneros fúngicos como Bipolaris e Chaetomium. Esta toxina é caracterizada como uma bifuranoxantona com fórmula molecular C18H12O6, freqüentemente encontrada como contaminante de diversos produtos alimentícios como sementes oleaginosas e cereais. Possui propriedades carcinogênicas, toxigênicas, mutagênicas e teratogênicas, entretanto, ela é menos tóxica do que a aflatoxina. O fungo Emericella nidulans (Eidam) Vuillemin, cujo anamorfo é o Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, foi usado como modelo genético para a investigação de genes envolvidos na via biossintética da esterigmatocistina. Linhagens estoque de Utrecht (originárias de Glasgow) foram analisadas quanto à produção de ST e, entre elas, somente a linhagem UT196 [yA2 (I); metA17 (II); piroA4 (IV)] apresentou produção de 4 ppm de ST (stc+), enquanto que as linhagens UT448 e UT184 mostraram-se não produtoras dessa micotoxina (stc). Embora a linhagem UT196 seja muito bem caracterizada geneticamente, este foi o primeiro relato da produção de ST nessa linhagem. Os índices de segregação alélica e todas as freqüências de recombinação entre os marcadores genéticos ligados e não ligados foram determinados tanto pelo cruzamento meiótico UT448 (stc) x UT196 (stc+) como pelo cruzamento mitótico UT448//UT184. 175 segregantes meióticos e 140 segregantes mitóticos foram analisados quanto à produção de ST, aos marcadores de auxotrofia e de resistência a acriflavina. Essas linhagens cruzadas apresentavam vários marcadores em heterozigose e isso permitiu o mapeamento de um gene estrutural da ST (stcZ+), localizado no braço esquerdo do cromossomo I, 4% distante do gene da riboflavina (riboA1). Como um subproduto deste trabalho, foi detectado um pigmento vermelho, de Rf = 0,90, em todos os segregantes meióticos e mitóticos, produtores ou não de ST, indicando tratar-se, provavelmente, de um pigmento policetônico produzido pelos ascosporos do fungo. A baixa expressão da produção de ST em 13 segregantes meióticos e a alta expressão dessa toxina nos diplóides UT448//UT196 e UT448//UT184 (40 ppm) permitiram concluir a existência de um fator regulador, compreendido na região w-met do cromossomo II, responsável pela expressão do gene estrutural stcZ+. A análise desses genes através do ciclo parassexual sugeriu um comportamento epigenético típico envolvendo esses genes. Com base nos dados obtidos, hipóteses para explicar o controle da expressão desses genes e suas inter-relações foram aqui apresentadas. / Sterigmatocystin (ST) is a polyketide produced by different species of Aspergillus as well as by other fungus genera such as Bipolaris and Chaetomium. This toxin is characterized as a bifuranoxanthone, whose molecular formula is C18H12O6 and which is frequently found as a contaminant in several food products such as oil-seed grains and cereals. It has carcinogenic, toxigenic, mutagenic and teratogenic properties; however, it is less toxic than aflatoxin. The fungus Emericella nidulans (Eidam) Vuillemin, whose anamorph is Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, was used as a genetic model to investigate the genes involved in the sterigmatocystin biosynthetic pathway. Strains from Utrecht stocks (originally from Glasgow) were analyzed in order to detect ST production and, among them, only the UT196 strain [yA2 (I); metA17 (II); piroA4 (IV)] showed the production of 4 ppm of ST (stc+), whereas the UT448 and UT184 strains showed to be nonproducers of such toxin (stc). Although the UT196 strain is very well characterized genetically, this has been the first report on its production of ST. The allelic segregation rates and all the recombination frequencies between linked and non-linked genetic markers were determined by both the meiotic crossing UT448 (stc) x UT196 (stc+) and mitotic crossing UT448//UT184. 175 meiotic segregants and 140 mitotic segregants were analyzed as to ST production, auxotrophy markers and resistance to acriflavine. These crossed strains presented various markers in heterozygous configuration, which allowed to map a structural gene of ST (stcZ+) located on the left arm of chromosome I, 4% distant from the riboflavin gene (riboA1). As a byproduct of this work, a red pigment of 0.90 Rf was detected in all meiotic and mitotic segregants, whether they were ST producers or not, which indicated that was probably a polyketide produced by the fungus ascopores. The low expression of ST production in 13 meiotic segregants and the high expression of such toxin in the UT448//UT196 and UT448//UT184 diploids (40 ppm) allowed to conclude that a regulating factor existed in the w-met region of chromosome II, which is responsible for the expression of the structural gene stcZ+. The analyses of those genes through the parasexual cycle suggested a typical epigenetic behavior which involved them. Based on the data obtained, hypotheses to explain the expression control of these genes as well as their inter-relationships were here presented.

