Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-24T06:12:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 261115.pdf: 2991696 bytes, checksum: cc08f1ebb48d1f755580bbeb4ad3aa8a (MD5) / Os íons lantanídeos apresentam um efeito extraordinário na aceleração da velocidade de hidrólise de ésteres de fosfato e dessa forma, suas características intrínsecas os promovem a potenciais constituintes no desenvolvimento de nucleases artificiais. Entretanto, os íons LnIII livres tornam-se instáveis em meio alcalino, além de serem tóxicos a sistemas biológicos. Dessa maneira, a complexação desses íons se faz de extrema importância, na busca de novos complexos com íons LnIII que sejam cinética e termodinamicamente estáveis e que possam eficientemente catalisar a hidrólise de ligações ésteres de fosfato. No presente trabalho foram sintetizados dois ligantes não simétricos: o conhecido 2-[N-bis-(2-piridilmetil)aminometil]-4-metil-6-N#-[(2-piridilmetil) (2-hidróxi-benzil)aminometil]fenol (H2L1) e o ligante inédito 2- [N-bis-(2-piridilmetil)aminometil]-4-metil-6-[N#-bis(2-hidroxi-2-oxoetil)aminometil]fenol (H3L2). A partir de H2L1 foram sintetizados 4 complexos inéditos: [Tb(H2L1)(NO3)(H2O)3](NO3)2 (1), [Gd(H2L1)(NO3)(H2O)3](NO3)2 (2), [Eu(H2L1)(NO3)(H2O)3](NO3)2 (3) e [La(H2L1)(NO3)3(H2O)] (4) e mediante o ligante H3L2 o complexo inédito [Gd3(L2)2(NO3)2(H2O)4]NO3.8H2O (5) foi obtido. Todos os complexos foram caracterizados por CHN, IV, TGA e suas estruturas de raios-X resolvidas, sendo 1-3 isoestruturais. Os estudos em solução dos complexos 1-4 (ESI, potenciométricos) demonstram a existência de vários equilíbrios com a formação principalmente de espécies binucleares. Estudos de reatividade foram realizados para avaliar a atividade catalítica dos complexos na reação de hidrólise do substrato BDNPP, onde os complexos 1-3 e 5 apresentaram fatores catalíticos na ordem de milhões, superiores a qualquer complexo descrito na literatura. Os complexos 1-3 apresentaram o mesmo comportamento catalítico de diesterase e monoesterase frente ao substrato BDNPP, sendo possível monitorar as duas etapas de hidrólise separadamente. É sugerida para os complexos 1-3 uma espécie binuclear monohidróxida como a mais ativa na catálise e para o complexo 5 uma espécie trinuclear monohidróxida. Todos os complexos foram capazes de clivar hidroliticamente o DNA plasmidial, além de apresentarem certa regioespecificidade na ligação com o mesmo, indicando, dessa maneira, suas potenciais ações como nucleases químicas. Os estudos preliminares de luminescência dos complexos 1-3 revelaram seus potenciais como sondas, marcadores luminescentes. Lanthanide ions show an extraordinary effect on the acceleration of the rate of phosphate ester hydrolysis and, thus, their intrinsic characteristics make them attractive as potential constituents in the development of artificial nucleases. However, the free LnIII ions become unstable in alkaline medium, besides being toxic to biological systems. Thus, the complexation of these ions is of extreme importance in the search for new complexes with LnIII ions which are kinetically and thermodynamically stable and which can efficiently catalyze the hydrolysis of phosphate ester ligands. In this study two non symmetric ligands were synthesized: the known ligand 2-[N-bis-(2- pyridylmethyl) aminomethyl]-4-methyl-6- N#-[(2-pyridylmethyl) (2-hydroxy-benzyl) aminomethyl]phenol (H2L1) and the novel ligand 2-[N-bis-(2-pyridylmethyl)aminomethyl]-4-methyl-6-[N#-bis(2-hydroxy-2- oxoethyl)aminomethyl]phenol (H3L2). From the H2L1 ligand 4 novel complexes were synthesized: [Tb(H2L1)(NO3)(H2O)3](NO3)2 (1), [Gd(H2L1)(NO3)(H2O)3](NO3)2 (2), [Eu(H2L1)(NO3)(H2O)3](NO3)2 (3) and [La(H2L1)(NO3)3(H2O)] (4) and through the H3L2 ligand the novel complex [Gd3(L2)2(NO3)2(H2O)4]NO3.8H2O (5) was obtained. All of the complexes were characterized by CHN, IR spectroscopy and TGA and their X-ray structures were