Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2007. / Title from first page of PDF file. Includes bibliographical references (p. 191-209).

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2009. / Härtill 5 uppsatser.

Nitric oxide is a ubiquitous signaling molecule with both physiological and pathological functions in biological systems. Formed by the enzymatic conversion of arginine to citrulline, NO, has known roles in circulatory, immune and nervous tissues. In the nervous system nitric oxide has been implicated in long-term potentiation, neurotransmitter release, channel function, neuronal protection and neuronal degeneration. Much of our work has focused on yet another role for nitric oxide in cells, namely, neuronal differentiation. During development, neuronal differentiation is closely coupled with cessation of proliferation. We use nerve growth factor (NGF)-induced differentiation of PC12 pheochromocytoma cells as a model and find a novel signal transduction pathway that blocks cell proliferation. Treatment of PC12 cells with NGF leads to induction of nitric oxide synthase (NOS). The resulting nitric oxide (NO) acts as a second messenger, activating the p21(WAF1) promoter and inducing expression of p21(WAF1) cyclin-dependent kinase inhibitor. NO activates the p21(WAF1) promoter by p53-dependent and p53-independent mechanisms. Blocking production of NO with an inhibitor of NOS reduces accumulation of p53, activation of the p21(WAF1) promoter, expression of neuronal markers, and neurite extension. To deternine whether p21(WAF1) is required for neurite extension, we prepared a PC12 line with an inducible p21(WAF1) expression vector. Blocking NOS with an inhibitor decreases neurite extension, but induction of p21(WAF1) with isopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside restored this response. Levels of p21(WAF1) induced by isopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside were similar to those induced by NGF. Therefore, we have identified a signal transduction pathway that is activated by NGF; proceeds through NOS, p53 and p21(WAF1) to block cell proliferation; and is required for neuronal differentiation by PC12 cells. In further studies of this pathway, we have examined the role of MAP kinase pathways in neuronal nitric oxide synthase (nNOS) induction during the differentiation of PC12 cells. In NGF-treated PC12 cells, we find that nNOS is induced at RNA and protein levels, resulting in increased NOS activity. We note that neither nNOS mRNA, nNOS protein nor NOS activity is induced by NGF treatment in cells that have been infected with a dominant negative Ras adenovirus. We have also used drugs that block MAP kinase pathways and assessed their ability to inhibit nNOS induction. Even though U0126 and PD98059 are both MEK inhibitors, we find that U0126, but not PD98059, blocks nNOS induction and NOS activity in NGF-treated PC12 cells. Also, the p38 kinase inhibitor, SB 203580, does not block nNOS induction in our clone of PC12 cells. Since the JNK pathway is not activated in NGF-treated PC12 cells, we determine that the Ras-ERK pathway and not the p38 or JNK pathway is required for nNOS induction in NGF-treated PC12 cells. We find that U0l26 is much more effective than PD98059 in blocking the Ras-ERK pathway, thereby explaining the discrepancy in nNOS inhibition. We conclude that the Ras-ERK pathway is required for nNOS induction. The activation of soluble guanylate cyclase and the production of cyclic GMP is one of the best characterized modes of NO action. Having shown that inhibition of NOS blocks PC12 cell differentiation we tested whether nitric oxide acts through soluble guanylate cyclase to lead to cell cycle arrest and neuronal differentiation. Unlike NOS inhibition, the inhibition of soluble guanylate cylcase does not block the induction of neuronal markers. Moreover, treatment of NGF-treated, NOS-inhibited PC12 cells with a soluble analog of cyclic GMP was unable to restore differentiation of those cells. Hence, cGMP is not a component of this pathway and we had to consider other mechanisms of NO action. It has become increasingly evident that another manner by which NO may exert its effects is by S-nitrosylation of cysteine residues. We tested, in vitro whether nitric oxide may control p53 by S-nitrosylation and inactivation of the p53 negative regulator, Hdm2. Treatment of Hdm2 with a nitric oxide donor inhibits Hdm2-p53 binding, the first step in Hdm2 regulation of p53. The presence of cysteine or DTT blocks this inhibition of binding. Moreover, nitric oxide inhibition of Hdm2-p53 binding was found to be reversible. Sulfhydryl-sensitivity and reversibility are consistent with nitrosylation. Finally, we have identified a critical cysteine residue that nitric oxide modifies in order to disrupt Hdm2-p53 binding. Mutation of this residue from a cysteine to an alanine does not interfere with binding but rather eliminates the sensitivity of Hdm2 to nitric oxide inactivation.