Les télomères sont des structures nucléo-protéiques présentes à l'extrémité des chromosomes. Ils sont un des facteurs garant de la stabilité génomique. Ils assurent la protection des extrémités des chromosomes et leur entière réplication. Les dysfonctionnements du télomère sont impliqués dans la tumorigénèse et le vieillissement.Un des rôles majeurs des télomères est d'éviter que les extrémités des chromosomes ne soient reconnues comme des cassures double brin de l'ADN et traitées comme telles par la machinerie de réparation. Cependant, de nombreuses protéines impliquées dans la reconnaissance et le métabolisme des cassures double brin, comme la protéine Tel1 et le complexe MRX par exemple, sont présentes au niveau des télomères et participent au maintien de leur taille par la télomérase. En s'appuyant sur cette analogie, j'ai étudié le rôle télomérique de l'endonucléase Sae2 et de l'hélicase Sgs1, impliquées dans l'étape de dégradation du brin 5' qui précède la réparation des cassures double brin de l'ADN par recombinaison.Les rôles des protéines Sae2 et Sgs1 ont été étudiés sur les télomères natifs et sur les télomères érodés lors de la sénescence réplicative. L'ensemble de mes résultats suggèrent que, bien que les télomères érodés en absence de télomérase soient reconnus comme une cassure double brin de l'ADN et traités comme tels par les nucléases et hélicases, le rôle majeur de Sae2 et Sgs1 au niveau des télomères natifs serait de les protéger contre des recombinaisons illégitimes au cours de leur réplication. / Telomeres are nucleoprotein complexes that protect the extremities of linear chromosomes, avoiding end-to-end fusions and nucleolytic degradation of chromosome ends. The failure of cells to properly maintain telomeres can be an important source of chromosome instability involved in cancer progression and aging.A major role of telomeres is to prevent chromosome ends from being recognized as damage-induced double-strand DNA breaks (DSBs). However, many proteins involved in recognition and processing of DSBs are also involved in telomeres maintenance, like Tel1 and MRX. Based on this analogy, I have studied the role at telomeres of the role of the endonuclease Sae2 and the helicase Sgs1, two proteins that have a key function in the processing of DSBs through nucleolytic degradation of their 5' end.The role of protein Sae2 and Sgs1 has been studied at native and eroded telomeres. My results showed that eroded telomeres, in telomerase deficient cells, are recognized and resected as a double-strand break DNA by a set of nucleases and helicases including Sae2 and sgs1. In contrast, the main role of Sae2 and Sgs1 at native telomeres would be to protect telomeres against illegitimate recombination during replication.

Les translocations chromosomiques sont des événements cellulaires rares signatures de nombreux cancers, pouvant mener à l’expression de nouveaux gènes de fusion oncogènes ou à la dérégulation d’un oncogène existant. Cependant, le lien direct entre la formation de translocations et la tumorigenèse n’est pas toujours bien établi. Jusqu’à présent, la modélisation de translocations se limitait principalement à la surexpression du gène de fusion créé. Pour mieux comprendre leur contribution à l’oncogenèse, nous avons développé une nouvelle méthode pour induire des translocations oncogéniques de novo, afin de recréer plus fidèlement les premières étapes de la transformation cellulaire.Pour cela, nous nous appuyons sur la technologie des nucléases artificielles telles que les nucléases à doigt de zinc, les TALEN (TALE Nucleases) et le système CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) pour générer des cassures ciblées de l’ADN et induire la formation de remaniements chromosomiques. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur l’induction de la translocation modèle t(2;5)(p23;q32) et du gène de fusion NPM-ALK, associés au Lymphome Anaplasique à Grandes Cellules (ALCL), dans divers modèles cellulaires. Nous avons ainsi mis en évidence des propriétés oncogéniques du gène de fusion NPM-ALK exprimé sous son promoteur endogène suite à la formation du réarrangement chromosomique. Cependant, l’induction de la translocation dans des lymphocytes T primaires suggère que cet événement ne suffit pas à lui seul à initier l’oncogenèse, et nécessite probablement un contexte génétique ou épigénétique favorable. / Chromosomal translocations are signatures of numerous cancers and lead to expression of fusion genes that act as oncogenes. However, the wealth of genomic aberrations found in cancer makes it challenging to assign a specific phenotypic change to a specific aberration. We set out to use genome editing with Zinc Finger Nucleases (ZFN), Tale Effector Nucleases (TALEN), and the CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) to induce de novo specific chromosomal translocations in human cells, thus generating new models to interrogate the contribution of tumor-related translocations in first steps of oncogenesis. We specially focused on Anaplastic Large Cell Lymphoma (ALCL) t(2;5) translocation and NPM-ALK consequent fusion gene. For the first time, we highlighted oncogenic properties for NPM-ALK fusion expressed under endogenous promoter. However, translocation induction in primary T cells suggests that t(2;5) is not sufficient to initiate ALCL oncogenesis, and likely requires favourable genetic or epigenetic or context.

