No description available.

Οι μικροσωληνίσκοι της μιτωτικής ατράκτου είναι υπεύθυνοι για τον αποχωρισμό των αδελφών χρωματιδίων κατά την Ανάφαση. Τροποποίηση ή καταστολή της δυναμικής του δικτύου των μικροσωληνίσκων συνεπάγεται αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης μέσω ενεργοποίησης του σημείου ελέγχου της Μίτωσης. Έτσι, ενώσεις που προσδένονται στο μόριο της β-τουμπουλίνης και σταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους, όπως το paclitaxel και η griseofulvin, ή τους αποσταθεροποιούν, όπως η nocodazole, αποτελούν αποτελεσματικά φάρμακα έναντι του καρκίνου, αλλά και άλλων ασθενειών. Η πρόσδεση των φαρμάκων στους μικροσωληνίσκους έχει ως αποτέλεσμα, την αναστολή της αλληλεπίδρασης μικροσωληνίσκων-κινητοχώρου, βλάβες στη λειτουργία της μιτωτικής ατράκτου και ανώμαλο χρωμοσωματικό αποχωρισμό, με συνέπεια την εμφάνιση ανευπλοειδικών κυττάρων. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η συγκριτική διερεύνηση της ανευπλοειδογόνου δράσης των φαρμακευτικών ενώσεων nocodazole, paclitaxel και griseofulvin σε τρία κυτταρικά συστήματα in vitro: στους μυοβλάστες ποντικού C2C12, στους ινοβλάστες ανθρώπου HFFF2 και στα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπου MCF-7. Η συγκριτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη μελέτη επαγωγής μικροπυρήνων και του μηχανισμού προέλευσης τους, μέσω της διπλής ανοσοσήμανσης πρωτεϊνών του κινητοχώρου (CREST) και του δικτύου του κυτταροσκελετού (α- τουμπουλίνη). Ακολούθησε μελέτη της ακεραιότητας της μιτωτικής συσκευής, μέσω συνδυασμένης ανοσοσήμανσης πρωτεϊνών του κεντροσώματος (γ- τουμπουλίνη & Aurora A) και του δικτύου των μικροσωληνίσκων (β- τουμπουλίνη). Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο χρωμοσωματικό αποχωρισμό, όπως οι Aurora A, β- και γ-τουμπουλίνη, μέσω της μεθόδου της ανοσοαποτύπωσης (Western Blot Analysis). Με την ολοκλήρωση της μελέτης παρατηρείται ότι και οι τρεις χημικές ενώσεις: επάγουν το φαινόμενο της χρωμοσωματικής καθυστέρησης, κατάσταση που υποδηλώνει την ύπαρξη ολόκληρου χρωμοσώματος, με αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων με κινητοχώρο στο εσωτερικό τους και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Επίσης, προκαλούν αύξηση του ποσοστού πολυπύρηνων μεσοφασικών κυττάρων και στα τρία κυτταρικά συστήματα. Προκαλούν αύξηση του μιτωτικού δείκτη και συσσώρευση των κυττάρων στο στάδιο της Μετάφασης στα κύτταρα C2C12, HFFF2 και MCF-7. Η συσσώρευση αυτή συνοδεύεται με ταυτόχρονη μείωση των Ανατελοφάσεων. Αποδιοργανώνουν, ακόμα, το δίκτυο των μικροσωληνίσκων, τόσο στα μεσοφασικά όσο και στα μιτωτικά κύτταρα. Ειδικότερα, η nocodazole επάγει την αύξηση του ποσοστού μεσοφασικών κυττάρων με πολύ συμπυκνωμένο δίκτυο και κατεστραμμένο (στικτό) γενετικό υλικό στα κύτταρα ποντικού C2C12. Επίσης, και οι τρεις ενώσεις επηρεάζουν τον κεντροσωματικό πολλαπλασιασμό, με την εμφάνιση ανώμαλων Μεταφάσεων και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Η nocodazole επάγει το σχηματισμό μονοπολικών Μεταφάσεων, αντίθετα το paclitaxel σχηματίζει πολυπολικές Μεταφάσεις. Η griseofulvin παρουσιάζει κυτταρική εξειδίκευση με την πρόκληση μονοπολικών Μεταφάσεων στα κύτταρα C2C12, πολυπολικών Μεταφάσεων στα καρκινικά κύτταρα MCF-7 και κατά πλειονότητα μη-ομαδοποιημένων Μεταφάσεων στα κύτταρα HFFF2. Οι εν λόγω μελετηθείσες χημικές ενώσεις τροποποιούν επίσης την έκφραση των πρωτεϊνών Aurora A, β- & γ-τουμπουλίνης και στα τρία κυτταρικά συστήματα. Κύριο χαρακτηριστικό της δράσης της nocodazole είναι η μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών Aurora A και β-τουμπουλίνης. Αντίθετα το paclitaxel και η griseofulvin οδηγούν σε υπερέκφραση των Aurora A, β- και γ-τουμπουλίνη. Και οι τρεις φαρμακευτικές ενώσεις παρουσιάζουν κυτταρική εξειδίκευση ως προς τον επηρεασμό της έκφρασης των πρωτεϊνών που μελετήθηκαν. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν τη συμμετοχή των τριών πρωτεϊνών στην εκδήλωση της ανευπλοειδογόνου δράσης των τριών χημικών ενώσεων. Τα παραπάνω συμπεράσματα επιβεβαιώνουν και ερμηνεύουν την ανευπλοειδογόνο δράση των φαρμακευτικών ενώσεων, nocodazole, paclitaxel και griseofulvin. / The microtubules of the mitotic apparatus are responsible for the chromosome segregation during Anaphase. Modification or inhibition of the dynamics of the microtubules results to the activation of the mitotic checkpoint. Chemicals that bind at the molecule of β-tubulin and stabilize microtubules, like paclitaxel and griseofulvin or destabilize them, like nocodazole, act as drugs against cancer or other diseases. This binding results to the inhibition of microtubule-kinetochore interactions, damage of the organization of the mitotic spindle, abnormal chromosome segregation and thus the generation of aneuploid cells. In the present study we comparatively investigated the aneugenic potential of three chemical compounds, nocodazole, paclitaxel and griseofulvin in three cell lines in vitro: C2C12 mouse fibroblasts, HFFF2 human myoblasts and MCF-7 human epithelial cancer cells. The comparative analysis was established by three different experimental procedures. The study of micronucleus induction and their generation mechanism was accomplished by CREST analysis in combination with immunostaining of α- tubulin. The ability of the chemicals to affect the organization of mitotic apparatus was investigated by double immunofluorescence of microtubule network (β-tubulin) and centrosomes (γ-tubulin & Aurora A) in all cell lines. Finally, to understand further the mechanisms by which nocodazole, paclitaxel and griseofulvin exert their aneugenic potential, we examined the ability of these compounds to modulate the expression of proteins that participate in chromosome segregation, such as Aurora A, β- and γ-tubulin, by Western blot analysis in C2C12, HFFF2 and MCF-7 cells. Our results revealed that the three chemical compounds:  Induce chromosome delay, showing a high frequency of micronuclei with kinetochore, indicating the presence of intact chromosome in every studied cell line. In addition, all the drugs evoke induction of multinucleated cells in all cell lines.  Increase the mitotic index with simultaneous Metaphase arrest. The cell accumulation at the Metaphase is accompanied with reduction of Anatelophases in all cell lines.  Promote disorganization of the microtubule network. Especially, nocodazole causes induction of abnormal interphase cells with very condensed network (bundled cells) and punctuated genetic material in C2C12 mouse cell line.  Affect the centrosome proliferation, increasing the frequency of abnormal Metaphases in the three cell lines. Nocodazole induces high frequency of monopolar Metaphases, whereas paclitaxel generates polypolar Metaphases. Griseofulvin produces monopolar Metaphases in C2C12 cells, polypolar Metaphases in cancer MCF-7 cells and mainly non-congressed Metaphases in HFFF2 cells, exhibiting cell specificity.  Modify the expression of the proteins Aurora A, β- and γ-tubulin in all cell lines. Nocodazole reduces Aurora’s A expression in C2C12, HFFF2 and MCF-7 cell lines. The same is observed for β- tubulin’s expression, as for C2C12 and MCF-7 cells. Paclitaxel exerts its aneugenic potential by enhancing the expression of Aurora A and γ-tubulin in all cell lines, whereas enhancing β- tubulin’s expression is only noticed in C2C12 and MCF-7 cells. Griseofulvin increases the expression of Aurora A and β-tubulin in human cancer cells MCF-7. As for γ-tubulin’s expression, is elevated only in the human cell lines HFFF2 and MCF-7. Thus, we suggest that the activity of the pharmaceutical compounds on the expression of the above proteins, exhibit cell specificity. These findings implicate that the aneugenic potential of the studied drugs is mediated through changes in the expression of these proteins. The conclusions above confirm and explain the aneugenic potential of the pharmaceutical compounds, nocodazole, paclitaxel and griseofulvin.