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é a quarta causa mais frequente de morte por câncer em todo o mundo. Este estudo teve dois grandes objetivos, o primeiro foi estabelecer o carcinoma hpatocelular experimental por indução química e o segundo estudar os efeitos da melatonina sobre o estresse oxidativo, estresse de retículo endoplasmático e apoptose durante a hepatocarcinogênese. Foram realizados dois experimentos, ambos utilizaram dietilnitrosamina (DEN) mais acetilaminofluoreno (2-AAF) em ratos Wistar machos pesando 145-150 g. O primeiro estudo testou 3 protocolos de indução do câncer hepático. Os animais foram divididos em três grupos testes: DEN50: que recebeu DEN 50 mg duas vezes por semana até a 6ª semana e uma vez por semana nas semanas 11 a 13. DEN75: recebeu DEN 75mg uma vez por semana nas semanas até a 6ª semana e um reforço nas semanas de 11 a 13. DEN100: recebeu 5 doses de DEN 100mg uma a cada seis semanas por 28 semanas. Todos receberam 2- AAF dose única de 100 mg na 4ª semana. Após a indução foi comprovado por testes bioquímicos, macroscópico e histológico que o protocolo DEN50 desenvolve CHC avançado em 19 semanas, apresentou a fase inflamatória na 5ª semana e cirrose na 12ª semana. O protocolo DEN100 exibe padrão de lesões pré-cancerosas com cirrose em 28 semanas. O protocolo DEN75 foi o mais heterogêneo dos três, pois desenvolveu lesões pré-cancerosas, cancer inicial e CHC avançado. O segundo estudo, repetiu o protocolo DEN50 e administrou melatonina 20mg/L. Os tratamentos começaram nas semanas 5 e 12. Ao final de 19 semanas foi observado que animais do grupo que só recebeu DEN+2-AAF (DEN-CHC) desenvolveram carcinoma avançado, exibiram mais expressão de proteinas pró-inflamatórias (iNOS, COX-2 e NFkB). E animais tratados com Melatonina (DEN+MEL5 e DEN+MEL 12) apresentaram padrão histológico de cirrose e reduzida expressão destas proteinas. Quanto ao comportamento oxidativo foi observado que grupo DEN-CHC apresentou menor lipoperoxidação (LPO) por redução de ácidos graxos poliinsaturados, maior oxidação proteica, menor atividade da SOD e maior índice de danos ao DNA. O tratamento com melatonina ao longo da hepatocarcinogênese se mostrou efetivo para proteger a membrana lipidica, reduziu a oxidação proteica, aumentou a atividade da SOD e atenuou o dano ao DNA. Por fim, referente ao estresse de retículo endoplasmático e apoptose, animais com DEN-CHC não apresentaram ativação das proteinas de estresse de retículo (BiP, ATF6 e CHOP) nem acionaram as rotas apoptóticas. Entretanto, animais tratados com Melatonina tiveram aumento significativo na expressão de proteinas como BiP, ATF6 e CHOP, assim como proteinas pró-apoptóticas. Nossos resultados apontam que a melatonin, durante o processo de hepatocarcinogênese experimental, atuou como anti-inflamatório, antioxidante e pró-apoptótico. E estas ações contribuiram para evitar a progressão do carcinoma hepatocelular. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fourth most frequent cause of cancer death worldwide. This study had two main objectives, the first was to establish the experimental hpatocelular carcinoma by chemical induction and the second study the effects of melatonin on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptosis during hepatocarcinogenesis. Two experiments were conducted, both used Diethylnitrosamine (DEN) + acetylaminofluorene (2-AAF) in male Wistar rats weighing 145-150 g. The first study tested three induction protocols of liver cancer. The animals were divided into three test groups: DEN50: DEN that received 50 mg twice a week until 6 weeks and once a week during the weeks 11 and 13. DEN75: DEN received 75mg once a week during the weeks to 6 weeks and another reinforcement in weeks 11 to 13 DEN100: DEN received 5 doses of 100mg one every six weeks for 28 weeks. All received 2 AAF single dose of 100 mg at week 4. After induction was confirmed by biochemical, macroscopic and histological tests that DEN50 protocol develops advanced HCC in 19 weeks, presents inflammatory phase in the 5th week and cirrhosis at 12 weeks. The default display protocol DEN100 of precancerous lesions and cirrhosis in 28 weeks. DEN75 The protocol