Abstract Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease with symmetrical articular manifestations. The etiology of the disease is unknown. The prevalence of RA is approximately 0.5–1.0% in adults. In Finland, the annual incidence is 39/100 000. RA is about three times more common in females than in males. Most commonly the disease affects first the joints of feet and fingers. Chronic inflammation leads to erosions of cartilage, bone and tendons and may destroy the whole joint. The diagnosis of RA is mainly based on the clinical features of the disease. The American College of Rheumatology (ACR) 1987 revised classification criteria of RA have commonly been used for diagnosis. No specific diagnostic test is available. Rheumatoid factor (RF) has traditionally been used in the diagnosis, but only 70 to 80% of RA patients have RF in their serum. Other antibodies found in RA are the antiperinuclear factor (APF), the anti-keratin antibody (AKA) and the antibodies to cyclic citrullinated peptide (CCP), which recognize the citrulline-containing antigenic filaggrin protein. Citrulline is an amino acid that is post-translationally formed from arginine by peptidylarginine deiminase enzymes (PADs). Autoantibodies to citrullinated proteins are more specific for RA than RF. There is no filaggrin in joints, which indicates that the autoantibodies reacting with this protein most probably only reflect immunological cross-reaction. It has been postulated that autoimmunity against collagens might be involved in the pathogenesis of RA. There are antibodies binding to collagen in cartilage (type II collagen) and in bone (type I collagen). They have been tested by using collagen preparations rendered soluble by pepsin digestion. This digestion removes the carboxyterminal (C-terminal) telopeptides of collagen. Autoantibodies to the C-telopeptides of type I and II collagens were studied in this doctoral research. Autoantibodies to the citrullinated C-telopeptides of type I and II collagens were found in the serum of patients with RA. ELISA, CLIA and inhibition ELISA were used to detect these autoantibodies. Automatic CLIA gives a more than twofold number of positive findings compared to previous ELISA. Currently the best method for the detection of these autoantibodies is inhibition ELISA. These autoantibodies are specific for citrulline in the peptide sequence. Autoantibodies that bind the normal C-telopeptides of type I and II collagens were not inhibited by soluble normal or citrullinated telopeptides. However, the antibodies that bind only citrullinated telopeptides could be inhibited by corresponding citrullinated telopeptides. Autoantibodies binding the citrullinated telopeptides of type II collagen and anti-CCP predict synergistically the development of seropositive RA. / Tiivistelmä Nivelreuma (arthritis rheumatoides) on krooninen autoimmuunisairaus, jonka aiheuttajaa ei tunneta. Nivelreuman esiintyvyys aikuisilla on 0.5–1.0 prosenttia. Siihen sairastuu vuosittain 39/100 000 suomalaista aikuista. Naiset sairastavat nivelreumaa kolme kertaa yleisemmin kuin miehet. Sairaus alkaa tavallisesti päkiöistä ja sormien nivelistä. Nivelreuma aiheuttaa ruston, luun ja nivelsiteiden syöpymistä ja voi lopulta tuhota koko nivelen. Nivelreuman diagnoosi perustuu pääasiassa taudin kliinisiin piirteisiin. Yhdysvaltain reumajärjestön (American College of Rheumatology, ACR) vuonna 1987 esittämät luokittelukriteerit ovat yleisesti käytössä. Taudin toteamiseen ei ole spesifistä laboratoriotestiä. Perinteisesti käytettyä reumatekijää esiintyy 70–80 prosentilla potilaista. Muita nivelreumapotilaan seerumista esiintyviä vasta-aineita ovat antiperinukleriaaritekijä (APF), keratiinivasta-aineet (AKA) ja vasta-aineet sykliseen sitrullinisoituneeseen peptidiin (CCP). Sitrulliini on aminohappo, jonka peptidyyliarginiini deiminaasi -entsyymit (PAD) ovat muokanneet arginiinista posttranslationaalisesti. Sitrullinisoituneiden proteiinien autovasta-aineet ovat spesifisempiä nivelreumassa kuin reumatekijä. Nivelissä ei ole filaggriinia, mikä viittaa siihen, että todetut vasta-aineet perustuvat immunologiseen ristireaktioon. On epäilty, että nivelreuman patogeneesiin voisi liittyä autoimmuniteettia kollageeniin. Aiemmin tutkitut luun ja ruston (tyypin I ja II) kollageenivasta-aineet eivät ole olleet sitrullinisoituneita. Autovasta-ainetesteissä on käytetty pepsiinidigestiota, jolla kollageeni on saatu liukoiseksi. Pepsiinidigestio tuhoaa kuitenkin kollageenin karboksyyliterminaaliset (C-terminal) telopeptidit. Tässä väitöskirjatutkimuksessa tutkittiin tyypin I ja II kollageenien