Magíster en farmacología / El carcinoma escamoso de laringe es una enfermedad altamente invalidante ya que puede afectar la capacidad del habla, respiración y deglución del paciente que lo sufre. Los principales factores causales identificados son cigarro y alcohol. Las vías de respuesta inflamatoria, proliferativa y de reparación de ADN pueden contribuir al riesgo de cáncer de laringe. El objetivo de este estudio es determinar asociaciones entre variantes genéticas COX-2 rs20417, COX-2 rs689466, EGF rs4444903, EGFR rs2227983, P53 rs1042522 y el riesgo de cáncer de laringe en la población chilena. Se realizó un estudio casos y controles, con 100 pacientes con cáncer escamoso de laringe y 139 voluntarios adultos sin cáncer. La genotipificación se realizó mediante PCR-RLFP. Se observa que estos polimorfismos son capaces de incrementar el riesgo de cáncer de laringe asociado a la combinación de consumo de tabaco y alcohol en una razón de 0,34 veces para COX-2 rs20417, 0,5 veces para EGF rs4444903, 0,56 veces para P53 rs1042522, 1,72 veces para EGFR rs2227983 y 4,7 veces para COX-2 rs689466. Esto sugiere que las variantes COX-2 rs20417, COX-2 rs689466, EGF rs4444903, EGFR rs2227983 y P53 rs1042522 actúan como modificadores de riesgo de cáncer de laringe. / Laryngeal squamous cell carcinoma is a kind of cancer that can be highly disabling to the patient, affecting speech, swallowing and respiratory skills, and leading to impaired quality of life. Smoking and alcohol abuse are principal risk factors linked to this disease. Inflammation signaling pathways, mitogens and DNA repair genes are factors that can be involved in carcinogenesis. The aim of this research is to assess the effect of COX-2 rs20417, COX-2 rs689466, EGF rs4444903, EGFR rs2227983, P53 rs1042522 single nucleotide polymorphisms in the risk of laryngeal cancer development in Chilean population. For this case control study, we recruited 100 cancer patients and 139 healthy volunteers. SNP genotype was analyzed from genomic DNA by PCR-RFLP. We observed that these SNPs are capable of increase the smoking plus alcohol risk of laryngeal cancer in a ratio of 0,34 fold for COX-2 rs20417 SNP, 0,5 fold for EGF rs4444903 SNP, 0,56 fold for P53 rs1042522 SNP, 1,72 fold for EGFR rs2227983 SNP and 4,7 fold for COX-2 rs689466 SNP. These findings suggest that COX-2 rs20417, COX-2 rs689466, EGF rs4444903, EGFR rs2227983 and P53 rs1042522 single nucleotide polymorphisms acts as risk modifier factors for laryngeal cancer.

El cáncer de cuello uterino es el séptimo cáncer más frecuente en la población general y el segundo más común entre las mujeres de todo el mundo. Numerosos estudios epidemiológicos y moleculares han establecido al Virus del Papiloma Humano (VPH) como el principal factor etiológico del cáncer cervical. Sin embargo, dada la alta prevalencia de la infección por VPH en la población general respecto de la incidencia del carcinoma cervical, se presume que la sola infección por este virus sería insuficiente para provocar la transformación neoplásica. Las diferencias genéticas del hospedador que influyan en la respuesta contra la infección viral podrían determinar un mayor riesgo de desarrollo de lesiones cervicales y progresión hacia un carcinoma invasor. De esta manera, los polimorfismos genéticos presentes en genes relacionados a la infección viral, a la respuesta inmune, a los sistemas de reparación del ADN y aquellos genes supresores de tumores, podrían influenciar y determinar un riesgo aumentado de desarrollo de la neoplasia cervical. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto del componente genético en relación a la susceptibilidad de desarrollo de cáncer cervical y la infección por el Virus del Papiloma Humano. Se analizaron un total de 512 muestras cervicales de mujeres de la ciudad de La Plata, las cuales fueron clasificadas histológicamente en: 200 muestras de mucosa cervical normal (PapI/II), 100 Lesiones Intraepiteliales de Bajo Grado (LGSIL), 72 Lesiones Intraepiteliales de Alto Grado (HGSIL) y 140 muestras correspondientes a Carcinomas Cervicales Escamosos (SCC). La presencia de ADN del VPH fue examinada mediante PCR anidada y la genotipificación del virus por PCR-SSCP y PCR-EIA. La genotipificación de los Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs) presentes en los genes FASL (-844 T/C), IL10 (-1082 G/A), p53 (Arg72Pro), INFG (+ 874 T/A) y RNASEL (Arg462Gln) se llevó a cabo mediante la tecnología de Pirosecuenciación, mientras que el análisis de los SNPs Arg399Gln y Arg194Trp de XRCC1, -308 (G/A) y -238 (G/A) de TNF-α y -670 del gen FAS se realizó utilizando la técnica de PCR-RFLP. La prevalencia de la infección por VPH en el grupo control fue del 36,5%. El tipo viral más prevalente fue el VPH-16 (51,2%). Del total de los controles, el 29,3% correspondió a mujeres mayores a 30 años infectadas con VPH-16 y/o VPH-18. Los polimorfismos presentes en las regiones promotoras de los genes TNF-α (-308 (G/A) y -238 (G/A)), IL-10 (-1082 (G/A)) y FASL (-844 (T/C)), así como el SNP + 874 (T/A) del gen Interferon gamma, no presentaron diferencias entre casos y controles. De manera similar, no hubo asociación entre dichos polimorfismos y la presencia del ADN del VPH. Sin embargo, se registró un incremento significativo en el