La Cytolethal Distending Toxin (CDT) est un facteur de virulence produit par de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatives. Sa production est associée à différentes pathologies, dont le développement de cancers. Un lien de causalité a été établi entre dommages à l’ADN, mutagénèse et cancérogenèse. Or, différentes études ont classé CDT dans la famille des génotoxines bactériennes. L’action génotoxique de CDT repose sur l’activité de sa sous-unité catalytique CdtB, connue pour induire des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN génomique eucaryote. Cependant, des travaux de l’équipe ont montré qu’à des doses 1000 fois plus faibles que celles utilisées dans la littérature, CDT induit des dommages primaires (probablement de type cassure simple-brin), qui dégénèrent en CDB lors de la phase S. Afin de mieux documenter ce modèle, nous avons étudié ici les systèmes de réparation impliqués dans la réponse aux dommages à l’ADN induits par CDT. Nous avons ainsi confirmé l’importance des voies de réparations des CDBs (Homologous Recombinaison et Non-Homologous End-Joining). Nous avons également montré que le Nucleotide Excision Repair, impliqué dans la réparation des adduits à l’ADN, n’est pas impliqué dans la prise en charge des dommages induits par CDT. En revanche, nous avons démontré, pour la première fois, l’implication de systèmes de réparation de dommages plus précoces, comme le Single-Strand Break Repair et la voie de l’Anémie de Fanconi. Pour finir, afin de mieux caractériser ces dommages et leur induction, nous avons initié des travaux visant à étudier, in vitro, l’activité catalytique de CdtB. Dans ce but, différents mutants catalytiques ont été générés, purifiés, et leur activité nucléase a été testée. Une activité nucléase similaire entre les CdtB sauvages et mutantes a été obtenue lors d’un test in vitro (digestion d’un plasmide super-enroulé). Cependant, un test cellulaire (expression nucléaire en cellules eucaryotes de la sous-unité CdtB sauvage ou mutante) indique bien la perte de l’activité nucléase de la sous-unité mutante. Nos résultats montrent donc l’importance de tester les différentes sous-unités dans différents contextes. En conclusion, notre travail conforte les données selon lesquelles CDT induit des CSB, et non des CDB directes de l’ADN. De plus, notre travail a permis d’éclaircir les processus cellulaires activés dans la cellule hôte, suite aux dommages à l’ADN induits par CDT. / The Cytolethal Distending Toxin (CDT) is a virulence factor produced by many pathogenic gram-negative bacteria, its production being associated to various diseases, including tumorigenesis. A causal relationship has been established between DNA damage, mutagenesis and cancerogenesis. Different studies classified CDT among the bacterial genotoxins. The CDT-related pathogenicity relies on the catalytic subunit CdtB action, shown to induce double-strand breaks (DSB) on the host genomic DNA. Previously, our team showed that, at doses 1000 times lower than those used in the literature, CDT probably induces single-strand breaks that degenerate into DSB during S-phase. To document this model, we studied the repair systems involved in host-cell in response to CDT-induced DNA damage. Since various repair pathways allow cells to respond different type of DNA damage, we speculated that non-DSB repair mechanisms might contribute to the cellular resistance to CDT-mediated genotoxicity. First, we confirm that HR is involved in the management of CDT-induced lesions, but also Non Homologous End Joining, the second major DSB repair mechanism. Next we show that nucleotide excision repair, involved in adducts repair, is not important to take care of CDT-induced DNA damage, whereas base excision repair impairment sensitizes CDT-treated cells, suggesting that CDT induce single-strand breaks. Moreover, we demonstrate for the first time the involvement and the activation of the Fanconi Anemia repair pathway in response to CDT. Finally, to better characterize CDT-induced damage, we initiate experiments to study CdtB nuclease activity in vitro. For this, different CdtB mutants have been generated, purified and their nuclease activity tested. A similar nuclease activity has been obtained for the wt or mutant CdtB in an in vitro assay (digestion of a supercoiled plasmid). However, a cell assay (nuclear expression of CdtB in eukaryotic cells) confirms the loss of activity for the mutant subunit. Our results thus indicate the importance to test the CdtB subunit in different context. To conclude, our work reinforces a model where CDT induces single-strand damage and not direct DSB. This also underlines the importance of cell proliferation to generate DSB and sheds light on the activated host-cell systems, after CDT-induced DNA damage.