C-telopeptidejä. Nivelreumapotilaiden seerumissa todettiin autovasta-aineita, jotka sitoutuvat sitrullinisoituneisiin tyypin I ja II kollageeneihin. Todettuja vasta-aineita voidaan osoittaa ELISA-, CLIA- ja inhibitio-ELISA-menetelmillä. Automaattisella CLIA:lla saadaan kaksi kertaa enemmän positiivisia löydöksiä kuin aiemmin kehitetyllä ELISA:lla. Tällä hetkellä paras menetelmä näiden autovasta-aineiden osoittamiseen on inhibitio-ELISA. Todetut vasta-aineet ovat spesifisiä peptidin sekvenssissä olevaan sitrulliiniin. Vasta-aineita, jotka sitoutuvat normaaliin tyypin I ja II kollageenien C-telopeptidiin, ei voida inhiboida liukoisella normaalilla eikä sitrullinoidulla telopeptidillä. Kuitenkin vasta-aineita, jotka sitoutuvat vain sitrullinisoituihin telopeptideihin, voidaan inhiboida vastaavalla liukoisella sitrullinisoidulla telopeptidillä. Autovasta-aineet, jotka sitoutuvat samanaikaisesti sitrullinisoituneeseen tyypin II kollageenin C-telopeptidiin ja anti-CCP:hen ennustavat seropositiivista nivelreumaa.

Abstract Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease causing inflammation of synovial joints, which may lead to permanent changes in cartilage and bone tissues. RA patients have antibodies binding to citrullinated and also to carbamylated proteins. Antibodies binding to citrulline are associated with more severe disease progression and may already appear years before clinical disease onset. Citrulline and the lysine carbamylation product, homocitrulline, are similar in structure. Citrullinated proteins have been studied in RA and in neurological diseases, but researchers have been unaware of the effect of homocitrulline in citrulline detection methods. The purpose of the present study was to clarify the features of protein-bound citrulline and homocitrulline in relation to research done on citrullination and in immunological reactions related to rheumatoid arthritis. In the first study of this thesis the confounding role of homocitrulline in citrulline detection was shown. In the first and second study the features of experimentally induced antibodies were assessed. The antibodies induced with citrulline- and homocitrulline-containing protein structures were shown to react both with the ureido groups and the protein structures. The antibodies were able to distinguish between citrulline and homocitrulline in the same sequence even though binding to both. In the third study the simultaneous presence of citrulline and homocitrulline in RA synovial tissue was shown. In conclusion, considering the simultaneous presence of citrulline and homocitrulline and the binding features of the experimentally induced antibodies, homocitrulline could have a yet unsolved role in RA. Secondly, the existence of homocitrulline should be borne in mind in studies on citrullination. / Tiivistelmä Nivelreuma on niveltulehduksen aiheuttava autoimmuunitauti, joka voi johtaa pysyviin muutoksiin nivelen rusto- ja luukudoksessa. Nivelreumaa sairastavilla esiintyy vasta-aineita sitrullinoituneita ja karbamyloituneita proteiineja vastaan. Sitrulliiniin sitoutuvia vasta-aineita voi esiintyä elimistössä jo vuosia ennen taudin puhkeamista, ja niiden esiintyminen on yhdistetty vaikeampaan taudinkuvaan. Sitrulliini ja lysiinin karbamylaatiotuote homositrulliini ovat rakenteellisesti samankaltaisia. Proteiinien sitrullinaatiota on tutkittu nivelreumassa ja neurologisissa taudeissa, mutta homositrulliinin olemassaoloa tai sen vaikutusta tutkimusmenetelmiin ei ole huomioitu. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää proteiineihin sitoutuneiden sitrulliinin ja homositrulliinin ominaisuuksia aikaisempiin tutkimuksiin ja nivelreuman immunologisiin reaktioihin liittyen. Tässä tutkimuksessa homositrulliinin osoitettiin häiritsevän sitrulliinin tunnistamista. Ensimmäisessä ja toisessa osatyössä aiheutettiin kokeellisesti vasta-aineita sitrulliinia ja homositrulliinia sisältävillä proteiinirakenteilla. Vasta-aineiden havaittiin reagoivan sekä ureidoryhmän että proteiinirakenteen kanssa. Vasta-aineet pystyivät erottamaan sitrulliinin ja homositrulliinin toisistaan samassa rakenteessa, vaikka sitoutuivat kumpaankin. Kolmannessa osatyössä osoitettiin, että sitrulliinia ja homositrulliinia esiintyy samanaikaisesti nivelreumapotilaan tulehtuneessa nivelkalvossa. Tutkimus osoitti, että sitrulliinin ja homositrulliinin samanaikainen esiintyminen ja kokeellisesti aiheutettujen vasta-aineiden ominaisuudet huomioiden homositrulliinilla voi olla jokin toistaiseksi selvittämätön rooli nivelreumassa. Homositrulliinin olemassaolo on syytä huomioida sitrullinaatiota tutkittaessa.