resolved, being 1-3 isostructures. The studies in solution of complexes 1-4 (ESI, potentiometry) showed the existence of several equilibria with the formation principally of binuclear species. Reactivity studies were carried out to evaluate the catalytic activity of the complexes in the hydrolysis reaction of the BDNPP substrate, where complexes 1-3 and 5 showed catalytic factors, in the order of millions, higher than any complex described in the literature. Complexes 1-3 show the same catalytic behavior as diesterase and monoesterase toward the BDNPP substrate, it being possible to monitor the two hydrolysis stages separately. For complexes 1-3 a binuclear monohydroxide species is suggested as the most active in the catalysis and for complex 5 a trinuclear monohydroxide species. All of the complexes were capable of hydrolytically cleaving plasmid DNA, and showed a certain regiospecificity in their binding with DNA, thus indicating their potential action as chemical nucleases. The preliminary studies on the luminescence of complexes 1-3 revealed their potential as luminescent probes and markers.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-20T19:07:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O desenvolvimento de reagentes que promovem eficiente clivagem no DNA constitui um desafio na atualidade devido à sua aplicação potencial para o desenvolvimento de novas nucleases, para a utilização como agentes terapêuticos e ferramentas úteis em toda a biologia molecular. Este trabalho inclui o estudo de nove compostos que foram capazes de clivar o DNA através de um possível mecanismo hidrolítico. Os compostos [Fe2III(BPClNOL)2(H2O)2](ClO4)2 (1), [Fe2III(BPClNOL)2(SO4)]×H2O (2), [Cu2(H2bbppnol)OAc(H2O)2]Cl2×2H2O (3), [Cu2(Hbtppnol)(OAc)](ClO4)2 (4), [Cu(HISMIMI)Cl2] (5), [Cu(HISMIMA)Cl2] (6), 1,3-bis(p-carboxifenil)triazeno (7), 1-(p-carboxifenil)-3-(p-amidofenil)triazeno (8) e 3-(p-carboxifenil)-1-feniltriazeno 1-óxido (9), foram capazes de clivar o DNA plasmidial ou genômico de mexilhão (gDNA). O trabalho faz uso de várias técnicas experimentais como a eletroforese em gel de agarose, espectroscopia eletrônica, voltametria cíclica, etc, utilizando-se condições definidas de pH, temperatura, concentração do composto e tipos de DNA e tampões.

No description available.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química / Made available in DSpace on 2012-10-22T07:34:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 224278.pdf: 2852563 bytes, checksum: 44f673b4b52c2daaa83a67b513278a9f (MD5) / Foi estudada a interação de cinco complexos metálicos de Cu2+ com moléculas de DNA. Foram estudados o complexo macrocíclico Cu2BMXD, o complexo mononuclear CuMFF e os complexos binucleares Cu2L-dtb, Cu2L-H e Cu2L-NO2 (estes diferenciam-se por substituições no anel fenólico terminal do ligante). Os estudos foram feitos pela incubação com o plamídio pBSK-II em diferentes condições e presença de inibidores e ligantes específicos do DNA. A constante de ligação intrínseca dos complexos com o DNA foi determinada por titulação UV-Vis. Todos os complexos foram capazes de causar quebras no DNA. O complexo Cu2BMXD tem uma grande afinidade por DNA, sendo ativo na degradação oxidativa destas moléculas através de um ciclo catalítico que envolve a formação de Cu+ e radicais HO×. O complexo CuMFF possui menor afinidade pelo DNA, mas é capaz de clivar estas moléculas hidroliticamente. Já os complexos Cu2L-X apresentam um mecanismo misto de degradação de DNA, sendo o Cu2L-dtb o mais ativo, seguido do Cu2L-NO2 e Cu2L-H. O complexo Cu2L-dtb é o que apresenta a maior tendência de degradação oxidativa do DNA. Entretanto, para todos os complexos a via hidrolítica é aumentada com o aumento do pH. A constante de ligação intrínseca destes complexos com o DNA é menor do que para os anteriores, porém, parece ser ela a responsável pela diferença de atividade encontrada entre os complexos Cu2L-H e Cu2L-NO2.