riesgo de desarrollo de cáncer cervical otorgado por los genotipos homocigota AA del gen FAS (OR=2,25; p=0,035), heterocigota CG del gen p53 (OR=2,43; p=0,004) y el genotipo TT+TC del gen XRCC1 codon 194 (OR=2,26; p=0,02). Por otra parte, los genotipos homocigota AA de RNASEL (OR=0,31; p=0,034) y heterocigota AG de XRCC1 codon 399 (OR=0, 48; p=0,023) otorgaron una menor susceptibilidad frente al desarrollo de la neoplasia cervical. En el caso del gen FAS, el genotipo homocigota AA (OR=2,53; p=0,035) se encontró asociado con un incremento en la susceptibilidad a la infección por VPH. En cuanto a las lesiones cervicales, se observó que tanto el alelo Gln (A) (OR=3,03; p=0,001) como el genotipo homocigota Gln/Gln (AA) (OR=5,34; p=0,000) de XRCCI Arg399Gln otorgaron un incremento significativo en el riesgo de desarrollo de lesiones de bajo grado (LSIL). Por el contrario, el genotipo heterocigota Gln/Arg (AG) de este mismo polimorfismo estuvo asociado con una disminución en el riesgo de desarrollo de este tipo de lesiones (OR=0, 25; p=0,009). Por último, el análisis de los polimorfismos a través del algoritmo MDR reveló que existe una interacción sinérgica entre ellos, presentando el modelo de cuatro-factores (cuatro-loci), conformado por FASL-P53-RNASEL-XRCC1399, una asociación significativa con la neoplasia cervical (TA=0,61; p<0,05). De acuerdo a los resultados obtenidos se observa que la asociación encontrada entre los Polimorfismos de Nucleótido Simple y el carcinoma cervical apoya el rol de la susceptibilidad genética del hospedador en la etiología de esta enfermedad. En base a esto se sugiere que la utilización de estos polimorfismos podría resultar muy conveniente en la identificación de aquellos individuos que se encuentran con mayor riesgo de desarrollo de lesiones cervicales y progresión hacia un carcinoma invasor.

GRado de magíster en ciencias biológicas, mención biología celular y molecular. / A nivel mundial, el cáncer de mama (CM), es el más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en mujeres (14%), representando el 23% del total de casos nuevos de cáncer. En Chile, es la primera causa de muerte por cáncer en mujeres, y la mortalidad por CM, ha ido en aumento en las últimas dos décadas. Debido a lo anterior, es pertinente realizar estudios que permitan conocer mejor sus bases etiológicas, para poder tomar medidas que permitan su prevención y su detección temprana. En la literatura existen variadas publicaciones en relación a genes codificantes que aumentan la susceptibilidad a desarrollar CM. Este, es el caso de los genes BRCA1/2, ATM, PALB2 entre otros, sin embargo en los últimos años se ha puesto mayor atención a la influencia que pudiesen tener secuencias no codificantes sobre el riesgo de desarrollar CM. Especialmente, existe gran interés en los miRNAs, y polimorfismos presentes en ellos, que pudieran ser la causa de aumento de riesgo para CM. Se ha demostrado que la presencia de SNPs en las secuencias de precursores o miRNAs maduros, afecta la maduración y el procesamiento de estos RNAs pequeños, así como también el silenciamiento de sus mRNAs blancos, proponiéndose este mecanismo como el responsable del desarrollo de diversas patologías entre ellas el CM. En este trabajo se analizaron las frecuencias alélicas y genotípicas de tres SNPs (rs2910164, rs3764444 y rs11614913) presentes en los miRNAs 146a y miRNA-499 y miRNA-196 respectivamente, y su asociación con el aumento de susceptibilidad a desarrollar CM en mujeres chilenas. Los resultados muestran que los SNPs presentes tanto en el miRNA-499 como en el miRNA-196, disminuyen el riesgo a desarrollar CM y actuarían como potenciales factores protectores para la patología. Por el contrario, el SNP presente en el miRNA-146a se asoció con aumento de riesgo para desarrollar CM en mujeres con CM esporádico, sin historia familiar para la patología, mientras que en pacientes con historia familiar mostró ser un factor protector. Estos resultados muestran la complejidad biológica que estaría detrás de cada tipo de CM, y los efectos tan distintos que los miRNAs podrían tener en diferentes contextos celulares. Para estudiar la funcionalidad biológica que pudiese tener el SNP presente en el pre- miRNA- 146a, se clonó este fragmento desde pacientes portadores para el alelo de riesgo y de sujetos controles, para posteriormente estudiar su efecto in vitro mediante la transfección en células de mama humana. Aunque no analizado, se espera que un cambio en la secuencia de un precursor de miRNA, afecte de tal manera su estructura secundaria que aumente o disminuya su disponibilidad para la maquinaria de procesamiento, resultando en cambios en los niveles de expresión de los miRNAs maduros. Estos cambios tendrían un impacto directo sobre la tasa de silenciamiento de los mRNAs blancos, que al estar más o menos silenciados promoverían un desequilibrio que aportaría con la transformación celular. / Worldwide, breast cancer (CM) is the most common and the leading cause of cancer death in women (14%), representing 23% of all new cancer cases. In Chile, it is the leading cause of cancer death in women, and mortality from CM, has been increasing in the last two decades. Because of this, it is appropriate to conduct studies to better understand their