Es ist schon lange bekannt, dass das Immunsystem eine wichtige Rolle in der Immunabwehr von malignen Tumoren spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Verhalten der unten genannten Zellen, Rezeptoren und löslichem Protein MICA im peripheren Blut von Patienten mit soliden und hämatologischen Tumorerkrankungen sowie einer Kontrollgruppe mittels Durchflußzytometrie und ELISA-Verfahren untersucht. NK-Zellen ( u.a. CD 56+CD16-NK-Zellen, CD 56-CD16+ Nk-Zellen, CD56+CD16+NK-Zellen), NKT-Zellen und verschiedene T-Lymphozyten ( u.a. αβ-Lymphozyten, δγ-Lymphozyten, Vγ9Vδ1-Lymphozyetn, Vγ9Vδ2-Lymphozyten) sind auf direkten oder indirekten Weg über aktivierende Rezeptoren ( u.a. NKG2D, NKp44, NKp46, NKp33), inhibierende Rezeptoren ( u.a. p 58.1, p58.2, p70, NKG2A) und Chemokinrezeptoren ( u.a. CXCR1) an der Lyse / Apoptose von Tumorzellen über HLA-abhängige (MICA) und HLA-unabhängig Moleküle beteiligt. Es ließ sich zeigen, dass MICA genauso im Serum von hämatologischen Patienten wie auch bei soliden Tumorerkrankungen vorkommt, wobei vor allem Patienten mit fortgeschrittenen Stadien und Metastasierung hohe Werte aufwiesen. Es wurde eine Verminderung der Gesamtzahl an Lymphozyten und αβ-T-Lymphozyten bei hämatologischen und bei soliden Tumoren im peripheren Blut festgestellt. Weiterhin zeigte sich, wie bereits in der Literatur berichtet, bei hämatologischen Neoplasien ein signifikant erhöhter Wert an NK-Zellen und CD56-16+NK-Zellen sowie eine verminderte Expression von NKG2D auf NK-Zellen, auf αβ-T-Lymphozyten und auf γδ-T-Lymphozyten. Es ließ sich auch eine verminderte Expression von p58.1 und NKG2A auf γδ-Lymphozyten im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe nachweisen. Ein signifikanter Unterschied im Vergleich zu soliden Tumoren fand sich nicht, bis auf den oben genannten Lymphozytenanteil. Der Nachweis, dass erhöhte lösliche Serum MICA-Werte die Parameter wie KIRs und KARs sowie Chemokinrezetoren oder die Apopotose der Immunzellen bei hämatologischen oder bei soliden Tumorerkrankungen beeinflusst, konnte in dieser Arbeit nicht geführt werden. Die vorliegende Arbeit trägt dazu bei, die Immunabwehr gegenüber soliden und hämatologischen Tumorerkrankungen besser zu verstehen. / Natural killer cells (NK), NKT cells, αβ-T cells and δγ-T cells play an important role in tumor defence. These cells eliminate tumor cells through killer inhibitory receptors (KIR) and stimulatory killer activating receptors (KAR), which can lyse target cells by binding to the major histocompatibility complex class I-related chain A (MICA) protein. The aim of this study is to analyze the reduction of these immune cells, the association between the levels of soluble MICA with KIR- and KAR-expressing on αβ cells, γδ cells and NK cells and their interaction with chemokine receptor CXCR1in the peripheral blood of patients with haematological and epithelial malignancies. ELISA and flow cytometric analysis were used in comparison to controls. Reduced numbers of αβ-T- cells and the presence of soluble MICA could be demonstrated in the serum of patients with both haematological and epithelial malignancies. Higher levels of soluble MICA were associated with advanced stages of disease and metastasation. Patient samples showed also lower numbers of NK cells and CD56-16+NK cells as well as a reduced expression of NKG2D on NK, αβ and γδ T cells. Confirming existing evidence, there was also a reduced expression of p58.1 and NKG2A on γδ cells in comparison to controls. No significant differences between solid and haematological malignancies were found, except for this type of lymphocytes. The study did not provide evidence that increased levels of soluble MICA influence KIRs and KARs, the chemokine receptors or the apoptosis of immune cells.