A constante exposição dos diferentes organismos a agentes que danificam a estrutura da molécula do DNA fez com que a célula desenvolvesse mecanismos de reparo que se mostraram conservados durante a evolução. Em células de mamíferos, as vias de reparo ao dano ao DNA e a regulação dos pontos de checagem do ciclo celular atuam de forma coordenada no reparo do dano a fim de evitar uma progressão do ciclo celular antes do reparo e uma possível perpetuação do dano. Além disso, alguns dos componentes dessas vias metabólicas também atuam em outros processos, como replicação, transcrição, recombinação meiótica e silenciamento gênico. NER é um importante mecanismo no processo que reconhece e remove dímeros de ciclobutano e 6-4 pirimidina-pirimidona da estrutura do DNA. Em mamíferos foram identificados sete grupos de complementação para células deficientes de XP (XPA-G). Um desses grupos é XPE, conhecido por possuir forte afinidade ao dano ao DNA causado por luz UV, sendo formado por duas subunidades, DDB1 e DDB2. Uma busca no banco de dados de Aspergillus nidulans utilizando uma seqüência DDB1 de Homo sapiens, revelou uma única seqüência com similaridade relevante denominada como DdbA que não possui nenhuma similaridade com a proteína DDB2. Em Aspergillus nidulans, a proteína DdbA também está envolvida no reparo do dano ao DNA causado por luz UV e 4-NQO, no entanto, vimos aqui, que DdbA está interagindo com as proteínas UvsBATR, H2AX e CshBCSB no reparo ao dano ao DNA causado por MMS, Bleomicina, 4-NQO e luz UV. Além disso, uma análise na expressão do gene ddbA mostrou que ele é induzido por estas drogas, no estresse oxidativo e nos processos de desenvolvimento assexual e sexual de A. nidulans. Nós também vimos que a localização celular de DdbA não foi afetada durante a resposta ao dano ao DNA causado por luz UV e 4-NQO indicando que a proteína DdbA está presente no núcleo independentemente do dano. Em S. pombe, as proteínas serina-treonina quinases CHK1 e CHK2 foram identificadas como essenciais para o bloqueio do ciclo celular na fase S em resposta ao dano ao DNA ou em resposta ao estresse replicacional. Essas quinases são fosforiladas pelas quinases ATM e ATR e tem sido extensivamente caracterizadas em A. nidulans. Neste fungo, as proteínas ChkACHK1 e ChkBCHK2 estão envolvidas na reposta ao dano ao DNA e estão interagindo de forma epistática e sinergística com as proteínas quinases AtmAATM e UvsBATR. Nossos resultados também sugerem que as proteínas ChkA e ChkB podem estar envolvidas em meiose, e atuam em vias complementares durante o bloqueio da fase S do ciclo celular. Além disso, as proteínas AtmA, ChkA, ChkB e UvsB são redundantemente complementares na manutenção do crescimento polar das hifas em Aspergillus nidulans. / The constant exposure of different organisms to agents that damage the DNA structure, has provided the cells with repair mechanisms that are conserved during evolution. In mammal cells, the DNA damage repair pathways and the cell cycle checkpoint regulation act together to prevent cell cycle progression before the repair is performed avoiding mutation fixaxion. However these responses are complex and demand overlapping functions and the intersection of many metabolic pathways. NER is an important mechanism in the process that recognize and remove cyclobutane pyrimidine dimers and 6-4 pyrimidine-pyrimidone photoproduct from the DNA structure. In mammals seven complementation groups for XP deficient cells were identified. One of these groups is XPE, known for having strong affinity to the DNA damage caused by UV light and is formed by two subunits DDB1 and DDB2. A search on the Aspergilus nidulans database using a Homo sapiens DDB1 sequence, revealed a single ORF with relevant similarity. The A. nidulans homologue was deleted and named DdbA. ddbA does not have significant similarity to DDB2 protein. In A. nidulans the protein DdbA is involved on the DNA damage repair caused by UV light and 4NQO. Additionaly ddbA is genetically interacting with uvsBATR, histone H2AX and cshBCSB the damage repair caused by MMS , BLEO, 4NQO and UV light. Also, an analysis of the gene ddbA expression indicated that it is induced by MMS, BLEO, 4-NQO, oxidative stressing agents and by the assexual and sexual development processes of A. nidulans. We also verified that the sub-cellular localization of DdbA was not affected by the presence of UV light or 4-NQO indicating that the protein DdbA is constitutively present in the nucleus. In S. pombe, the serine treonine kinases CHK1 and CHK2 proteins were identified as essential to the Sphase blockage in response to the DNA damage or replicational stress. These kinases are phosphorilated by ATR and ATM kinases, respectively and have been extensively characterized in A. nidulans. In this fungus, the proteins ChkACHK1 and ChkBCHK2 are involved on the DNA damage response and are genetically interacting in an epistatic and/or synergistic manner with the AtmAATM and UvsBATR kinases. Our results also sugest that the proteins ChkA and ChkB may also be involved in meiosis and act in a complementary way during the S-phase block. Furthermore the AtmA, ChkA, ChkB e UvsB proteins are complementary redundant for the maintenance of the polar growth in A. nidulans.