The role of the T7-induced exonuclease (gene 6) in recombination was studied using both molecular and genetic techniques. In the molecular method the fate of parental DNA during parent-to-progeny recombination was examined. A comparison of infections with T7⁺, T7am6 (amber gene 6), or T7ts6 (temperature sensitive gene 6) under permissive and nonpermissive conditions was made. CsCl density gradient analysis of replicative DNA indicated that the T7 exonuclease is necessary for recombination to occur, i.e., in the absence of the exonuclease the parental DNA replicated continuously as a hybrid molecule and did not recombine. Analysis of denatured replicative DNA by CsCl density gradient centrifugation indicated that the exonuclease also may be needed for a limited amount of covalent repair of recombinants. Further confirmation of the essential role which the exonuclease plays in recombination came from genetic analysis. The T7 exonuclease was shown to be necessary for intragenic and intergenic recombination in several areas of the T7 genetic map; genetic recombination frequencies were found to be decreased from 3 to 18-fold under conditions nonpermissive for the exonuclease. The role of the T7-induced endonuclease (gene 3) in molecular recombination was studied by examining the fate of parental DNA during parent-to-progeny recombination using a shear technique. The T7 endonuclease was found to be necessary for the dispersion of parental DNA in the newly replicated DNA. Concatemers synthesized by either T7⁺ or T7am3 (amber gene 3) phage containing the newly replicated DNA were sheared to the size of mature phage DNA and also to quarter size molecules. In the presence of gene 3 protein, parental DNA and newly replicated DNA were interspersed, i.e., the 32P-label from the sheared DNA was found to sediment at the density of recombined DNA. In the absence of gene 3 protein, the parental strand of each sheared DNA molecule was usually found intact, i.e., the ³²P-label from the sheared DNA was found to sediment at the density of hybrid DNA. These results support the previous genetic data (52, 83) that the gene 3 protein is essential for T7 recombination. The role of T7 recombination enzymes in the formation of concatemers was studied by examining selected gene 3 and gene 6 mutants. Results of sucrose gradient analysis showed that DNA concatemers were formed when both the T7 exonuclease (gene 6) and the T7 endonuclease (gene 3) were absent. Further results showed that concatemers cannot be maintained in the absence of the exonuclease unless the endonuclease was eliminated. In a T7am6 infection DNA concatemers formed early were prematurely broken down and accumulated as fragments smaller than mature size phage DNA. In a T7am3am6 (amber in both genes 3 and 6) infection concatemers accumulated and were not matured. These results indicate that concatemers are formed by a process other than normal phage recombination. However, selective defects in the recombination system do interfere with the stability of concatemers. / Science, Faculty of / Microbiology and Immunology, Department of / Graduate

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T22:54:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289615.pdf: 1626236 bytes, checksum: eb5909cc2286b014f8dbbb39bc279d05 (MD5) / Neste trabalho de dissertação foram sintetizados e caracterizados quatro complexos mononucleares de cobre (II), [Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O (1), [Cu(acac)dppz](ClO4) (2), [Cu(AAZ)dpq](ClO4)2.H2O (3), [Cu(dppz)tenoilCF3(CH3CN)].ClO4 (4). Os ligantes utilizados foram o acetilacetonato (acac), N-bis-(2- piridilmetil) amina (bpma), dipirido[3,2-f:2',3'-h]quinoxalina (dpq), dipirido[3,2-a:2',3'-c]fenazina monohidratado (dppz) e o tenoiltrifluoroacetonato (tenoilcf3). Os quatro complexos foram caracterizados através de medidas espectroscópicas (IV e UV-Vis), de condutividade e eletroquímicas (voltametria cíclica). As estruturas cristalinas inéditas foram resolvidas por difratometria de raios X. A avaliação da interação entre os quatro complexos e o CT-DNA foi realizada através de experimentos distintos. A titulação espectrofotométrica UV-Vis resultou em valores de Kb que demonstram a #boa# interação com o sulco maior do DNA. A titulação por fluorescência resultou em valores de Kapp na ordem de 106, que demonstram a interação dos compostos com DNA. A interação medida por voltametria de onda quadrada converge com os dados demonstrados pelos outros experimentos. A geometria planar dos ligantes dpq e dppz servem de âncora para a interação dos complexos entre os pares de bases do DNA. A atividade de nuclease e fotonuclease dos complexos 1, 2 e 3 foi determinada por experimentos de eletroforese em gel de agarose, para clivagem de DNA plasmidial. Os complexos apresentam bons resultados de clivagem no UV e sob luz visível (vermelha). A clivagem de DNA, com ativação na faixa do UV-A (365 nm) por 5 minutos mostra-se a mais eficaz. A citotoxicidade dos complexos 1, 2 e 3 foi determinada frente a células leucêmicas K562, com a determinação do IC50 de 1,75; 2,3 e 3,2 µmol.L-1 para os compostos, respectivamente. A concentração de cobre intracelular para os complexos 1, 2 e 3 ficou em 45x10-16, 45x10-16 e 153x10-16 mol.cél.-1, respectivamente. / In this study were synthesized and characterized four new mononuclear copper (II) complexes, [Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O (1), [Cu(acac)dppz](ClO4) (2), [Cu(AAZ)dpq](ClO4)2.H2O (3), [Cu(dppz)thenoylCF3(CH3CN)].ClO4 (4). The ligands used were acetylacetonate (acac), N-bis-(2-pyridilmethyl) amine (bpma), dipyrido[3,2-f:2',3'-h]quinoxaline (dpq), dipyrido[3,2-a:2',3'- c]phenazine monohydrated (dppz) and the thenoyltrifluoroacetonate (thenoylcf3). The four complexes were characterized using spectroscopic measurements (IR and UV-Vis), conductivity and eletrochemical analysis (cyclic voltammetry). The new structures were resolved by X-ray diffraction. Interaction study between the complexes and CT-DNA was made by distinct experiments. The evaluation of interaction among the four complexes and CT-DNA was carried out by different experiments. The spectrophotometric titration in UV-Vis results in values of Kb which shows the good interaction with the major groove of DNA. The fluorescence titration resulted in values of Kapp in order of 106, demonstrating the interaction of compounds with DNA. The interaction measured by square wave voltammetry converges with the presented data by other experiments. The planar geometry of the ligands dpq and dppz act like an anchor for the interaction of complexes between the base pairs of DNA. The nuclease and photonuclease activity of complexes 1, 2 and 3 was determined by agarose gel electrophoresis, for plasmidial DNA cleavage. The complexes show good cleavage results under UV and visible light (red light). The DNA cleavage, with activation in UV-A range (365 nm) by 5 minutes was the more effective. The cytotoxicity of complexes 1, 2 and 3 were determined front leukemic cells K562, with determination of IC50 of 1,75; 2,3 e 3,2 ìmol.L-1 for the compounds, respectively. The intracellular copper concentration for the complexes 1, 2 e 3 was 45x10- 16, 45x10-16 and 153x10-16 mol.cell.-1, respectively.