Introduction: NKT cells are categorised as borderline between NK and T cells, sharing phenotypic and functional characteristics of both cells, demonstrating their capacity to contritube to both pro- or anti-inflammatory processes. However, the role of these cells among lung transplant recipients remains largely unknown. The aim of this study was to determine the role of NKT cells following lung transplantation. Methods: NKT cells were quantified and characterised according to markers of: activation (CD107a, CD161, NKG2D) and immunomodulation (CD200 and CD200R) in peripheral blood and BALs. NKT cell numbers and phenotypes were correlated to clinical variables: immunosuppression, acute rejection, acute infections (viral, bacterial and fungal), bronchiolitis obliterans syndrome (BOS grade), lung function, and demographic variables. Interactions between NKT cells and the transplanted lung were linked by determining the relative expression of immunomodulatory ligand CD200 in lung biopsies. In vitro models were employed to determine the role of NKT cells to acute lung injury, either alone or in combination with cells of the mononuclear phagocyte system (MPS). Results: Higher numbers of immunomodulatory NKT cells (CD200+ and CD200R+) were found as lung function decreased. Data from peripheral blood indicates that recipients whose donors or themselves had been exposed to CMV infection demonstrated increased numbers of NKT cells. Patients with active EBV infections demonstrated higher NKT cell numbers expressing CD200 and CD200R. Data from BALs, indicates that patients with active fungal infections present higher immunomodulatory (CD200R) NKT cells and lower cytotoxicity marker (CD107a). In peripheral blood, lung recipients demonstrated higher NKT cell numbers compared to healthy volunteers. However, the lower relative mean expression of functional markers in the lung transplant group suggests that cells are less active. In vitro cultures with immunosuppressants demonstrated that cell cycle inhibitors (MMF and AZA) and corticosteroids (Prednisolone) are likely to inhibit NKT cell proliferation, while calcineurin inhibitors (Cyclosporine A and Tacrolimus) decrease the relative mean expression of activation markers. Clinical observations indicate that higher doses of Azathioprine may correlate with increased NKT cell numbers and the relative expression of CD200 and CD200R. However, under these conditions the relative expression of activation marker NKG2D decreases. In vitro data from the acute injury model indicates that NKT cells are capable to migrate into the injured lung and become activated following transmigration which is facilitated by the presence of monocytes. We also observed the interaction of NKT cells with endothelial cells, monocytes and macrophages. Also, the relative mean expression of CD200 and CD200R increased at the capillary layer, regardless of injury while upregulation of activation markers (CD107a, CD161 and NKG2D) was found at the capillary layer, following injury. In contrast, the alveolar layer demonstrated a decrease in both activation and immunomodulatory markers, following acute injury. Conclusions: Despite immunosuppression, NKT cells remain present in peripheral blood and BAL following lung transplantation. NKT cell proliferation is likely to be reduced by effect of cell cycle inhibitors, while calcineurin inhibitors exert an immunomodulatory effect. Our data indicates that NKT cells can participate in inflammatory and immunomodulatory events at the alveolar bilayer. Their capacity to infiltrate the lungs was assisted by cells of the mononuclear phagocyte system (MPS), which play an important role in antigen presentation and modulation of acute injury. Further research is needed to elucidate the signals and mechanisms occurring between NKT and MPS interactions and the outcomes these populations drive in acute lung injury.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18892号 / 医博第4003号 / 新制||医||1009(附属図書館) / 31843 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 竹内 理, 教授 鈴木 茂彦, 教授 長澤 丘司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第19147号 / 生博第330号 / 新制||生||44(附属図書館) / 32098 / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 稲葉 ｶﾖ, 教授 米原 伸, 教授 杉田 昌彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