Abstract Reduced physical function and persistent pain are serious consequences of rheumatoid arthritis (RA). Clinical trials have shown that patients with RA suffer from a poor health-related quality of life (HR-QoL). However, limited information is available on the HR-QoL of patients treated in normal clinical practice. The purpose of the present study was to obtain information of how RA can influence on the patients´ HR-QoL and functional ability in a clinical setting and to investigate the impact of disease-related and demographic factors on the HR-QoL. The theoretical framework of the study was the biopsychosocial concept of health, i.e. the ICF model (International Classification of Functioning, Disability and Health) endorsed by WHO. HR-QoL was measured by the Nottingham Health Profile (NHP) questionnaire and functional ability by the Health Assessment Questionnaire (HAQ). The contents of these instruments and the NHP results were evaluated also within the ICF categories. The study consisted of a cross-sectional series and a longitudinal cohort carried out in two central hospitals in Finland in the late 1990s. The cross-sectional group of 122 consecutive out-patients had a mean disease duration of 11 years. The HR-QoL values of the patients were compared with those of an age and gender matched ”healthy” control group living in the same area. The HR-QoL values of the patients were examined also at different functional ability levels. The longitudinal group of 62 consecutive patients had symptom duration ≤ 24 months and no prior use of antirheumatic drugs or glucocorticosteroids at inclusion. First, the impact of the treatment response assessed by the EULAR (DAS28) criteria on HR-QoL was examined at six months from disease onset. Secondly, the HR-QoL changes and their associations with age and gender and with the changes in disease activity, radiographic assessments of hands and feet and functional ability were examined for ten years after the onset of RA. RA patients had poorer scores than the controls in the NHP in the dimensions measuring mobility, pain and energy. These dimensions, along with sleep, displayed also a significant linear association with poorer HAQ levels (p < 0.001). A better treatment response during the first six months was linearly associated with better HR-QoL with respect to the pain, energy and mobility dimensions (p < 0.001). Those patients exhibiting no response to treatment had already at baseline the poorest HR-QoL in the dimension for pain and emotional reaction compared with those in the moderate and good responders. During the ten years´ follow-up, all NHP dimensions except social isolation displayed significant improvements, these being most marked during the first six months. Changes in disease activity correlated with changes in pain, energy and emotional reaction (p < 0.001). The mean level of the HAQ was well preserved over the ten years of this study and its changes were correlated with changes in pain, mobility and energy (p < 0.001). Women had somewhat poorer NHP improvements in the dimensions assessing energy, emotional reaction and social isolation than males. Disease duration associated strongly with poorer mobility and pain dimensions (p < 0.01). Within the ICF framework, pain, mobility, energy and sleep were identified as being the most important categories from the patient's perspective. The results of the present study demonstrate that RA has a major influence on the patients´ HR-QoL but early and active treatment can improve the situation. In the ICF framework, the NHP covers a broader