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-graduação em Química / Made available in DSpace on 2012-10-23T01:40:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 246307.pdf: 1522841 bytes, checksum: e270e85d281daf546c1840335752a9f5 (MD5) / Complexos biomiméticos do sítio ativo das PAPs foram sintetizados com o objetivo de elucidar o papel das PAPs nos sistemas vivos e simultaneamente encontrar novas aplicações para estes complexos como nucleases sintéticas. Com este intuito, foi testada a atividade de uma série de complexos heterodinucleares Fe3+M2+, usando o ligante assimétrico H2BPBPMP. Os complexos são: FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH, FeMnOH e FeNiOAc. O DNA plasmidial foi utilizado como modelo para testar a clivagem da ligação fosfato pelos complexos. Foram testadas diferentes condições de pH e concentração dos complexos. As reações também foram realizadas na presença de captadores de radicais livres e na ausência de oxigênio. Para verificar a interação complexo/DNA foram realizados experimentos com Distamicina e titulação espectrofotométrica UV-Vis. Todos os complexos, exceto FeNiOAc, foram capazes de clivar DNA por um mecanismo hidrolítico em baixas concentrações do complexo (2,5 µM) a 37 oC em pH próximo ao fisiológico (faixa de 6,0 a 7,0). O complexo FeNiOAc não cliva o DNA, mas pode se ligar ao DNA e alterar significativamente sua mobilidade. O complexo FeCuOAc é o mais ativo da série apresentando uma aceleração de 2,71 x 107 vezes quando comparado com o valor do DNA não catalisado, seguido por, FeMnOH, FeZnOAc, FeCuOH e FeZnOH.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345481.pdf: 2659215 bytes, checksum: 3532ce8d584472564762a6d842dbec9a (MD5) Previous issue date: 2016 / O desenvolvimento de novas moléculas que auxiliam a manipulação de ácidos nucleicos é um tema que vem sendo alvo de grandes estudos nas áreas de bioquímica, biologia molecular, biotecnologia e química bioinorgânica, onde se buscam complexos que apresentam interação e/ou clivagem de ácidos nucleicos. Nestas áreas busca-se cada vez mais um modo de aprimoramento e incremento da seletividade destes complexos por regiões específicas do DNA. Dentro deste contexto, neste trabalho foram avaliados os potenciais de interação e clivagem de DNA através de 5 complexos binucleares biomiméticos derivados de fosfatases ácida púrpura, tomando como base o complexo FeZn-L0 e adicionando cadeias carbônicas de diferentes tamanhos com diaminas, como um modo de mimetizar a segunda esfera de coordenação da enzima. Todos os cinco complexos foram capazes de clivar o DNA plasmdial de um modo concentração-dependente. A variação do pH alterou significativamente a atividade destes complexos, o que indicou um mecanismo de clivagem semelhante àquele sugerido para a hidrólise do substrato modelo 2,4-BDNPP. Todos os complexos tiveram sua atividade inibida quando adicionado à reação concentrações crescentes dos sais NaCl e LiClO4, indicando que a neutralização das cargas do DNA pelos íons Na+ afeta diretamente o processo de catálise. Nenhum dos sequestradores de espécies reativas de oxigênio utilizados neste trabalho foram capazes de alterar a clivagem do DNA pelos complexos, sugerindo um mecanismo de atividade sem a participação de oxigênio, fato confirmado posteriormente pelo ensaio de clivagem na ausência de oxigênio em atmosfera de argônio. Foi possível perceber ainda que os complexos que apresentam as maiores cadeias carbônicas possuem uma preferência de interação com DNA através do sulco maior, sendo que o complexo que possui a menor cadeia carbônica não apresentou especificidade por ambos os sulcos, porém necessitou acessar o DNA por um destes. O complexo que não possui cadeia carbônica, por sua vez, apresentou uma preferência de interação ao DNA através do sulco menor. As constantes cinéticas encontradas neste trabalho mostraram que a inserção destas cadeias carbônicas ao complexo aumentou em até 5.5 vezes a eficiência catalítica dos mesmos. O ensaio de dicroísmo circular demonstrou que todos os complexos estudados foram