etiological bases, to take measures to prevention and early detection. In the literature there are various publications regarding coding genes that increase susceptibility to CM. This is the case of BRCA1 / 2, ATM, PALB2 among other genes, however in recent years there has been more attention to the influence that may have non-coding sequences on the risk of developing CM, specifically there is great interest in miRNAs, and polymorphisms present in them, which could be the cause of increased risk for CM. It has been shown that the presence of SNPs in the sequences of precursors or mature miRNAs affects maturation and processing of these small RNAs, as well as the silencing of their targets mRNAs, proposing this mechanism as responsible for the development of various diseases among CM them. In this work the allele and genotype frequencies of three SNPs (rs2910164, rs3764444 and rs11614913) present in the miRNAs 146a and miRNA-499 and miRNA-196 respectively, and its association with increased susceptibility to CM in Chilean women were analyzed. The results demonstrate that the SNPs present in both the miRNA-499 and miRNA-196, decrease the risk of developing CM and act as potential protective factors for the disease. By contrast, the SNP present in the miRNA-146a was associated with increased risk for women with CM CM sporadic, without family history of the disease, while in patients with family history was shown to be a protective factor. These results show the biological complexity that would be behind each type of CM, and the very different effects that miRNAs may have in different cellular contexts. To study the biological functionality that might be present in the pre miRNA- SNP 146a, this fragment was cloned from patients for the risk allele and control subjects, transforming later to study its effect in vitro by transfection into cells human breast.Despite not studied, it is expected that a change in the sequence of a miRNA precursor, so affecting its secondary structure to increase or decrease their availability for processing machinery, resulting in changes in the expression levels mature miRNAs. These changes may have a direct impact on the rate of silencing targets mRNAs, which being more or less silenced would promote an imbalance that would contribute to tumor cell transformation.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PAULA APARECIDA BORGES PERES.pdf: 1092863 bytes, checksum: 6b1ba024090a288ed778814bb2668c7f (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / Despite its obscure aetiopathology, fibromyalgia is defined by diffuse musculoskeletal pain and not joint, and heightened sensitivity to palpation of certain muscle points, mainly affecting women, in a ratio of 6 to 10 women for every man. Several studies have demonstrated the role of polymorphisms of genes serotonergic, dopaminergic and catecholaminergic in the etiology of fibromyalgia. Thus, genetic factors may be determinants in the pathogenesis of fibromyalgia and some environmental factors may trigger fibromyalgia in genetically predisposed individuals. In this context, it seems that the gene polymorphism T102C serotonin receptor (5-HT2A) is relevant in susceptibility to fibromyalgia. The objective of this study was to perform a metaanalysis in order to investigate the association between polymorphism of the serotonin receptor gene (5-HT2A), the T102C SNP in susceptibility to fibromyalgia. Five studies, between the years 1999 to 2011, about 5-HT2AT102C polymorphism in fibromyalgia were selected and used for making a meta-analysis. The epidemiological profile of fibromyalgia patients revealed a mean age of 46.7 (+ 5.9) years, with extremes ranging from 21 to 77 years. The proportion between genders showed a difference of approximately 7 women for every man diagnosed fibromyalgia. The average time in which patients suffering from fibromyalgia syndrome is 7.4 (+ 2.9) years. Allele frequencies for T and C, the gene for 5- HT2AT102C were, respectively, for patients: 337 (43.1%) and 445 (56.9%) and for the controls: 362 (51.6%) and 340 (48.4%), indicating a predominance of the C allele in patients with fibromyalgia (p=0.0013). When evaluating the genotypic frequencies, we found: 73 (18.7%) TT, 191 (48.8%) and TC 127 (32.5%) CC. The control group: 98 (27.9%) TT, 166 (47.3%) and TC 87 (24.8%) CC. The CC genotype appears more frequently in the patients fibromyalgia patients (p=0.0046). A meta-analysis generated a universe of simultaneous evaluation of 742 individuals (391 fibromyalgia patients and 351 controls). The applied tests indicated no significant differences between the case and control groups. Thus, the result of the meta-analysis suggests no correlation between polymorphism in question and susceptibility to fibromyalgia. We suggest the use of a broad panel of SNPs with the intention of increasing the chances of finding an association between genetic polymorphisms and susceptibility to fibromyalgia. / Apesar de sua etiopatologia obscura, a fibromialgia é definida por dores musculoesqueléticas difusas e não articulares e sensibilidade a palpação exacerbada em determinados pontos musculares, afetando principalmente mulheres, numa proporção de 6 a 10 mulheres para cada homem. Vários estudos têm demonstrado o papel