spectrum of the ICF categories than can be assessed by the HAQ. / Tiivistelmä Alentunut fyysinen toimintakyky ja jatkuva kipu ovat nivelreumaan liittyviä vakavia seurannaisvaikutuksia. Kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että nivelreumaa sairastavat potilaat kärsivät huonontuneesta terveyteen liittyvästä elämänlaadusta. Normaalista kliinisestä käytännöstä saatava tieto potilaiden terveyteen liittyvästä elämänlaadusta on kuitenkin niukkaa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli saada tietoa nivelreuman vaikutuksista potilaiden terveyteen liittyvään elämänlaatuun ja toimintakykyyn kliinisessä asetelmassa ja tutkia sekä tautiin liittyvien että demografisten tekijöiden vaikutusta terveyteen liittyvään elämänlaatuun. Tutkimuksen teoreettisena viitekehyksenä käytettiin WHO:n hyväksymää toimintakyvyn, toimintarajoitteiden ja terveyden kansainvälistä luokitusta (ICF-malli). Terveyteen liittyvää elämänlaatua arvioitiin mittarilla Nottingham Health Profile (NHP) ja toimintakykyä mittarilla Health Assessment Questionnaire (HAQ). Kyseisten mittareiden sisältö samoin kuin NHP- tuloksia arvioitiin käyttämällä myös ICF- luokitusta. Tutkimus käsitti poikkileikkaus- ja pitkittäistutkimuksen, jotka toteutettiin 1990-luvun lopulla kahdessa suomalaisessa keskussairaalassa. Poikkileikkaustutkimukseen osallistui 122 perättäistä polikliinistä potilasta, joilla taudin kesto oli ollut keskimäärin 11 vuotta. Potilaiden terveyteen liittyvää elämänlaatua verrattiin samalla seudulla elävään iän ja sukupuolen suhteen kaltaistettuun verrokkiryhmään. Potilaiden terveyteen liittyvää elämänlaatua arvioitiin myös eri toimintakykytasoilla. Pitkittäistutkimus käsitti 62 perättäistä potilasta, joilla oireet olivat kestäneet ≤ 24 kuukautta ja jotka tutkimuksen alkaessa eivät olleet käyttäneet edeltävästi antireumaatteja tai kortikosteroideja. Näillä potilailla hoitovasteen vaikutusta terveyteen liittyvään elämänlaatuun arvioitiin EULAR DAS28- kriteerein kuuden kuukauden kohdalla taudin alusta. Lisäksi tutkittiin terveyteen liittyvän elämänlaadun muutoksia kymmenen vuoden ajalta nivelreuman alusta ja näiden muutosten yhteyttä ikään ja sukupuoleen, taudin aktiviteetissa ja käsissä ja jalkaterissä todettuihin röntgenmuutoksiin samoin kuin toimintakyvyn muutoksiin. Hoitovasteetta jääneillä potilailla oli jo lähtötilanteessa huonoin terveyteen liittyvä elämänlaatu kipu- ja tunnereaktiot- ulottuvuuksissa verrattuna kohtalaisen ja hyvän hoitovasteen saaneisiin. Kymmenen vuoden seurannassa kaikki NHP- ulottuvuudet sosiaalista eristyneisyyttä lukuun ottamatta osoittivat merkittävää paranemista. Selvintä se oli ensimmäisen kuuden kuukauden aikana. Taudin aktiviteetin muutokset korreloivat kipu-, tarmokkuus- ja tunnereaktiot- ulottuvuuksien muutoksiin (p <  0.001). Keskimääräinen HAQ- taso säilyi hyvänä kymmenen vuoden seurannassa ja HAQ- muutokset korreloivat kipu-, liikkuminen- ja tarmokkuus- ulottuvuuksien muutosten kanssa (p <  0.001). Naisilla oli miehiä jonkin verran huonompi NHP-paraneminen tarmokkuus-, tunnereaktiot- ja sosiaalinen eristyneisyys- ulottuvuuksissa. Taudin kesto oli selvästi yhteydessä huonompiin liikkuminen- ja kipu- ulottuvuuksiin (p <  0.01). ICF- luokitusta käytettäessä potilaiden näkökulmasta kipu, liikkuminen, tarmokkuus ja uni nousivat tärkeimmiksi kategorioiksi. Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että nivelreumalla on huomattava vaikutus potilaiden terveyteen liittyvään elämänlaatuun, jota varhainen ja aktiivinen hoito voi kuitenkin parantaa. ICF- viitekehyksessä NHP kattaa laajemman spektrin ICF- luokista kuin HAQ.