capazes de alterar a estrutura secundária do DNA, diminuindo sua helicidade e o empilhamento de bases, fenômeno encontrado na literatura por moléculas que são capazes de acessar o DNA através dos sulcos maior ou menor. Por fim, ensaios de interação dos complexos com oligonucleotídeos demonstraram através da técnica de footprinting que os complexos são capazes de interagir com esta molécula e dificultar a clivagem do DNA pelo Fe-EDTA, principalmente em locais onde predominam bases pirimídicas, sugerindo uma especificidade destes complexos por estas regiões. De modo geral, a inserção de cadeias carbônicas como um modo de mimetizar uma segunda esfera de coordenação nestes complexos é uma estratégia viável para potencializar a atividade destas moléculas artificiais quanto a interação e clivagem de DNA.<br> / Abstract : The development of new molecules that aid in the handling of nucleic acids has been the subject of many studies in the fields of biochemistry, molecular biology, biotechnology and bioinorganic chemistry, searching for complexes that are capable of interacting and/or cleaving these molecules. These studiesfocus on the increase and enhancement selectivity of complexesto specific regions of DNA. In this context, this study evaluated the potential of interaction and cleavage of DNA by 5 biomimetic binuclear complexes derived from acid purple phosphatases, where,based on FeZn-L0 complex,carbon chains ofdifferent sizes containing diamines were added, in order to mimic the second coordination sphere of the model enzyme. All five compounds were able to cleave plasmid DNA in a concentration-dependent manner. Variations of pH changed significantly the activity of these complexes, which indicated a similar cleavage mechanism to the one suggested for the hydrolysis of the model substrate 2,4-BDNPP. All complexes had their activity inhibited by the additionof increasing concentrations of NaCl and LiClO4 saltsto the reaction, indicating that neutralization of DNA charges by Na + ions directly affects the catalysis process. None of the scavengers of reactive oxygen species used in this study were able to change the cleavage of DNA, suggesting activity reaction mechanism without the participation of oxygen, a fact later confirmed by the cleavage assay in the absence of oxygen.It was perceived that the complexes having longer carbon chains had a preferably interaction to DNA through the major groove.The complex with smaller carbon chain displayedno specificity for both grooves, but still required access to the grooves to bind with DNA. The kinetic constants found in this study indicated that the inclusion of these carbon chains tothe complex increased by up to 5.5 times the catalytic efficiency of the complexes.The circular dichroism assay demonstrated that all studied complexes were able to alter the secondary structure of DNA, by reducing its helicity and base stacking, a phenomenon found in the literature on molecules that are able to access the DNA through major or minor grooves. Lastly, interaction assays between complex and oligonucleotides,evaluated by ahydroxyl radical footprinting technique, showed that the complexes are capable of interacting and hinder cleavage of DNA by Fe-EDTA generated hydroxyl radicals, particularly in regions rich in pyrimidine bases, suggesting a specificity of these complexes tothese regions. In general, the inclusion of carbon chains as a way to mimic the second coordination sphere in these complexes is a viable strategy to potentiate the activity of these artificial molecules tointeract and cleave DNA.