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Natural killer T cells (NKT cells) are a subset of T cells. They regulate a wide range of diseases including infection, tumor growth, and autoimmune diseases, through recognizing glycolipid antigens in the context of CD1d. An understanding of the scope of glycolipid antigens would facilitate use of this cell type in controlling immune responses. Till today, a lysosomal glycolipid, isoglobotrihexosylceramide (iGb3), is the only natural glycolipid that has been found to be recognized by both human and mouse NKT cells. To elucidate the molecular basis of this specific recognition, iGb3 variants were designed and prepared: i) replacement of the C26 acyl chain with shortened acyl chains; ii) replacement of the distal galactose with glucose and mannose; iii) replacement of the intermediate galactose with glucose; iv) replacement of the proximal glucose with galactose. Among these glycolipids, the iGb3 variants with shortened acyl chains are potent stimulators of NKT cells. The iGb3 variant with intermediate glucose also showed the ability to stimulate NKT cells, but this finding needs to be verified. Our findings support the specific recognition of iGb3 by NKT cells. The search for other natural glycolipid antigens focuses on glycolipids that are isolated from bacteria and parasites. Recently, glycosphingolipids (GSL-1, -3, and -4) isolated from the sphingomonodaceae family of bacteria were characterized. GSL-1 has been shown to be a potent stimulator of NKT cells. Moreover, it has been reported that GSL-4 is a stimulator as well. To verify the structures and stimulatory properties of GSLs, GSL-1 to -4 were prepared and tested for their abilities to stimulate NKT cells. The result that only GSL-1 can stimulate NKT cells suggests that synthesis of these higher order GSLs would be an immune evasion mechanism. Neutral glycosphingolipids from sheep-derived F. hepatica liver flukes, a causative agent of fascioliasis, were isolated and characterized. Their structures are closely related to iGb3. Among these glycolipids, neo-iGb4s could be truncated to iGb3 in the lysosome and thus stimulate NKT cells. To test this hypothesis, these glycosphingolipids were prepared and tested. None of these synthetic glycolipids stimulates NKT cells, which suggests that the secretion of these glycolipids by F. hepatica could be the result of the parasite-immune-evasion mechanism.

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In den letzten Jahren ergaben sich vermehrt Hinweise, dass dendritische Zellen (DCs) zu einer Stimulation von Natürlichen „Killer“ (NK)-Zellen in der Lage sind, die als zytotoxische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems Tumorzellen eliminieren. Aus diesem Grund bestand ein wesentliches Ziel dieser Arbeit in der Analyse der Wechselwirkungen zwischen nativen DCs und NK-Zellen. Dazu wurden slanDCs verwendet, welche die größte DC-Subpopulation des Blutes repräsentieren. Zunächst wurde evaluiert, ob slanDCs eine effiziente Aktivierung von NK-Zellen bewirken. Als ein Ergebnis zeigte sich, dass Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierte slanDCs sowohl zu einer verstärkten Expression des Aktivierungsmarkers CD69 auf der Oberfläche von NK-Zellen als auch zur Induktion der NK-Zell-Proliferation führen. Darüber hinaus wurde erstmals die slanDC-abhängige Erhöhung der Expression von aktivierenden Rezeptoren (NKp46, NKp44, NKp30) und Korezeptoren (2B4, DNAM-1) auf NK-Zellen demonstriert, welche essentiell für die NK-Zell-vermittelte Erkennung und Lyse von Tumorzellen sind. In weiteren Untersuchungen induzierten LPS-aktivierte slanDCs eine erhebliche Produktion von Interferon (IFN)-gamma in NK-Zellen, welches proliferationshemmend auf Tumorzellen und aktivierend auf T-Lymphozyten wirkt. Funktionelle Analysen ergaben, dass aktivierte slanDCs das zytotoxische Potential von NK-Zellen gegenüber der Tumorzelllinie K-562 deutlich verstärken. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten die herausragende Bedeutung von IL-12, das sowohl die Steigerung der IFN-gamma-Sekretion als auch die Zunahme der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen induzierte. Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass LPS-aktivierte slanDCs eine Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber frisch etablierten Blasten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie induzieren. In weiteren Untersuchungen wurde evaluiert, ob NK-Zellen ihrerseits die immunstimulatorischen Eigenschaften von slanDCs beeinflussen. Die Analysen zeigten erstmals, dass unstimulierte NK-Zellen die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen, kostimulatorischen Molekülen und Adhäsionsmolekülen auf slanDCs deutlich erhöhen und somit ihre Fähigkeit zur Aktivierung von CD8+ T-Lymphozyten sowie CD4+ T-Helferzellen fördern. NK-Zellen führen ebenfalls zu einer deutlichen Verstärkung der Produktion von IL-12 durch LPS-stimulierte slanDCs. Darüber hinaus zeigte sich, dass NK-Zellen die Sekretion des immunsuppressiven Zytokins IL-10 durch LPS-stimulierte slanDCs reduzieren. In weiteren Analysen wurde demonstriert, dass die Interaktionen mit NK Zellen die Fähigkeit von LPS-aktivierten slanDCs zur Programmierung naiver CD4+ T-Lymphozyten in IFN-gamma-produzierende T-Helfer-1-Zellen deutlich verstärken. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass stimulierte slanDCs und NK-Zellen in der Lage sind, sich wechselseitig zu aktivieren. NKT-Zellen repräsentieren eine weitere bedeutende Effektorzellpopulation der frühen antitumoralen Immunabwehr, die durch Sekretion von Zytokinen und ein ausgeprägtes zytolytisches Potential zur Elimination von Tumorzellen beiträgt. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals die Wechselwirkungen zwischen slanDCs und NKT-Zellen analysiert. Dabei verstärkten LPS-stimulierte slanDCs die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 auf NKT-Zellen. Darüber hinaus induzierten LPS-aktivierte slanDCs eine deutliche IFN-gamma-Produktion in NKT-Zellen, wobei erneut die zentrale Rolle von IL-12 gezeigt wurde. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass stimulierte slanDCs zu einer effektiven Aktivierung von NKT Zellen in der Lage sind. In abschließenden Untersuchungen wurde die Wirkung von NKT-Zellen auf slanDCs evaluiert. Dabei verstärkten NKT-Zellen die Maturierung von slanDCs erheblich und führten zu einer signifikanten Steigerung der IL-12-Produktion sowie zu einer Reduktion der IL-10-Freisetzung in Abhängigkeit von IFN-gamma. Die gewonnenen Daten demonstrierten, dass NKT-Zellen und slanDCs zu einer gegenseitigen Aktivierung befähigt sind. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse zu den Interaktionen von slanDCs und NK- bzw. NKT-Zellen können einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Immunabwehr von Tumoren leisten und die Konzeption neuer antitumoraler Therapiestrategien unterstützen.

Les cellules NKT invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T non conventionnels restreints par la molécule CD1d qui présente des glycolipides. Les cellules iNKT expriment un TCR avec une chaîne a invariante, Va14-Ja18 chez la souris et Va28-Ja18 chez l’homme. Elles ont la particularité de produire de grande quantité de cytokines (IFN-? et IL-4) rapidement après leur activation et peuvent à leur tour stimuler d’autres cellules du système immunitaire comme les cellules dendritiques, les cellules NK et les lymphocytes T. Elles représentent ainsi un pont entre les réponses immunitaires innées et adaptatives. Le diabète de type 1 est une maladie autoimmune caractérisée par la destruction des cellules ß pancréatiques productrices d’insuline. Bien que l’apparition de diabète de type 1 soit associée à des polymorphismes génétiques, les facteurs environnementaux ont également été impliqués dans l’étiologie de cette maladie. De nombreuses études suggèrent que les infections virales, en particulier les infections par le virus de coxsackie B4 (CVB4), pourraient être impliquées dans le développement de cette maladie. Notre étude a été réalisée avec des souris NOD qui développent un diabète de type 1 vers 15 semaines d’âge et des souris NOD déficientes pour la proinsulin 2 (Pro-ins2-/-) développant un diabète vers 8 semaines d’âge. Nos résultats montrent qu’après infection par CVB4, la moitié des souris NOD et Pro-ins2-/- développent un diabète accéléré par rapport à des souris non infectées. Toutefois, une injection de l’agoniste des cellules iNKT, la molécule aGalactosylceramide (aGalCer), au moment de l’infection des souris, diminue fortement l’incidence de diabète. L’infection par CVB4 induit un fort recrutement de macrophages dans le pancréas et l’activation des