Abstract Rheumatoid arthritis and osteoarthritis are two chronic joint diseases, which cause two of the largest socioeconomical burdens among all joint diseases according to the World Health Organization. Both diseases are associated with changes in bone structure and bone cell, especially osteoclast, function. The etiology or pathogenesis of these diseases are not completely understood. Traditionally, osteoarthritis is seen as a disease resulting from mechanical wear of cartilage and bone, and rheumatoid arthritis as an autoinflammatory disease of synovial tissue. However, also in osteoarthritis chronic inflammation is present in synovial tissue, and in rheumatoid arthritis large changes in bone structure are seen. The field of study focusing on this connection between inflammation and bone is called osteoimmunology and it can explain many features of these chronic diseases linking joint health to disturbances in bone homeostasis. Here, the study focused on the function of osteoclasts in normal and pathological environments, and on the factors that have an effect on bone resorption, with a special emphasis on the protein osteopontin. Samples of synovial fluid and serum from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients were analyzed for factors affecting osteoclasts, and in vitro cell cultures of human derived osteoclasts were used to analyze osteoclast function in normal and pathological environment. The phosphorylation of osteopontin was found to be increased in rheumatoid arthritis, along with multiple other inflammatory factors that also affect osteoclasts, such as IL-6, IL-8 and VEGF. Osteoclast cell cultures showed how the use of different patient samples significantly affected osteoclastogenesis, due to so-called inflammatory osteoclastogenesis. Additionally, we show that osteoclasts deposit osteopontin into the resorption lacunae during bone resorption. Based on the results, the inflammatory component present in both osteoarthritis and rheumatoid arthritis significantly affects osteoclast function, and its further study in the future may reveal new therapeutic possibilities. Especially the new discoveries of osteopontin’s role in normal osteoclast function and its changes seen between osteoarthritis and rheumatoid arthritis may prove to have therapeutic potential. / Tiivistelmä Nivelreuma ja nivelrikko ovat kroonisia nivelsairauksia, jotka Maailman terveysjärjestön (WHO) mukaan aiheuttavat eniten sosioekonomista haittaa. Molemmissa sairauksissa luiden rakenteessa ja luusolujen, erityisesti osteoklastien, toiminnassa tapahtuu muutoksia. Kummankaan taudin etiologiaa tai patogeneesiä ei täysin tunneta. Perinteisesti ajatellaan, että nivelrikko johtuu rusto- ja luukudoksen mekaanisesta kulumisesta ja nivelreuma nivelkalvon autoinflammatoorisesta tulehduksesta. Kuitenkin nivelrikossa nähdään myös selkeä nivelkalvon krooninen tulehdus ja nivelreumassa suuria luun rakenteen muutoksia. Tutkimusala, joka tutkii tulehduksen ja luun yhteyttä, on nimeltään osteoimmunologia. Tässä väitöskirjassa tutkitaan osteoklastien toimintaa ja niihin vaikuttavia tekijöitä, erityisesti proteiini osteopontiinia, normaalissa ja tautiympäristössä. Analysoin osteoklasteihin vaikuttavia tekijöitä nivelrikko- ja nivelreumapotilaiden näytteistä sekä osteoklastien toimintaa soluviljelmissä. Soluviljelmissä käytettiin nivelreuma- ja nivelrikkopotilaiden näytteitä mahdollisimman totuudenmukaisen ympäristön luomiseksi osteoklasteille. Tutkimuksessa osoitettiin, kuinka osteopontiinin fosforylaatio on lisääntynyt nivelreumapotilaiden nivelnesteessä. Myös useiden muiden osteoklasteihin vaikuttavien tekijöiden, kuten IL-6:n, IL-8:n ja VEGF:n, havaittiin lisääntyneen nivelreumassa. Osteoklastien soluviljelmissä havaittiin selkeät erot siinä, miten eri potilasnäytteet vaikuttavat osteoklasteihin ja erityisesti tulehduksen aiheuttamaan osteoklastien syntyyn. Osoitan myös, miten osteoklastit erittävät osteopontiinia luunhajotuskuoppaan luun hajotuksen aikana. Tutkimustulosten mukaan krooninen tulehdustila nivelrikossa ja nivelreumassa vaikuttaa huomattavasti osteoklastien toimintaan. Uskon, että lisätutkimukset tällä saralla voivat paljastaa uusia hoidollisia mahdollisuuksia. Erityisesti uudet löydökset osteopontiinin roolista osteoklastien toiminnassa sekä muutoksista nivelrikossa ja nivelreumassa vaativat jatkotutkimuksia, jotta proteiinin kliininen merkittävyys saadaan selvitettyä.