relevante dos polimorfismos de genes serotoninérgicos, dopaminérgicos e catecolaminérgicos na etiologia da fibromialgia. Desta forma, fatores genéticos podem ser determinantes na patogênese da fibromialgia e alguns fatores ambientais podem desencadear a fibromialgia em indivíduos geneticamente predispostos. Neste contexto, parece que o polimorfismo T102C do gene do receptor da serotonina (5-HT2A) pode ser relevante na suscetibilidade à fibromialgia. Assim, o objetivo do presente trabalho foi o de realizar uma meta-análise com o intuito de investigar a associação entre o polimorfismo do gene do receptor da serotonina (5- HT2A), no SNP T102C, na suscetibilidade à fibromialgia. Cinco estudos, entre os anos de 1999 a 2011, sobre o polimorfismo 5-HT2AT102C em fibromialgia foram selecionados e utilizados para a confecção de uma meta-análise. O perfil epidemiológico dos pacientes fibromiálgicos revelou uma idade média de 46,7 (+ 5,9) anos, com os extremos variando de 21 a 77 anos. Adiconalmente, a proporção entre gêneros apontou uma diferença de aproximadamente 7 mulheres com fibromialgia para cada homem diagnosticado. O tempo médio em que os pacientes sofrem da síndrome fibromiálgica é de 7,4 (+ 2,9) anos. As frequências alélicas para T e C, para o gene 5-HT2AT102C, foram, respectivamente, para os pacientes: 337 (43,1%) e 445 (56,9%) e para os controles: 362 (51,6%) e 340 (48,4%), indicando um predomínio do alelo C em pacientes com fibromialgia (p=0,0013). Ao avaliar as frequências genotípicas, encontrou-se: 73 (18,7%) TT, 191 (48,8%) TC e 127 (32,5%) CC. No grupo controle foram: 98 (27,9%) TT, 166 (47,3%) TC e 87 (24,8%) CC. O genótipo CC aparece em maior frequência no grupo dos pacientes fibromiálgico (p=0,0046). A meta-análise gerou um universo de avaliação simultânea de 742 indivíduos (391 pacientes com fibromialgia e 351 controles). Os testes aplicados não indicaram diferenças significativas entre os grupos caso e controle. Assim, o resultado da meta-análise sugere ausência de correlação entre o polimorfismo em questão e a suscetibilidade à fibromialgia. Sugerimos a utilização de um amplo painel de SNPs com a intenção de aumentar as chances de se encontrar associação entre polimorfismos gênicos e suscetibilidade à fibromialgia.

Introducción: analizamos la relación entre fracturas y densidad mineral ósea (DMO) y los SNP (polimorfismos de un solo nucleótido) rs3102735 (163 A/G), rs3134070 (245 T/G) y rs2073618 (1181 G/C) de OPG, el SNP rs2277438 SNP de RANKL, el SNP rs7121 (393 T/C) de GNAS1 y del SNP rs219780 del gen CLDN14 en pacientes con HPP (hiperparatiroidismo primario) esporádico. Métodos: reclutamos 298 pacientes con HPP y 328 voluntarios sanos en un estudio transversal. Analizamos historia de fracturas o litiasis renal, parámetros bioquímicos, DMO en columna lumbar, cadera total, cuello femoral y radio distal y genotipado de los SNP mencionados. Resultados: no encontramos diferencias entre los genotipos de ninguno de los SNP estudiados en relación con la frecuencia de fracturas en HPP o en sujetos control. La DMO fue menor en el radio en los HPP homocigotos para el alelo menor en comparación con el resto de grupos en los SNP de OPG (163 A/G) y (245 T/G) pero no en sujetos control. En el resto de los SNP estudiados no encontramos diferencias entre genotipos y DMO en los sujetos con HPP o control excepto en el SNP de OPG (1181 G/C) en sujetos control con mayor DMO lumbar en el grupo CC respecto del GG. Conclusiones: los sujetos con HPP y homocigotos para el alelo menor (GG) en los SNP rs3102735 (163 A/G) y rs3134070 (245 T/G) de OPG tienen menor DMO en el radio distal. El resto de SNP estudiados no parecen influir en la diferente expresión de las manifestaciones óseas del HPP. / Background: we analyze the relationship between fractures and BMD (bone mineral density) and the rs3102735 (163 A/G), rs3134070 (245 T/G) and rs2073618 (1181 G/C) SNPs of the OPG, the rs2277438 SNP of the RANKL, the rs7121 SNP (393 T/C) of GNAS1 and the rs219780 of CLDN14 in patients with sporadic PHPT (primary hyperparathyroidism). Methods: We enrolled 298 Caucasian patients with PHPT and 328 healthy volunteers in a cross-sectional study. We analyzed history of fractures or renal lithiasis, biochemical determinants, BMD measurements in the lumbar spine, total hip, femoral neck and distal radius, and genotyping for the SNPs to be studied. Results: Regarding the frequency of fractures we found no differences between genotypes in any of the SNPs studied in the PHPT or in the control subjects groups. Significant lower BMD in the distal radius was found in the minor allele homozygotes (GG) compared to heterozygotes and major allele homozygotes in both OPG rs3102735 (163 A/G) and OPG rs3134070 (245 T/G) SNPs in those with PHPT but not in control subjects. We found no difference between genotypes of the rest of the SNPs studied in PHPT or control subjects with the exception of SNP OPG rs2073618 (1181 G/C) in control CC subjects which showed higher lumbar BMD than GG ones. Conclusions: Subjects with PHPT and minor homocygote genotype (GG) for the OPG rs3102735 (163 A/G) and OPG rs3134070 (245 T/G) SNPs have lower BMD in the distal radius. All the other SNPs studied do not appear to influence the different expression of HPP in bone.