In two separate experiments, weight adjusted doses of nocodazole and acrylamide were injected intraperitoneally at various time intervals into twelve week old female mice. Within the nocodazole experiment, the doses were injected at varying time intervals before and after mating. On day seventeen of gestation, the female mice were sacrificed and their uterine contents examined. Nocodazole induced a significant increase in reproductive pathology per total implants when administered one hour after mating to the (SECxC57BL)F, stock: 5.00% total deads, 70.23% moles, and 3.41% abnormal fetuses. Acrylamide treatment produced a significant reduction in live births when administered six hours after mating: 50.86% moles and 46.46% living fetuses per total implants.

Cytoskeletal filaments provide cells with mechanical stability and organization. The main key players are actin filaments and microtubules governing a cell’s response to mechanical stimuli. We investigated the specific influences of these crucial components by deforming MCF-7 epithelial cells at small(„5% deformation) and large strains(>5% deformation). To understand specific contributions of actin filaments and microtubules, we systematically studied cellular responses after treatment with cytoskeleton influencing drugs. Quantification with the microfluidic optical stretcher allowed capturing the relative deformation and relaxation of cells under different conditions. We separated distinctive deformational and relaxational contributions to cell mechanics for actin and microtubule networks for two orders of magnitude of drug dosages. Disrupting actin filaments via latrunculin A, for instance, revealed a strain-independent softening. Stabilizing these filaments by treatment with jasplakinolide yielded cell softening for small strains but showed no significant change at large strains. In contrast, cells treated with nocodazole to disrupt microtubules displayed a softening at large strains but remained unchanged at small strains. Stabilizing microtubules within the cells via paclitaxel revealed no significant changes for deformations at small strains, but concentration-dependent impact at large strains. This suggests that for suspended cells, the actin cortex is probed at small strains, while at larger strains; the whole cell is probed with a significant contribution from the microtubules

Les agents permettant de créer des dommages sur l'ADN sont principalement utilisés dans les traitements contre le cancer. L'activation de points de contrôle du cycle cellulaire après lésion de l'ADN entraîne un arrêt du cycle des cellules. De la connaissance des mécanismes moléculaires de l'arrêt du cycle cellulaire par ces points de contrôle dépend l'efficacité du traitement. Dans les cellules humaines, ces points de contrôle sont primordiaux puisque leur inactivation entraîne la carcinogenèse (génération de cancers). Après traitement par des agents chimiothérapiques et des rayons X, les cellules s'arrêtent en phase G-1 et G-2/Mitose (M) du cycle cellulaire. Si de nombreuses études ont permis de clarifier les mécanismes de l'arrêt en phase G-1 pour des cellules dont l'ADN est endommagé, peu de données sont disponibles concernant l'arrêt en phase G-2/M. Parmi ces points de contrôle, le point de contrôle G-2/M est particulièrement important car il prévient l'entrée en mitose (phase M) des cellules dont l'ADN est endommagé. <br /> Nous avons analysé le rôle du complex appelé APC (Anaphase-Promoting Complex) dans les points de contrôle G-2/M après lésion de l'ADN. Les lésions de l'ADN sont induites dans les cellules synchronisées en phase S. Suite à ces dommages, les cellules montrent un retard et s'arrêtent en phase G-2 avec 4N chromosomes. Afin d'identifier les bases biochimiques de l'arrêt en G-2/M après traitement avec des agents endommageant l'ADN, nous allons concentrer notre recherche sur un complexe composé de multiples protéines possédant une activité de ligation de l'ubiquitine de type E3 (ubiquitin-ligase E3). Ce complexe APC est necessaire pour la dégradation des inhibiteurs d'entrée en anaphase, cyclins mitotiques, et plusieurs kinases mitotiques pour la complétion de la sortie de la mitose. Nous avons analysé et déterminé que l'absence d'activité du complexe APC inhibe l'activation du point de contrôle G-2/M lors de dommages de l'ADN.