was the most heterogeneous of the three, as developed precancerous lesions, early cancer and advanced HCC. The second study, repeated the DEN50 protocol and administered melatonin 20mg / L. The treatments began on week 5 and 12. At the end of 19 weeks was observed that animals in the group that received only DEN (DEN-CHC) developed advanced carcinoma exhibited over expression of proinflammatory proteins (iNOS, COX-2 and NFkB). And animals treated with melatonin (DEN+ MEL5W and DEN+MEL 12W) showed histological pattern of cirrhosis and reduced expression of these proteins. As for the oxidative behavior was observed that DEN-HCC group had lower lipid peroxidation (LPO) by reducing polyunsaturated fatty acids, higher protein oxidation, lower activity of SOD and higher rate of DNA damage. Treatment with melatonin throughout hepatocarcinogenesis was effective to protect the lipid membrane, protein oxidation decreased, increased SOD activity and attenuated DNA damage. Finally, referring to the endoplasmic reticulum stress and apoptosis, animal DEN-CHC did not show activation of reticulum stress protein (BiP, ATF6 and CHOP) or triggered apoptotic routes. However, melatonin treated animals had a significant increase in the expression of proteins and BiP, CHOP and ATF6, as well as pro-apoptotic proteins. Our results indicate that melatonin, during the process of experimental hepatocarcinogenesis, acted as anti-inflammatory, antioxidant and pro-apoptotic. And these actions contributed to prevent progression of hepatocellular carcinoma.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Evidências crescentes têm demonstrado que o exercício prejudica a estrutura da membrana eritrocitária, como consequência do aumento do estresse físico e químico. O óxido nítrico (NO) derivado dos eritrócitos afeta a fluidez da membrana e a sua biodisponibilidade depende do equilíbrio entre a sua síntese e eliminação por espécies reativas de oxigênio. Nós investigamos se o exercício realizado em diferentes intensidades afetaria biodisponibilidade do NO eritrocitário e se levaria a um quadro de estresse oxidativo. Dez homens (26 4 anos, VO2pico 44,1 4,3 mL.kg-1.min-1) realizaram um teste cardiopulmonar máximo em esteira e um teste de exercício submáximo a 70% VO2pico durante 30 min. O sangue foi coletado em repouso e imediatamente após os exercícios para isolamento dos eritrócitos. O exercício máximo aumentou a contagem de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, sem levar a qualquer alteração na massa corporal que pudesse sugerir hemoconcentração devido a uma redução do volume plasmático. Observou-se uma diminuição do influxo de L-arginina depois do teste submáximo, mas não no teste máximo. No entanto, a atividade da óxido nítrico sintase, ou seja, a produção de NO, foi aumentada após o teste máximo. Os níveis de GMPc não se alteraram após ambos os teste de exercício. Em relação aos biomarcadores de estresse oxidativo, o exercício submáximo reduziu a oxidação proteica e aumentou a atividade da catalase e a expressão da glutationa peroxidase, enquanto que o exercício máximo levou a uma maior peroxidação lipídica e diminuição da atividade da SOD. Nem a atividade glutationa peroxidase ou a expressão NADPH oxidase foram afetadas pelo exercício. Estes resultados sugerem que o exercício induziu alterações no estresse oxidativo de eritrócitos, que parecem estar mais associadas com a intensidade do que a duração do execicio. Além disso, nas intensidades recomendadas para a promoção da saúde, o exercício mostrou ser protetor, aumentando a atividade e a expressão de enzimas antioxidantes importantes e reduzindo os danos oxidativos. / Growing evidence has shown that exercise impairs erythrocyte membrane structure as a consequence of increased physical and chemical stress. Erythrocyte-derived nitric oxide (NO) affects membrane fluidity, and its bioavailiability depends on the balance between its synthesis and scavenging by reactive oxygen species. Here, we investigated whether aerobic exercise performed at different intensities would affect erythrocyte NO bioavailability and oxidative stress. Ten men (26 4 years old, VO2peak 44.1 4.3 mL.kg-1.min-1) performed a treadmill maximal cardiopulmonary exercise test, and a submaximal exercise at 70% VO2peak during 30 min. Blood was collected at rest and immediately after exercises for erythrocytes isolation. Maximal exercise increased erythrocytes count, haemoglobin and haematocrit levels, without any change in body mass that could suggest haemoconcentration due to a plasma volume reduction. It was observed a