Les ultraviolets A (UVA) sont carcinogènes et produisent des espèces réactives de l'oxygène (ERO). Le récepteur à la mélanocortine de type 1 (MC1R) est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) qui est impliqué dans la mélanogénèse et dans l'inflammation cutanée. Certains variants du gène sont associés à un risque accru de mélanomes et de carcinomes cutanés. Le MC1R est exprimé surtout dans les mélanocytes mais son expression peut être induite par les UV in vitro dans les kératinocytes et in vivo dans la peau. Le récepteur MC1R est activé par l'α-MSH. L'objectif de ce travail de thèse a été d'étudier les effets du récepteur MC1R sur le stress oxydatif induit par les UVA dans des lignées kératinocytaires humaines HaCaT exprimant le récepteur MC1R ou son variant non fonctionnel Arg151Cys. Nous avons montré que la production d'ERO intracellulaire induite par les UVA est fortement inhibée dans les cellules HaCaT-MC1R et que cette inhibition est renforcée en présence d'α-MSH. L'inhibition du stress oxydatif induit par les UVA dans les cellules transfectées par le MC1R est en partie dépendante de la phosphorylation de la sous-unité activatrice, NoxA1 de la NADPH oxydase. Le traitement des cellules HaCaT-MC1R par un inhibiteur du récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR) restaure l'habilité de ces cellules à induire un stress oxydatif après irradiation UVA. Ces résultats montrent que l'activité constitutive du récepteur MC1R dans des kératinocytes pourrait inhiber le stress oxydatif induit par les UVA via des mécanismes dépendants de l'AMPc et de l'EGFR. / Ultraviolet A (UVA) radiations are responsible for deleterious effects, mainly due to reactive oxygen species (ROS) production. Alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) binds to Melanocortin-1 Receptor (MC1R) in melanocytes to stimulate pigmentation and modulate cutaneous inflammatory responses. MC1R may be induced in keratinocytes after UV exposure. To investigate the effect of MC1R signaling on UVA-induced ROS (UVA-ROS) production, we generated HaCaT cells that stably express human MC1R (HaCaT-MC1R) or the Arg151Cys (R151C) non- functional variant (HaCaT-R151C). We then assessed ROS production immediately after UVA exposure and found that: (1) UVA-ROS production was strongly reduced in HaCaT-MC1R but not in HaCaT-R151C cells compared to parental HaCaT cells; (2) this inhibitory effect was further amplified by α-MSH treatment of HaCaT-MC1R cells before UVA exposure; (3) after UVA irradiation, NoxA1 phosphorylation was increased i n HaCaT-MC1R compared to HaCaT and HaCaT-R151C cells. Inhibition of PKA in HaCaT-MC1R cells resulted in a marked increase of UVA-ROS production; (4) the ability of HaCaT-MC1R cells to produce UVA-ROS was restored by inhibiting epidermal growth factor receptor (EGFR) or extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity before UVA exposure. Our findings suggest that constitutive activity of MC1R in keratinocytes may reduce UVA-induced oxidative stress via EGFR and cAMP-dependent mechanisms.

L’objectif de notre étude était de montrer le rôle du métabolisme oxydatif et énergétique au cours du vieillissement cutané et dans les cancers cutanés UVB-induits. Dans une première partie, nous avons cherché à établir un lien entre l'instabilité génétique, la production de ROS et l’altération métabolique dans le processus de vieillissement. Les résultats obtenus sur le modèle de souris XPC KO ont démontré qu’un excès de stress oxydatif dû à une sur activation du NOX1, couplé à des altérations métaboliques, jouaient un rôle prépondérant dans le vieillissement prématuré. L’application topique de notre nouvel inhibiteur de NOX, induisant l’inhibition de la production de ROS et ainsi l’apparition d’altération métabolique, a permis d’empêcher le vieillissement cutané prématuré chez les souris XPC KO. Nos résultats suggèrent que l’InhNOX peut être considéré comme une cible prometteuse dans la prévention du vieillissement prématuré et les maladies liées à NOX. Très peu d'informations sont disponibles sur la contribution de la reprogrammation du métabolisme énergétique dans l'initiation et la progression du cancer. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé un modèle multi-étapes de cancer de la peau UVB-induits, nous permettant ainsi d’évaluer le rôle de la reprogrammation métabolique dans les différentes étapes de la cancérogenèse. Nous avons ensuite démontré que l'irradiation chronique à UVB entraînait une diminution de l’activité de la glycolyse, du cycle TCA et de la β-oxydation des acides gras, tandis que la synthèse d'ATP mitochondriale et une partie de la chaîne de transport d'électrons (CTE) étaient up-régulés. Nous avons montré que l’augmentation accrue de CTE été liée à la sur-activation des dihyroorotate déshydrogénase (DHODH). Alors que la diminution de l'activité DHODH ou ETC (chimiquement ou génétiquement) a conduit à une hypersensibilité à l'irradiation UVB. Nos résultats indiquent que la voie DHODH par l’induction de la synthèse d'ATP et de CTE joue un rôle majeur entre l'efficacité de réparation d'ADN et la reprogrammation métabolique au cours de la carcinogenèse UVB-induits. / Objective of the present research study was investigating the role of oxidative and energy metabolism in skin aging and UVB-induced skin cancer. In the first part, we aimed to find the link between genetic instability, ROS generation and metabolism alteration in the process of aging. The obtained results on XPC KO mice model demonstrated that excess of oxidative stress in addition to alterations in energy metabolism due to over activation of NOX1 play a causative role in premature skin aging. Topical application of novel NOX inhibitor prevented the premature aging in XPC KO mice through inhibition of ROS generation and alteration of energy metabolism. Our results suggest that the InhNOX can be considered as a promising target in prevention of premature aging and NOX-associated diseases. Little information is available on the contribution of energy metabolism reprogramming in cancer initiation and promotion. To assess the role of metabolic reprogramming in different phases of carcinogenesis, in the second part of my thesis we employed a multistage model of ultraviolet B (UVB) radiation-induced skin cancer. We showed that chronic UVB irradiation results in decreased glycolysis, TCA cycle and fatty acid β-oxidation while at the same time mitochondrial ATP synthesis and a part of the electron transport chain (ETC) are upregulated. Increased ETC was further found to be related to the over-activation of dihyroorotate dehydrogenase (DHODH). Decreased activity of DHODH or ETC (chemically or genetically) led to hypersensitivity to UVB irradiation. Our results indicated that DHODH pathway through induction of ETC and ATP synthesis represents the relation between DNA repair efficiency and metabolism reprogramming during UVB-induced carcinogenesis.