A esterigmatocistina (ST) é uma micotoxina policetônica produzida por diferentes espécies de Aspergillus e outros gêneros fúngicos como Bipolaris e Chaetomium. Esta toxina é caracterizada como uma bifuranoxantona com fórmula molecular C18H12O6, freqüentemente encontrada como contaminante de diversos produtos alimentícios como sementes oleaginosas e cereais. Possui propriedades carcinogênicas, toxigênicas, mutagênicas e teratogênicas, entretanto, ela é menos tóxica do que a aflatoxina. O fungo Emericella nidulans (Eidam) Vuillemin, cujo anamorfo é o Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, foi usado como modelo genético para a investigação de genes envolvidos na via biossintética da esterigmatocistina. Linhagens estoque de Utrecht (originárias de Glasgow) foram analisadas quanto à produção de ST e, entre elas, somente a linhagem UT196 [yA2 (I); metA17 (II); piroA4 (IV)] apresentou produção de 4 ppm de ST (stc+), enquanto que as linhagens UT448 e UT184 mostraram-se não produtoras dessa micotoxina (stc). Embora a linhagem UT196 seja muito bem caracterizada geneticamente, este foi o primeiro relato da produção de ST nessa linhagem. Os índices de segregação alélica e todas as freqüências de recombinação entre os marcadores genéticos ligados e não ligados foram determinados tanto pelo cruzamento meiótico UT448 (stc) x UT196 (stc+) como pelo cruzamento mitótico UT448//UT184. 175 segregantes meióticos e 140 segregantes mitóticos foram analisados quanto à produção de ST, aos marcadores de auxotrofia e de resistência a acriflavina. Essas linhagens cruzadas apresentavam vários marcadores em heterozigose e isso permitiu o mapeamento de um gene estrutural da ST (stcZ+), localizado no braço esquerdo do cromossomo I, 4% distante do gene da riboflavina (riboA1). Como um subproduto deste trabalho, foi detectado um pigmento vermelho, de Rf = 0,90, em todos os segregantes meióticos e mitóticos, produtores ou não de ST, indicando tratar-se, provavelmente, de um pigmento policetônico produzido pelos ascosporos do fungo. A baixa expressão da produção de ST em 13 segregantes meióticos e a alta expressão dessa toxina nos diplóides UT448//UT196 e UT448//UT184 (40 ppm) permitiram concluir a existência de um fator regulador, compreendido na região w-met do cromossomo II, responsável pela expressão do gene estrutural stcZ+. A análise desses genes através do ciclo parassexual sugeriu um comportamento epigenético típico envolvendo esses genes. Com base nos dados obtidos, hipóteses para explicar o controle da expressão desses genes e suas inter-relações foram aqui apresentadas. / Sterigmatocystin (ST) is a polyketide produced by different species of Aspergillus as well as by other fungus genera such as Bipolaris and Chaetomium. This toxin is characterized as a bifuranoxanthone, whose molecular formula is C18H12O6 and which is frequently found as a contaminant in several food products such as oil-seed grains and cereals. It has carcinogenic, toxigenic, mutagenic and teratogenic properties; however, it is less toxic than aflatoxin. The fungus Emericella nidulans (Eidam) Vuillemin, whose anamorph is Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, was used as a genetic model to investigate the genes involved in the sterigmatocystin biosynthetic pathway. Strains from Utrecht stocks (originally from Glasgow) were analyzed in order to detect ST production and, among them, only the UT196 strain [yA2 (I); metA17 (II); piroA4 (IV)] showed the production of 4 ppm of ST (stc+), whereas the UT448 and UT184 strains showed to be nonproducers of such toxin (stc). Although the UT196 strain is very well characterized genetically, this has been the first report on its production of ST. The allelic segregation rates and all the recombination frequencies between linked and non-linked genetic markers were determined by both the meiotic crossing UT448 (stc) x UT196 (stc+) and mitotic crossing UT448//UT184. 175 meiotic segregants and 140 mitotic segregants were analyzed as to ST production, auxotrophy markers and resistance to acriflavine. These crossed strains presented various markers in heterozygous configuration, which allowed to map a structural gene of ST (stcZ+) located on the left arm of chromosome I, 4% distant from the riboflavin gene (riboA1). As a byproduct of this work, a red pigment of 0.90 Rf was detected in all meiotic and mitotic segregants, whether they were ST producers or not, which indicated that was probably a polyketide produced by the fungus ascopores. The low expression of ST production in 13 meiotic segregants and the high expression of such toxin in the UT448//UT196 and UT448//UT184 diploids (40 ppm) allowed to conclude that a regulating factor existed in the w-met region of chromosome II, which is responsible for the expression of the structural gene stcZ+. The analyses of those genes through the parasexual cycle suggested a typical epigenetic behavior which involved them. Based on the data obtained, hypotheses to explain the expression control of these genes as well as their inter-relationships were here presented.