decrease in L-arginine influx after moderate, but not maximal exercise. Yet, nitric oxide synthase activity, and thus, NO production, was increased after maximal exercise. Cyclic GMP levels did not change after both exercise bouts. In relation to biomarkers of oxidative stress, moderate exercise reduced protein oxidation, and increased catalase activity and glutathione peroxidise expression; whereas maximal exercise led to greater lipid peroxidation, and diminished SOD activity. Neither glutathione peroxidase activity nor NADPH expression were affected by exercise. These findings suggest that exercise induced changes in erythrocyte oxidative stress are more associated with intensity than duration. Furthermore, at intensities recommended for health promotion, exercise was shown to be protective, increasing the activity and expression of important antioxidant enzymes and reducing oxidative damage.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Methylmalonic acidemia is an inborn error of metabolism characterized clinically and biochemically by tissue accumulation of methylmalonic acid (MMA) and neurological dysfunction, including convulsion. Furthermore, clinical data suggest that infections conditions can precipitate metabolic crisis and cause neurological changes observed in patients of acidemia. Provided that the MMA cause neurological complications, and that the inflammation can contribute to the occurrence of convulsions and cognitive deficit in several animal models, it is possible to suggest that inflammatory mediators, such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), facilitate MMA-induced convulsions. The iNOS is one of three isoforms of nitric oxide synthase (NOS), which generates nitric oxide (NO), a simple gaseous signaling molecule and free radical. The iNOS is induced at injury/inflammation sites, but is also constitutively expressed on some cells, such as in neurons. Studies in experimental models have already demonstrated that NO generated in the central nervous system (CNS), by endothelial and neuronal isoforms of NOS, is involved in MMA-induced convulsions. However, until the present moment are scarce the data in the literature evaluating the relationship of iNOS in experimental models of Methylmalonic Acidemia. The results published in the article has shown that iNOS knock-out C57BL/6 mice, when injected acutely with MMA (2 μmols/2 μl, intracerebroventricularly), have a shorter duration of seizures, no significant change in the mean amplitude of electroencephalographic waves (EEG); not increase the levels of nitrite and nitrate (NOx) compared to animals injected with saline, but have a partial reduction in the levels of 3-nitrotyrosine (3-NT) compared to wild animals that were also treated with MMA; similarly, show a partially lower inhibition of Na+,K+-ATPase, but exhibit no difference in succinate dehydrogenase (SDH) inhibition on cerebral cortex compared to wild mice which also received MMA. The results submitted in the manuscript has shown that Wistar rats, after being injected chronically with MMA (from 5th to 28th day of life, twice daily, with doses ranging from 0.76 to 1.67 mmol/g depending on the age of the animal, via subcutaneous) showed a reduced index of recognition in spatial learning/memory test, but show no anxiety at elevated plus maze test; they have a reduction in neutrophils, but an increase in the number of mononuclear leukocytes in the blood; and in addition show increased levels of interleukin-1beta (IL-1β), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), iNOS and 3-NT in the cerebral cortex. Considering the data presented in both studies, it was concluded that the MMA can cause seizures, nitrosative stress and inhibition of Na+,K+-ATPase activity in cerebral cortex of mice by mechanisms related to NO production via iNOS; and that the MMA can also cause neurocognitive deficits, altered immune system in blood and increase of pro-inflammatory cytokines, leading to increased expression of iNOS and nitrosative stress. / A Acidemia Metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado bioquimicamente e clinicamente pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) e disfunção neurológica, incluindo convulsões e déficit cognitivo. Além disso, dados clínicos sugerem que quadros infecciosos podem precipitar crises metabólicas e causar as alterações neurológicas observadas nos pacientes com essa acidemia. Desde que o MMA causa complicações neurológicas, e que a inflamação pode contribuir para a ocorrência de convulsões e déficits cognitivos em vários modelos animais, é