Les NADPH oxydases constituent une famille d’enzymes dont la fonction est dédiée à la production de formes réactives de l’oxygène. NOX1, un des membres de cette famille, est abondamment exprimée dans le colon et sa dérégulation pourrait être associée aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Les mécanismes qui modulent l’activation de NOX1 demeurent mal connus. Au cours de ma thèse je me suis donc intéressée à l’étude de la phosphorylation de NOXA1 et NOXO1, deux sous-unités régulatrices du complexe NOX1 et ai démontré 1) que la phosphorylation de NOXA1 constitue un mécanisme de régulation négative de l’activité de NOX1 en vue de maintenir l’activité constitutive du complexe à un niveau adéquat et non excessif. 2) pour la première fois, que NOXO1β est phosphorylée et que cette phosphorylation entraîne une hyperactivation de NOX1. L’ensemble de ces données montre que NOX1 est finement régulée. Par ce biais, NOX1 pourrait être impliquée dans la défense anti-infectieuse de l’intestin. / The NOX family of NADPH oxidases are enzymes which function is dedicated to the production of reactive oxygen species. NOX1, a member of this family is expressed abundantly in the intestine and its disregulation could be linked to inflammatory diseases such as inflammatory bowel diseases. However, the molecular basis of NOX1 regulation remains unclear. During my thesis, I demonstrated that 1) NOXA1, the activator cytosolic subunit of the NOX1 complex, is phosphorylated and its phosphorylation prevents hyperactivation of NOX1 in order to maintain a constitutive activity which would not be too excessive. 2) phosphorylation of human NOXO1, the organizer subunit of the complex is a prerequisite of full activation of NOX1. Taken together, these results demonstrate that NOX1 is tightly regulated by phosphorylation events. By this mean, NOX1 could be involved in host immune defense of the intestine.

Les ultraviolets A (UVA) sont carcinogènes et produisent des espèces réactives de l'oxygène (ERO). Le récepteur à la mélanocortine de type 1 (MC1R) est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) qui est impliqué dans la mélanogénèse et dans l'inflammation cutanée. Certains variants du gène sont associés à un risque accru de mélanomes et de carcinomes cutanés. Le MC1R est exprimé surtout dans les mélanocytes mais son expression peut être induite par les UV in vitro dans les kératinocytes et in vivo dans la peau. Le récepteur MC1R est activé par l'α-MSH. L'objectif de ce travail de thèse a été d'étudier les effets du récepteur MC1R sur le stress oxydatif induit par les UVA dans des lignées kératinocytaires humaines HaCaT exprimant le récepteur MC1R ou son variant non fonctionnel Arg151Cys. Nous avons montré que la production d'ERO intracellulaire induite par les UVA est fortement inhibée dans les cellules HaCaT-MC1R et que cette inhibition est renforcée en présence d'α-MSH. L'inhibition du stress oxydatif induit par les UVA dans les cellules transfectées par le MC1R est en partie dépendante de la phosphorylation de la sous-unité activatrice, NoxA1 de la NADPH oxydase. Le traitement des cellules HaCaT-MC1R par un inhibiteur du récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR) restaure l'habilité de ces cellules à induire un stress oxydatif après irradiation UVA. Ces résultats montrent que l'activité constitutive du récepteur MC1R dans des kératinocytes pourrait inhiber le stress oxydatif induit par les UVA via des mécanismes dépendants de l'AMPc et de l'EGFR.