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana_claudia_claudina_nascimento_parte1.pdf: 27305878 bytes, checksum: 527cea9fbcd120e48c6f54d11987d84b (MD5) Previous issue date: 2013-08-23 / Increased pollution / environmental degradation has been observed with a growing concern for global communities , considering its main resulting health problems and significant losses of natural systems . Among the contaminants , heavy metals have been gaining prominence for its toxicity and accumulation in food chains . Among the methods of removing / minimizing metals , bioremediation is gaining momentum as a viable alternative for the treatment of polluted environments . Cadmium is a metal of high toxicity , and induces cellular changes that affect the morphology and activity of polymers and enzyme systems of living systems . However , some systems exhibit tolerance to the presence of cadmium and the study of these changes may provide important data to contribute to the bioremediation of heavy metals . This formal, this proposal aims to evaluate the behavior of oxidative enzymes and total proteins , polyphosphates and cellular structure and sorption of metal ion in Aspergillus nidulans in response to growth in the presence of 1 mM , 2 mM and 3 mM cadmium. The results will serve as input for understanding the metabolic mechanisms associated with survival and maintenance and cell viability , which can be applied in bioremediation of heavy metal contaminated environments protocols . Thus , in order to better understand the potential toxicity of an environmental component and its effects on local biota , one broad view is needed that involves knowledge related to genetics, proteomics , cellular metabolism and higher levels of biological organization, order to make this type of study biomarkers with an essential tool for the management and conservation of the environment . / O aumento da poluição/degradação ambiental tem sido observado com uma crescente preocupação pelas comunidades globais, considerando como sua principal resultante os problemas de saúde e perdas significativas dos sistemas naturais. Dentre os contaminantes, os metais pesados vêm obtendo destaque por sua toxicidade e acumulação nas cadeias tróficas. Dentre os métodos de remoção/minimização de metais, a biorremediação vem ganhando espaço como alternativa viável para o tratamento de ambientes poluídos. O cádmio é um metal de altíssima toxicidade, e induz alterações celulares, que atingem a morfologia, bem como a atividade de polímeros e sistemas enzimáticos dos sistemas vivos. Contudo, alguns sistemas exibem tolerância á presença do cádmio e o estudo dessas modificações poderá fornecer dados importantes para contribuir com a biorremediação de metais pesados. Dessa formal, a presente proposta visa avaliar o comportamento de enzimas oxidativas, bem como proteínas totais, polifosfatos e estrutura celular e sorção do íon metálico em Aspergillus nidulans como resposta ao crescimento em presença de 1mM, 2mM e 3mM de cádmio. Os resultados servirão como elemento de base para o entendimento dos mecanismos metabólicos associados á sobrevivência e manutenção e viabilidade celular, que podem ser aplicados em protocolos de biorremediação de ambientes contaminados com metais pesados. Com isso, a fim de uma melhor compreensão do potencial tóxico de um componente ambiental e seus efeitos sobre a biota local, é necessária um visão ampla que envolva conhecimentos relacionados à genética, proteômica, metabolismo celular e de níveis de organização biológica mais elevada, a fim de tornar este tipo de estudo com biomarcadores uma ferramenta fundamental para o manejo e conservação do meio ambiente.