possível sugerir que mediadores inflamatórios, como a enzima Óxido Nítrico Sintase Induzível (iNOS), facilitem as convulsões induzidas por MMA. A iNOS é uma das três isoformas da enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS), que gera o óxido nítrico (NO), uma molécula gasosa simples, sinalizadora e um radical livre. A iNOS é induzida em sítios de lesão/inflamação, mas também se expressa constitutivamente em algumas células, como nos neurônios. Estudos em modelos experimentais já demonstraram que o NO gerado no sistema nervos central (SNC), pelas isoformas endotelial e neuronal da NOS, tem envolvimento nas convulsões induzidas por MMA. Contudo, até o presente momento são escassos os dados na literatura avaliando a relação da iNOS em modelos experimentais da Acidemia Metilmalônica. Os resultados publicados no artigo mostraram que camundongos C57BL/6 nocaute para iNOS, ao serem injetados agudamente com MMA (2 μmols/2 μL, via intracerebroventricular), apresentam uma duração menor das convulsões, sem alteração significativa na amplitude média das ondas eletroencefalográficas (EEG); não aumentam os níveis de nitrito e nitrato (NOx) comparado aos animais injetados com solução salina, mas têm uma redução parcial nos níveis de 3-nitrotirosina (3-NT) comparado aos animais selvagens que também foram tratados com MMA; semelhantemente, mostram uma inibição parcialmente menor na atividade da enzima Na+,K+-ATPase; mas não exibem diferença na inibição da atividade da succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral quando comparados aos camundongos selvagens que também receberam MMA. Os resultados apresentados no manuscrito submetido mostram que ratos Wistar, após serem injetados cronicamente com MMA (do 5º ao 28º dia de vida, duas vezes ao dia, com doses variando de 0,76 à 1,67 mmol/g em função da idade do animal, via subcutânea), apresentam um reduzido índice de reconhecimento em teste de memória/aprendizado espacial, mas não demonstram ansiedade no teste do labirinto em cruz elevado; têm uma redução no número de neutrófilos, mas um aumento no número de leucócitos mononucleares no sangue; e além disso mostram aumento nos níveis de interleucina-1beta (IL-1β), do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), de iNOS e de 3-NT no córtex cerebral. Considerando os dados apresentados nos dois estudos, concluiu-se que o MMA pode causar convulsões, estresse nitrosativo e inibição da enzima Na+,K+-ATPase no córtex cerebral de camundongos por mecanismos relacionados à produção de NO via iNOS; e que o MMA também pode causar déficit neurocognitivo, alteração do sistema imunológico no sangue, e aumento de citocinas pró-inflamatórias, levando ao aumento na expressão da iNOS e estresse nitrosativo.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Evidências crescentes têm demonstrado que o exercício prejudica a estrutura da membrana eritrocitária, como consequência do aumento do estresse físico e químico. O óxido nítrico (NO) derivado dos eritrócitos afeta a fluidez da membrana e a sua biodisponibilidade depende do equilíbrio entre a sua síntese e eliminação por espécies reativas de oxigênio. Nós investigamos se o exercício realizado em diferentes intensidades afetaria biodisponibilidade do NO eritrocitário e se levaria a um quadro de estresse oxidativo. Dez homens (26 4 anos, VO2pico 44,1 4,3 mL.kg-1.min-1) realizaram um teste cardiopulmonar máximo em esteira e um teste de exercício submáximo a 70% VO2pico durante 30 min. O sangue foi coletado em repouso e imediatamente após os exercícios para isolamento dos eritrócitos. O exercício máximo aumentou a contagem de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, sem levar a qualquer alteração na massa corporal que pudesse sugerir hemoconcentração devido a uma redução do volume plasmático. Observou-se uma diminuição do influxo de L-arginina depois do teste submáximo, mas não no teste máximo. No entanto, a atividade da óxido nítrico sintase, ou seja, a produção de NO, foi aumentada após o teste máximo. Os níveis de GMPc não se alteraram após ambos os teste de exercício. Em relação aos biomarcadores de estresse oxidativo, o exercício submáximo reduziu a oxidação proteica e aumentou a atividade da catalase e a expressão da glutationa peroxidase, enquanto que o exercício máximo levou a uma maior peroxidação lipídica e diminuição da atividade da SOD. Nem a atividade glutationa peroxidase ou a expressão NADPH oxidase foram afetadas pelo exercício. Estes resultados sugerem que o exercício induziu alterações no estresse oxidativo de eritrócitos, que parecem estar mais