cellules iNKT modifie la fonction de ces macrophages. En effet, les macrophages pancréatiques des souris infectées par CVB4 expriment fortement les cytokines IL-1ß, IL-6 et TNF-a, révélant leur caractère pro-inflammatoire alors que les macrophages des souris infectées et traitées par aGalCer expriment faiblement ces cytokines inflammatoires et fortement des enzymes immunosuppressives iNOS (inducible NO synthase), IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) et arginase I. L’utilisation d’inhibiteurs de ces enzymes montre que la protection contre le diabète est induite par IDO. Nous avons également observé une forte infiltration de lymphocytes T autoréactifs dans les îlots pancréatiques des souris infectées. De façon intéressante, l’incidence accrue de diabète du groupe CVB4 est associée à une fréquence élevée de cellules T autoréactives produisant de l’IFN-? dans le pancréas, alors que la production d’IFN-? par les cellules T autoréactives est très faible dans les souris du groupe CVB4+aGalCer. Cette inhibition de la production d’IFN-? est dépendante de l’enzyme IDO, car l’utilisation d’un inhibiteur d’IDO augmente fortement la production d’IFN-? par les lymphocytes T anti-îlots et l’incidence de diabète. Dans l’ensemble nos résultats montrent, que l’activation des cellules iNKT lors de l’infection par CVB4 induit des macrophages immunosuppresseurs dans le pancréas, ces cellules inhibant la fonction des lymphocytes T autoréactifs et ainsi le développement du diabète. / INKT cells are non-conventional T lymphocytes that are restricted to glycolipid presenting CD1d molecule. iNKT cells express an invariant TCR a chain (Va14-Ja18 in mice and Va28-Ja18 in humans). Their particularity is to rapidly produce copious amounts of cytokines (IFN-? and IL-4) after activation and to activate other cells of the immune system such as dendritic cells, NK cells and T lymphocytes. iNKT cells, therefore, form a bridge between innate and adaptive immune responses. Type 1 diabetes is an autoimmune disease characterized by the destruction of pancreatic ß cells whose role is to produce insulin. While diabetes development can clearly be associated with genetic polymorphisms, environmental factors were also implicated in the etiology of the disease. Numerous studies suggest that viral infections, particularly infections with Coxsackievirus B4 (CVB4), could be implicated in the development of type 1 diabetes. Our study was performed with NOD mice that develop type 1 diabetes around 15 weeks of age and with proinsulin 2 knockout NOD mice (Pro-ins2-/-) which become diabetic around 8 weeks of age. Our results show that CVB4 infection induces accelerated diabetes in around half of NOD and Pro-ins2-/- mice compared to uninfected mice. However, the activation of iNKT cells with their agonist, aGalactosylceramide (aGalCer), at the time of infection greatly decreases diabetes incidence. CVB4 infection induces a strong recruitment of macrophages into the pancreas. Interestingly, iNKT cell activation modifies the function of these macrophages. Indeed, pancreatic macrophages of CVB4 infected mice strongly express IL-1, IL-6 and TNF-a, indicating their pro-inflammatory character. On the contrary, macrophages of mice infected with CVB4 and treated with aGalCer express low levels of these cytokines, but strong levels of suppressive enzymes iNOS (inducible NO synthase), IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) and arginase I. The use of inhibitors of these enzymes showed that diabetes prevention is induced by IDO. We have also observed that autoreactive T cells strongly infiltrate the pancreatic islets after CVB4 infection. It is interesting to note that the high diabetes incidence of CVB4 infected mice is associated with an increased frequency of IFN-? producing autoreactive T cells in pancreatic islets. On the contrary, the frequency of these cells is very low in infected mice treated with aGalCer. The inhibition of IFN-? production is dependent on IDO enzyme, since the use of its inhibitor strongly increases IFN-? production by anti-islet T cells and diabetes incidence. To summarize, our results show that iNKT cell activation during the infection with CVB4 induces immunosuppressive macrophages in the pancreas. These cells inhibit the function of autoreactive T cells and prevent diabetes development.