Les eucaryotes se divisent selon une série d'étapes régulées finement appelée le cycle cellulaire. Ce cycle cellulaire permet la réplication exacte du génome et sa distribution entre deux cellules filles identiques. Le cycle cellulaire est contrôlé par de nombreux mécanismes qui garantissent l'intégrité du génome. La mitose est la période du cycle cellulaire pendant laquelle le contenu en ADN des cellules est réparti entre les deux cellules filles. Le bon déroulement de la mitose chez les eucaryotes supérieurs est soumis à un point de contrôle dit point de contrôle du fuseau mitotique. L'activité du point de contrôle permet de retarder l'anaphase jusqu'à ce que toutes les conditions requises pour la ségrégation des chromosomes soient présentes. Malgré cela, les cellules peuvent présenter des anomalies de la ségrégation des chromosomes et devenir aneuploïdes. Ceci est fréquemment le cas dans les cellules cancéreuses.<br />Dans cette étude, nous avons mis en évidence l'existence d'une réponse cellulaire survenant dans la phase G1 qui suit une mitose anormale. Nous avons étudié des cellules primaires de mammifères traitées avec de faibles concentrations d'inhibiteurs des microtubules, la vinblastine et le nocodazole. Les cellules ainsi traitées présentent des défauts de ségrégation pendant la mitose et deviennent aneuploïdes. Les cellules résultant de ces mitoses anormales s'arrêtent dans la phase G1 qui suit la division et deviennent sénescentes. Nous avons trouvé que les cellules de mammifères transformées par l'antigène grand T de SV40 n'observent pas d'arrêt après une mitose anormale.

<p> The urgency for deeper knowledge about nervous system function and dysfunction has never been greater. With increasing rates of mental disorders and expanding healthcare costs, deciphering details of axonal development is essential to meeting this imperative. Models of neuronal growth are improving as roles of microtubules and motor proteins surface. However, traditional motor protein studies focus on intracellular cargo transport, leaving deficits in knowledge about how these proteins organize cytoskeletal filaments in the axon and growth cone during neuronal development. Inconsistent findings on microtubule activity in growing axons also leave gaps in quantitative assessments of microtubule translocation and assembly, limiting the ability to construct a comprehensive model of axonal elongation.</p> The goal of this study was to provide a more complete neuronal growth cone model by determining how individual microtubule translocation and assembly, mass microtubule movements, and motor protein activity contribute to axonal elongation. The underlying mechanisms of these processes were investigated by testing the roles of dynein and microtubule dynamics in axonal elongation of <i>Aplysia </i><i>californica </i>neurons using transillumination, fluorescent speckle, and super-resolution microscopy. Pharmacologically inhibiting either dynein activity or microtubule assembly reduced both bulk and individual microtubule anterograde translocation and neurite elongation rates. Suppressing both processes simultaneously had compensatory rather than additive effects. Super-resolution imaging also revealed fewer dynein motors co-localized with microtubules when microtubule assembly was inhibited. These results strongly suggest that disrupting microtubule assembly blocks neurite outgrowth partly because it inhibits dynein-mediated bulk microtubule translocation.