Tesis por compendio / [ES] La medicina actual se dirige hacia un enfoque más personalizado basándose en el diagnóstico molecular del paciente a través del estudio de biomarcadores específicos. Aplicando este principio molecular, el diagnóstico, pronóstico y selección de la terapia se apoyan en la identificación de variaciones específicas del genoma humano, como variaciones de un único nucleótido (SNV). Para detectar estos biomarcadores se dispone de una amplia oferta de tecnologías. Sin embargo, muchos de los métodos en uso presentan limitaciones como un elevado coste, complejidad, tiempos de análisis largos o requieren de personal y equipamiento especializado, lo que imposibilita su incorporación masiva en la mayoría de los sistemas sanitarios. Por tanto, existe la necesidad de investigar y desarrollar soluciones analíticas que aporten información sobre las variantes genéticas y que se puedan implementar en diferentes escenarios del ámbito de la salud con prestaciones competitivas y económicamente viables. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar estrategias innovadoras para resolver el reto de la detección múltiple de variantes genéticas que se encuentran en forma minoritaria en muestras biológicas de pacientes, cubriendo las demandas asociadas al entorno clínico. Las tareas de investigación se centraron en la combinación de reacciones de discriminación alélica con amplificación selectiva de DNA y el desarrollo de sistemas ópticos de detección versátiles. Con el fin de atender el amplio abanico de necesidades, en el primer capítulo, se presentan resultados que mejoran las prestaciones analíticas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la incorporación de una etapa al termociclado y de un agente bloqueante amplificando selectivamente las variantes minoritarias que fueron monitorizadas mediante fluorescencia a tiempo real. En el segundo capítulo, se logró la discriminación alélica combinando la ligación de oligonucleótidos con la amplificación de la recombinasa polimerasa (RPA), que al operar a temperatura constante permitió una detección tipo point-of-care (POC). La identificación de SNV se llevó a cabo mediante hibridación en formato micromatriz, utilizando la tecnología Blu-Ray como plataforma de ensayo y detección. En el tercer capítulo, se integró la RPA con la reacción de hibridación alelo especifica en cadena (AS-HCR), en formato array para genotipar SNV a partir de DNA genómico en un chip. La lectura de los resultados se realizó mediante un smartphone. En el último capítulo, se presenta la síntesis de un nuevo reactivo bioluminiscente que se aplicó a la monitorización de biomarcadores de DNA a tiempo real y final de la RPA basada en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), eliminando la necesidad de una fuente de excitación. Todas las estrategias permitieron un reconocimiento especifico de la variante de interés, incluso en muestras que contenían tan solo 20 copias de DNA genómico diana. Se consiguieron resultados sensibles (límite de detección 0.5% variante/total), reproducibles (desviación estándar relativa < 19%), de manera sencilla (3 etapas o menos), rápida (tiempos cortos de 30-200 min) y permitiendo el análisis simultaneo de varios genes. Como prueba de concepto, estas estrategias se aplicaron a la detección e identificación en muestras clínicas de biomarcadores asociados a cáncer colorrectal y enfermedades cardiológicas. Los resultados se validaron por comparación con los métodos de referencia NGS y PCR, comprobándose que se mejoraban los requerimientos técnicos y la relación coste-eficacia. En conclusión, las investigaciones llevadas a cabo posibilitaron desarrollar herramientas de genotipado con propiedades analíticas competitivas y versátiles, aplicables a diferentes escenarios sanitarios, desde hospitales a entornos con pocos recursos. Estos resultados son prometedores al dar respuesta a la demanda de tecnologías alternativas para el diagnóstico molecular personalizado. / [CA] La medicina actual es dirigeix cap a un enfocament més personalitzat basant-se en el diagnòstic molecular del pacient a través de l'estudi de biomarcadors específics. Aplicant aquest principi molecular, el diagnòstic, pronòstic i selecció de la teràpia es recolzen en la identificació de variacions específiques del genoma humà, com variacions d'un únic nucleòtid (SNV). Per a detectar aquests biomarcadors, es disposa d'una àmplia oferta de tecnologies. No obstant això, molts dels mètodes en ús presenten limitacions com un elevat cost, complexitat, temps d'anàlisis llargues o requereixen de personal i equipament especialitzat, la qual cosa impossibilita la seua incorporació massiva en la majoria dels sistemes sanitaris. Per tant, existeix la necessitat d'investigar i desenvolupar solucions analítiques que aporten informació sobre les variants genètiques i que es puguen implementar en diferents escenaris de l'àmbit de la salut amb prestacions competitives i econòmicament viables. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha sigut desenvolupar estratègies innovadores per a resoldre el repte de la detecció múltiple de variants genètiques que es troben en forma minoritària en mostres biològiques de pacients, cobrint les demandes associades a l'entorn clínic. Les tasques d'investigació es van centrar en la combinació de reaccions de discriminació al·lèlica amb amplificació selectiva de DNA i al desenvolupament de sistemes òptics de detecció versàtils. Amb la finalitat d'atendre l'ampli ventall de necessitats, en el primer capítol, es presenten resultats que milloren les prestacions analítiques de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) mitjançant la incorporació d'una etapa al termociclat i d'un agent bloquejant amplificant selectivament les variants minoritàries que van ser monitoritzades mitjançant fluorescència a temps real. En el segon capítol, es va aconseguir la discriminació al·lèlica combinant el lligament d'oligonucleòtids amb l'amplificació de la recombinasa polimerasa (RPA), que en operar a temperatura constant va permetre una detecció tipus point-of-care (POC). La identificació de SNV es va dur a terme mitjançant hibridació en format micromatriu, utilitzant la tecnologia Blu-Ray com a plataforma d'assaig i detecció. En el tercer capítol, es va integrar la RPA amb la reacció d'hibridació al·lel específica en cadena (AS-HCR), en format matriu per a genotipar SNV a partir de DNA genòmic en un xip. La lectura dels resultats es va realitzar mitjançant un telèfon intel·ligent. En l'últim capítol, es presenta la síntesi d'un nou reactiu bioluminescent que es va aplicar al monitoratge de biomarcadors de DNA a temps real i final de la RPA basada en la transferència d'energia de ressonància de bioluminescència (BRET), eliminant la necessitat d'una font d'excitació. Totes les estratègies van permetre un reconeixement específic de la variant d'interès, fins i tot en mostres que només contenien 20 còpies de DNA genòmic diana. Es van aconseguir resultats sensibles (límit de detecció 0.5% variant/total), reproduïbles (desviació estàndard relativa < 19%), de manera senzilla (3 etapes o menys), ràpida (temps curts de 30-200 min) i permetent l'anàlisi simultània de diversos gens. Com a prova de concepte, aquestes estratègies es van aplicar a la detecció i identificació en mostres clíniques de biomarcadors associats a càncer colorectal i a malalties cardiològiques. Els resultats es van validar per comparació amb els mètodes de referència NGS i PCR, comprovant-se que es milloraven els requeriments tècnics i la relació cost-eficàcia. En conclusió, les investigacions dutes a terme van possibilitar desenvolupar eines de genotipat amb propietats analítiques competitives i versàtils, aplicables a diferents escenaris sanitaris, des d'hospitals a entorns amb pocs recursos. Aquests resultats són prometedors en donar resposta a la demanda de tecnologies alternatives per al diagnòstic molecular personalitzat. / [EN] Current medicine is moving towards a more personalized approach based on the patients' molecular diagnosis through the study of specific biomarkers. Diagnosis, prognosis and therapy selection, applying this molecular principle, rely on identifying specific variations in the human genome, such as single nucleotide variations (SNV). A wide range of technologies is available to detect these biomarkers. However, many of the employed methods have limitations such as high cost, complexity, long analysis times, or requiring specialized personnel and equipment, making their massive incorporation in most healthcare systems impossible. Therefore, there is a need to research and develop analytical solutions that provide information on genetic variants that can be implemented in different health scenarios with competitive and economically feasible performances. The main objective of this thesis has been to develop innovative strategies to solve the challenge of multiple detection of genetic variants that are found in a minority amount in patient samples, covering the demands associated with the clinical setting. Research tasks focused on the combination of allelic discrimination reactions with selective DNA amplification and the development of versatile optical detection systems. In order to meet the wide range of needs, in the first chapter, the analytical performances of the polymerase chain reaction (PCR) were improved by incorporating a thermocycling step and a blocking agent to amplify selectively minority variants that were monitored by real-time fluorescence. In the second chapter, allelic discrimination was achieved by combining oligonucleotide ligation with recombinase polymerase amplification (RPA), which operates at a constant temperature, allowing point-of-care (POC) detection. SNV identification was carried out by hybridization in microarray format, using Blu-Ray technology as the assay platform and detector. RPA was integrated with allele-specific hybridization chain reaction (AS-HCR), in an array format to genotype SNV from genomic DNA on a chip in the third chapter. The reading of the results was performed using a smartphone. In the last chapter, a new bioluminescent reagent was synthesized. It was applied to real-time and endpoint DNA biomarker monitoring based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), eliminating the need for an excitation source. All the strategies allowed specific recognition of the target variant, even in samples containing as few as 20 copies of target genomic DNA. Sensitive (limit of detection 0.5% variant/total), reproducible (relative standard deviation < 19%), simple (3 steps or less), fast (short times of 30-200 min) results were achieved, allowing simultaneous analysis of several genes. As proof of concept, these strategies were applied to detect and identify biomarkers associated with colorectal cancer and cardiological diseases in clinical samples. The results were validated by comparison with reference methods such as NGS and PCR, proving that the technical requirements and cost-effectiveness were improved. In conclusion, the developed research made it possible to develop genotyping tools with competitive analytical properties and versatile, applicable to different healthcare scenarios, from hospitals to limited-resource environments. These results are promising since they respond to the demand for alternative technologies for personalized molecular diagnostics. / The authors acknowledge the financial support received from the Generalitat Valenciana PROMETEO/2020/094, GRISOLIA/2014/024 PhD Grant and GVA-FPI-2017 PhD grant, the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness MINECO projects CTQ2016-75749-R and PID2019-110713RB-I00 and European Regional Development Fund (ERDF). / Lázaro Zaragozá, A. (2022). Study of Strategies for Genetic Variant Discrimination and Detection by Optosensing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185216 / TESIS / Compendio