associadas com a intensidade do que a duração do execicio. Além disso, nas intensidades recomendadas para a promoção da saúde, o exercício mostrou ser protetor, aumentando a atividade e a expressão de enzimas antioxidantes importantes e reduzindo os danos oxidativos. / Growing evidence has shown that exercise impairs erythrocyte membrane structure as a consequence of increased physical and chemical stress. Erythrocyte-derived nitric oxide (NO) affects membrane fluidity, and its bioavailiability depends on the balance between its synthesis and scavenging by reactive oxygen species. Here, we investigated whether aerobic exercise performed at different intensities would affect erythrocyte NO bioavailability and oxidative stress. Ten men (26 4 years old, VO2peak 44.1 4.3 mL.kg-1.min-1) performed a treadmill maximal cardiopulmonary exercise test, and a submaximal exercise at 70% VO2peak during 30 min. Blood was collected at rest and immediately after exercises for erythrocytes isolation. Maximal exercise increased erythrocytes count, haemoglobin and haematocrit levels, without any change in body mass that could suggest haemoconcentration due to a plasma volume reduction. It was observed a decrease in L-arginine influx after moderate, but not maximal exercise. Yet, nitric oxide synthase activity, and thus, NO production, was increased after maximal exercise. Cyclic GMP levels did not change after both exercise bouts. In relation to biomarkers of oxidative stress, moderate exercise reduced protein oxidation, and increased catalase activity and glutathione peroxidise expression; whereas maximal exercise led to greater lipid peroxidation, and diminished SOD activity. Neither glutathione peroxidase activity nor NADPH expression were affected by exercise. These findings suggest that exercise induced changes in erythrocyte oxidative stress are more associated with intensity than duration. Furthermore, at intensities recommended for health promotion, exercise was shown to be protective, increasing the activity and expression of important antioxidant enzymes and reducing oxidative damage.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é a quarta causa mais frequente de morte por câncer em todo o mundo. Este estudo teve dois grandes objetivos, o primeiro foi estabelecer o carcinoma hpatocelular experimental por indução química e o segundo estudar os efeitos da melatonina sobre o estresse oxidativo, estresse de retículo endoplasmático e apoptose durante a hepatocarcinogênese. Foram realizados dois experimentos, ambos utilizaram dietilnitrosamina (DEN) mais acetilaminofluoreno (2-AAF) em ratos Wistar machos pesando 145-150 g. O primeiro estudo testou 3 protocolos de indução do câncer hepático. Os animais foram divididos em três grupos testes: DEN50: que recebeu DEN 50 mg duas vezes por semana até a 6ª semana e uma vez por semana nas semanas 11 a 13. DEN75: recebeu DEN 75mg uma vez por semana nas semanas até a 6ª semana e um reforço nas semanas de 11 a 13. DEN100: recebeu 5 doses de DEN 100mg uma a cada seis semanas por 28 semanas. Todos receberam 2- AAF dose única de 100 mg na 4ª semana. Após a indução foi comprovado por testes bioquímicos, macroscópico e histológico que o protocolo DEN50 desenvolve CHC avançado em 19 semanas, apresentou a fase inflamatória na 5ª semana e cirrose na 12ª semana. O protocolo DEN100 exibe padrão de lesões pré-cancerosas com cirrose em 28 semanas. O protocolo DEN75 foi o mais heterogêneo dos três, pois desenvolveu lesões pré-cancerosas, cancer inicial e CHC avançado. O segundo estudo, repetiu o protocolo DEN50 e administrou melatonina 20mg/L. Os tratamentos começaram nas semanas 5 e 12. Ao final de 19 semanas foi observado que animais do grupo que só recebeu DEN+2-AAF (DEN-CHC) desenvolveram carcinoma avançado, exibiram mais expressão de proteinas pró-inflamatórias (iNOS, COX-2 e NFkB). E animais tratados com Melatonina (DEN+MEL5 e DEN+MEL 12) apresentaram padrão histológico de cirrose e reduzida expressão destas proteinas. Quanto ao comportamento oxidativo foi observado que grupo DEN-CHC apresentou menor lipoperoxidação (LPO) por redução de ácidos graxos poliinsaturados, maior oxidação proteica, menor atividade da SOD e maior índice de danos ao DNA. O tratamento com melatonina ao longo da hepatocarcinogênese se mostrou efetivo para proteger a membrana lipidica, reduziu a oxidação proteica, aumentou a atividade da SOD e atenuou o dano ao DNA. Por fim, referente ao estresse de retículo endoplasmático e apoptose, animais com DEN-CHC não apresentaram ativação das proteinas de estresse de retículo (BiP, ATF6 e CHOP) nem acionaram as rotas apoptóticas. Entretanto, animais tratados com Melatonina tiveram aumento significativo na expressão de proteinas como BiP, ATF6 e CHOP, assim como proteinas pró-apoptóticas. Nossos resultados apontam que a melatonin, durante o processo de hepatocarcinogênese experimental, atuou como anti-inflamatório, antioxidante e pró-apoptótico. E estas ações contribuiram para evitar a progressão do carcinoma hepatocelular. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fourth most frequent cause of cancer death worldwide. This study had two main objectives, the first was to establish the experimental hpatocelular carcinoma by chemical induction and the second study the effects of melatonin on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptosis during hepatocarcinogenesis. Two experiments were conducted, both used Diethylnitrosamine (DEN) + acetylaminofluorene (2-AAF) in male Wistar rats weighing 145-150 g. The first study tested three induction protocols of liver cancer. The animals were divided into three test groups: DEN50: DEN that received 50 mg twice a week until 6 weeks and once a week during the weeks 11 and 13. DEN75: DEN received 75mg once a week during the weeks to 6 weeks and another reinforcement in weeks 11 to 13 DEN100: DEN received 5 doses of 100mg one every six weeks for 28 weeks. All received 2 AAF single dose of 100 mg at week 4. After induction was confirmed by biochemical, macroscopic and histological tests that DEN50 protocol develops advanced HCC in 19 weeks, presents inflammatory phase in the 5th week and cirrhosis at 12 weeks. The default display protocol DEN100 of precancerous lesions and cirrhosis in 28 weeks. DEN75 The protocol was the most heterogeneous of the three, as developed precancerous lesions, early cancer and advanced HCC. The second study, repeated the DEN50 protocol and administered melatonin 20mg / L. The treatments began on week 5 and 12. At the end of 19 weeks was observed that animals in the group that received only DEN (DEN-CHC) developed advanced carcinoma exhibited over expression of proinflammatory proteins (iNOS, COX-2 and NFkB). And animals treated with melatonin (DEN+ MEL5W and DEN+MEL 12W) showed histological pattern of cirrhosis and reduced expression of these proteins. As for the oxidative behavior was observed that DEN-HCC group had lower lipid peroxidation (LPO) by reducing polyunsaturated fatty acids, higher protein oxidation, lower activity of SOD and higher rate of DNA damage. Treatment with melatonin throughout hepatocarcinogenesis was effective to protect the lipid membrane, protein oxidation decreased, increased SOD activity and attenuated DNA damage. Finally, referring to the endoplasmic reticulum stress and apoptosis, animal DEN-CHC did not show activation of reticulum stress protein (BiP, ATF6 and CHOP) or triggered apoptotic routes. However, melatonin treated animals had a significant increase in the expression of proteins and BiP, CHOP and ATF6, as well as pro-apoptotic proteins. Our results indicate that melatonin, during the process of experimental hepatocarcinogenesis, acted as anti-inflammatory, antioxidant and pro-apoptotic. And these actions contributed to prevent progression of hepatocellular carcinoma.

1 Univerzita Karlova v Praze 1. lékařská fakulta Některé aspekty patofyziologie plicní arteriální hypertenze a její výskyt v České republice Some aspects of pathophysiology of pulmonary arterial hypertension and its epidemiology in the Czech Republic MUDr. Pavel Jansa Praha 2011 2 Abstract Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a group of diseases characterized by a progressive increase of resistance and pressure in pulmonary vascular bed. In all types of PAH the same four pathological processes are reported: vasoconstriction, inflammation, thrombosis and remodelling. The genetic background is essential for the development of PAH. We aimed to investigate the role of polymorphisms of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) genes in PAH. We studied 142 PAH patients and 189 healthy subjects. We examined 3 polymorphisms of the eNOS gene, including the Glu298Asp polymorphism, 27-base pair (bp) variable numbers of tandem repeats (VNTR) and -786 T/C promoter gene polymorphism. Prevalence of 27-bp VNTR allele A was higher in patients with PAH compared with healthy controls. Patients with PAH associated with connective tissue diseases had higher prevalence of AA genotype compared with other PAH subgroups. The Glu298Asp polymorphism and -786 T/C polymorphism are not associated with PAH. Thrombotic arteriopathy is...