Reactive oxygen species (ROS) have a role in cardiovascular health and disease. This study was undertaken to determine if ROS formation is influenced by either common genetic variations in p22phox, a subunit of the ROS generating enzyme NOX1, or by natural plant compounds with cardiovascular benefits. Hydrogen peroxide production was measured using Amplex Red, and superoxide generation was measured using NBT and MCLA. Each of seven p22phox variants supported ROS generation by NOX1. No differences were found in the rate of ROS production; however, unequal transfer of the p22phox gene may be a confounding factor. A variation in the 3’UTR of the p22phox gene led to lower p22phox protein levels, whereas none of the other variations affected mRNA or protein expression. The natural compound resveratrol acts as an antioxidant towards hydrogen peroxide, but not superoxide. Resveratrol does not inhibit NOX1 activity.

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Les NOX Homologues représentent une nouvelle famille de protéines transmembranaires dont la caractéristique commune est d'être le cœur catalytique de la production d'anions superoxydes. Elles ont toutes une structure proche de NOX2 (ou gp91Phox selon l'ancienne nomenclature), la mieux caractérisée d'entre elles, et sont organisées en 6 ou 7 domaines transmembranaires. Cette famille compte actuellement 7 membres, NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5 et DUOX 1 et DUOX2 ; elles ont une distribution tissulaire, cellulaire et intracellulaire spécifique les rendant quasi ubiquitaires dans l'organisme. Les fonctions de ces enzymes sont essentiellement rattachées à celles des espèces réactives de l'oxygène (ERO) mais dépendent aussi de leurs localisations. NOX2 est l'enzyme à l'origine de la production des ERO des phagocytes activés et a donc une fonction antimicrobienne. NOX3 est impliquée dans les pathologies du système vestibulaire et les DUOX1 et 2 sont des éléments clés de la biosynthèse des hormones thyroïdiennes. Les autres NOX, (NOX1, NOX4, NOX5), individualisées depuis quelques années seulement, ont une distribution tissulaire et cellulaire d'expression ARNm bien caractérisée, mais les données sur leurs fonctions physiologiques ou physiopathologiques restent fragmentaires ; Ces données sont le plus souvent issues d'expérimentations in vitro ou ex vivo n'évaluant leurs fonctions que de façon indirecte ou dans des systèmes simplifiés. Ainsi, en utilisant un modèle animal de souris déficientes pour le gène NOX1 établi dans le laboratoire, nous avons évalué directement la fonction de NOX1 dans le colon et dans le système vasculaire. <br />La première partie de ce travail a eu pour objectif de déterminer si NOX1 exerce une activité antibactérienne au niveau du colon et participe au contrôle de la translocation bactérienne à travers la muqueuse colique. NOX1 participe à la sévérité de la colite au Dextran Sulfate Sodium par l'intermédiaire de la flore colique et protège de la translocation bactérienne dans un modèle de neutropénie induite. Cependant, ces résultats devront être confirmés car les expérimentations ont toutes été réalisées avec des souris dont le fond génétique n'avait une homologie que de 87.5%. La seconde partie de notre travail devait déterminer si NOX1 exerce une activité régulatrice de la pression artérielle systolique et participe à la survenue de l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II. Nous montrons, avec des souris de génération F6 (homologie>98.5%), que NOX1 participe à la régulation physiologique de la pression artérielle, à la survenue de l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II et à la survenue de dissection aortique. NOX1 agit dans le tissu vasculaire par au moins 3 mécanismes, en favorisant l'accumulation de matrice extracellulaire, en régulant l'expression génique et en diminuant la biodisponibilité du NO.

Les NADPH oxydases constituent une famille d'enzymes dont la fonction est dédiée à la production de formes réactives de l'oxygène. NOX1, un des membres de cette famille, est abondamment exprimée dans le colon et sa dérégulation pourrait être associée aux maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Les mécanismes qui modulent l'activation de NOX1 demeurent mal connus. Au cours de ma thèse je me suis donc intéressée à l'étude de la phosphorylation de NOXA1 et NOXO1, deux sous-unités régulatrices du complexe NOX1 et ai démontré 1) que la phosphorylation de NOXA1 constitue un mécanisme de régulation négative de l'activité de NOX1 en vue de maintenir l'activité constitutive du complexe à un niveau adéquat et non excessif. 2) pour la première fois, que NOXO1β est phosphorylée et que cette phosphorylation entraîne une hyperactivation de NOX1. L'ensemble de ces données montre que NOX1 est finement régulée. Par ce biais, NOX1 pourrait être impliquée dans la défense anti-infectieuse de l'intestin.