Tesis por compendio / [ES] La domesticación de los cítricos es un proceso en gran parte desconocido. Las investigaciones llevadas a cabo hasta la fecha indican que las variedades de cítricos que se comercializan en la actualidad son, en general, el producto de introgresiones ancestrales intraespecíficas e interespecíficas. Las introgresiones de tipo intraespecífico tuvieron lugar entre las poblaciones de dos subespecies antiguas de mandarinas y aportaron el comportamiento apomíctico que la mayoría de las mandarinas actuales y otros cítricos relacionados conservan todavía hoy. Una vez dichas mezclas genéticas o admixtures quedaron establecidas, otras introgresiones interespecíficas de pummelo establecieron nuevas características en el genoma de mandarina. Durante el proceso de domesticación, la variabilidad genética de estos cítricos se adquirió fundamentalmente a través de mutación espontánea, y mediante la práctica del injerto los genotipos carentes de semillas se extendieron rápidamente, acentuándose el papel de las mutaciones en la selección de cítricos como las naranjas y las mandarinas modernas. En este trabajo, mostramos que las mutaciones somáticas en cítricos se propagan siguiendo un patrón iterativo determinado por un modelo de ramificación simpodial y, en consecuencia, se agrupan en sectores a lo largo del árbol, donde algunas mutaciones quedan permanentemente fijadas. En este escenario, un árbol puede considerarse un mosaico genéticamente compuesto de diferentes genomas, en el que las ramas más jóvenes acumulan un número mayor de mutaciones. En promedio, nuestro árbol experimental de Clementina de 36 años muestra una tasa de mutación de 4.4 × 10-10 bp-1 yr-1, pudiendo contener en total entre 1500 y 5000 variantes y producir 1 mutación somática en cada meristemo axilar. Este número relativamente alto de mutaciones está en línea con el gran número de variedades derivadas de mutaciones espontáneas que se comercializan en cítricos. Para identificar caracteres esenciales adquiridos durante la domesticación, se han analizado los transcriptomas de la pulpa de frutos en desarrollo de la variedad silvestre e incomestible papeda de Ichang, la mandarina ácida Sun Chu Sha Kat y tres segregantes comestibles derivados de un cruce entre mandarinas comerciales. Basándonos en los resultados obtenidos, se propone que durante la transición de las papedas incomestibles a las mandarinas ácidas, la domesticación se caracterizó por una primera fase de cambios radicales en la expresión de los genes que regulan rutas fundamentales tanto del metabolismo primario como del secundario. Esta fase estuvo determinada principalmente por la estimulación de los procesos de crecimiento y la reducción de las defensas químicas, constituidas por compuestos de sabores desagradables. También se sugiere que en una segunda fase los atributos asociados a la palatabilidad de las mandarinas, especialmente la acidez, se mejoraron progresivamente a través de modificaciones específicas. Otros cambios de relevancia se relacionaron con la regulación de genes involucrados tanto en la síntesis de sustancias básicas de agradable aroma y sabor, como en la modulación de transportadores de azúcares. Por lo tanto, la transición entre las papedas incomestibles y las mandarinas de tipo ácido se caracterizó esencialmente por una drástica reprogramación de la expresión génica de rutas metabólicas fundamentales, mientras que las mandarinas modernas evolucionaron posteriormente mediante un refinamiento progresivo de las propiedades relacionadas con la palatabilidad. En su conjunto, estas observaciones sugieren que en cítricos, las tasas de mutación de los tejidos somáticos son consistentes con la idea de que las mutaciones desempeñaron un papel importante en las últimas fases de la domesticación. / [CAT] La domesticació dels cítrics és un procés en gran part desconegut. Les investigacions poratades a terme fins al moment indiquen que les varietats de cítrics comercialitzades hui en dia són, en general, el producte de introgressions ancestrals intraespecífiques i interespecífiques. Les introgressions de tipus intraespecífic van tindre lloc entre les poblacions de dues subespècies antigues de mandarina tot aportant el comportament apomíctic que la majoria de les mandarines actuals i altres cítrics relacionats encara conserven. Una vegada que aquestes barreges genètiques o admixtures es consolidaren, diferents introgressions interespecífiques de pummelo establiren noves característiques en el genoma de mandarina. Durant el procés de domesticació, la variabilitat genètica dels cítrics va ser assolida mitjançant mutació espontània i, per mitjà de la pràctica de l'empelt, genotips sense llavors es van estendre ràpidamente, accentuant el paper de les mutacions en la selecció de cítrics com les taronges i les mandarines modernes. En aquest treball, mostrem com les mutacions somàtiques en cítrics es propaguen seguint un patró iteratiu determinat per un model de ramificació simpodial i, en conseqüència, queden agrupades al llarg de l'arbre, on algunes d'aquestes mutacions romanen fixades. En aquest escenari, un arbre pot ser considerat un mosaic genèticament format per diferents genomes, en el qual les branques més joves acumulen un nombre major de mutacions. De mitjana, el nostre arbre experimental de Clementina mostra una ràtio de mutació de 4.4 × 10&#8722;10 bp&#8722;1 yr&#8722;1, arribant a incloure en total entre 1500 i 5000 variants i produint-hi 1 mutació somática en cada meristem axil·lar. Aquest nombre relativament elevat de mutacions està en línia amb el gran nombre de varietats provinents de mutacions espontànies que es comercialitzen en cítrics. Per tal d'abordar la identificació de trets essencials adquirits durant la domesticació, s'ha analitzat el transcriptoma de fruits en desenvolupament de la varietat silvestre i incomestible papeda d'Ichang, la mandarina àcida Sun Chu Sha Kat i tres segregants comestibles derivats d'un creuament entre mandarines comercials. Basant-nos en els resultats obtinguts, s'ha proposat que durant la transició de les papedes incomestibles a les mandariens àcides, la domesticació es va caracteritzar per una primera fase de canvis radicals en l'expressió dels gens que regulen rutes fonamentals del metabolisme primari i secundari. Aquesta fase va estar determinada principalment per l'estimulació dels processos de creixement i la reducció de les defenses químiques de gust desplaent. També es suggereix que en una segona fase atributs associats a la palatabilitat de les mandarines, especialment l'acidesa, van ser millorats progressivament mitjançant modificacions específiques. Altres canvis de rellevància van estar relacionats amb l'estimulació de gens involucrats tant en la síntesi de substàncies bàsiques d'agradable aroma i sabor, com en la modulació de transportadors de sucres. Per tant, la transició entre les papedes incomestibles i les mandarines àcides va estar caracteritzada essencialment per una dràstica reprogramació de l'expressió gènica de rutes metabòliques fonamentals mentre que les mandarines modernes evolucionaren posteriorment mitjançant un refinament progressiu de propietats relacionades amb la palatabilitat. En conjunt, aquestes observacions suggereixen que, en els cítrics, les ràtios de mutació dels teixits somàtics són consistents amb la idea que les mutacions tingueren un paper important en les últimes fases de la domesticació. / [EN] Citrus domestication is a largely unknown process. Research carried out to date indicates that current commercial citrus varieties are, in general, the product of ancestral intraspecific and interspecific introgressions. Intraspecific introgressions took place between the populations of two antique subspecies of mandarins and contributed to the apomictic behavior that most current mandarins and other related citrus still retain today. Once these genetic admixtures were established, interspecific pummelo introgression brought new traits to the admixtured mandarin genome. During domestication, genetic variability of these citrus occurred mainly through spontaneous mutations and with the practice of grafting, seedless genotypes expanded rapidly, emphasizing the role of mutations in the selection of citrus such as oranges and modern mandarins. In this work, we provide evidence that somatic mutations in citrus propagate following an iterative pattern determined by the sympodial branching model and consequently are grouped in sectors along the tree, where some of them remain fixed. In this scenario, a tree can be considered a mosaic genetically composed of different genomes, in which younger branches accumulate greater number of mutations. On average, our 36-yr-old experimental Clementine tree shows a mutation rate of 4.4 × 10-10 bp-1 yr-1, may carry a total of 1,500 to 5,000 variants and produces 1 somatic mutation per axillary meristem. This relatively high number of mutations is in line with the large number of varieties derived from spontaneous mutations that are commercialized in citrus. To identify key traits elicited by citrus domestication, we analyzed transcriptomes from developing fruit pulp of wild inedible Ichang papeda, Sun Chu Sha Kat sour mandarin and three palatable segregants derived from a cross between commercial mandarins. Based on these results, we propose that during the transition from inedible papedas to sour mandarins, domestication involved a first phase of major changes in the expression of genes regulating central pathways of primary and secondary metabolism. This stage was mainly characterized by both the stimulation of growth processes and the reduction of distasteful chemicals defenses. It is also suggested that in a second phase, edible attributes of mandarins, especially acidity, were progressively improved through specific modifications. Other relevant changes included upregulation of genes involved in the synthesis of key substances of pleasant aroma and flavor, and the modulation of sugar transporters. Thus, the transition from inedible papeda to sour mandarin was essentially defined by a drastic reprogramming of gene expression of fundamental metabolic pathways, while modern mandarins evolved later through progressive refinement of palatability properties. Taken together, these observations suggest that the rates of mutations occurring in citrus somatic tissues are consistent with the idea that they have played an important role during the later steps of citrus domestication. / This research is co-funded by the Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Spain) through grant RTI2018-097790-R-100 and by the European Union through the European Regional Development Fund (ERDF) of the Generalitat Valenciana 2014- 2020, through grants IVIA 51915 and 52002 / Pérez Román, E. (2022). Mutation Rate and Gene Expression in Genetic Admixtures of Domesticated Citrus [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191452 / Compendio