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-08T04:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334170.pdf: 3585630 bytes, checksum: b2b922d427eb4f74499842076e23a655 (MD5) Previous issue date: 2015 / O desenvolvimento de novas moléculas e/ou novas metodologias para clivagem de DNA é um tema de crescente investimento nos últimos anos, seja na descoberta de novas ferramentas para biologia molecular ou de protótipos para fármacos antitumorais. Neste trabalho procurou-se determinar a interação e clivagem de DNA por novos complexos ternários de cobre(II) e que possuem atividade antitumoral frente a uma linhagem de células leucêmicas, com o intuito de determinar se sua atividade citotóxica está relacionada à capacidade de fragmentar DNA. Além disso, estudos da atividade de fotoclivagem de DNA (sob luz UV) foram realizados visando o seu potencial uso em terapia fotodinâmica. Paralelamente, uma potencial estratégia para o aumento da atividade de clivagem de DNA por complexos de Fe(III)Zn(II) foi caracterizada como forma prática para potencializar a atividade de agentes sintéticos que reconhecidamente clivam DNA. Os quatro novos complexos de cobre são: [Cu(hyd)(bpy)]2+ (Cu(hyd)(bpy), [Cu(hyd)(phen)]2+ (Cu(hyd)(phen), [Cu(S-hyd)(bpy)]2+ (Cu(S-hyd)(bpy) e [Cu(S-hyd)(phen)]2+ (Cu(S-hyd)(phen)), em que: hyd e S-hyd são a hidrazida do ácido 2-furóico e do ácido 2-tiofenocarboxílico e bpy e phen são os ligantes heterocíclicos 2,2?-bipiridina e 1,10-fenantrolina, respectivamente. Todos os quatro complexos foram capazes de clivar o DNA plasmidial de modo concentração-dependente e com diferentes eficiências. Alterações no pH não influenciaram na atividade dos complexos e sua atividade é proveniente da natureza química do complexo: ligante-metal-ligante. Interações eletrostáticas e ligação por sulco mostraram-se ser necessárias para o processo de clivagem de DNA que sugere-se ser predominantemente oxidativo. Os ensaios cinéticos confirmaram a ordem de reatividade dos complexos Cu(hyd)(bpy) << Cu(hyd)(phen) ~ Cu(S-hyd)(bpy) < Cu(S-hyd)(phen) que segue a ordem de afinidade pelo DNA e indicam que os últimos três complexos são tão ou mais reativos do que os melhores exemplos encontrados na literatura. A velocidade da reação e a capacidade de provocar a morte celular em células tumorais apresentou uma excelente correlação, sugerindo que a atividade antitumoral destas moléculas pode ser proveniente da atividade de clivagem de DNA. Em condições de fotoclivagem, porém, a ordem de reatividade foi: Cu(S-hyd)(bpy) < Cu(S-hyd)(phen) < Cu(hyd)(bpy) < Cu(hyd)(phen). Quando observada a razão entre a velocidade de fotoclivagem com a clivagem de DNA, vemos que incremento variou de aproximadamente 6 para 146 vezes. Sob condições de fotoclivagem, não houve mudanças no mecanismo de clivagem de DNA, sugerindo que a exposição à luz UV deve amplificar atividade oxidativa dos complexos frente ao DNA. Ensaios de clivagem com oligonucleotídeos mostraram que todos os complexos foram capazes de fragmentá-lo de modo não específico, ou seja, com eventos de corte ao longo de toda a molécula de DNA. Os complexos com ligante phen mostraram os melhores resultados: ficou evidenciada a formação de fragmentos contendo terminais 3?-fosfoglicolato, cuja formação deve-se a processos oxidativos, reforçando a hipótese que estes complexos clivam o DNA pela geração de ROS. Os ensaios de interação por dicroísmo circular sugerem que o comportamento de ligação dos complexos ao DNA deva ser do tipo não-intercalativo. De modo geral, os quatro complexos de Cu(II) aqui testados mostram-se promissores modelos para desenvolvimento de novos complexos com atividade antitumoral ligada à clivagem de DNA. Além disso, mais uma vez o uso de exposição a luz UV mostrou-se apto para aumentar a atividade dos complexos, o que traz à discussão um possível uso como protótipo a droga para Terapia Fotodinâmica. Os complexos de Fe(III)Zn(II) estudados; [FeIII-(µ-OH)ZnIILP1] (FeZnLP1) e [FeIII-(µ-OH)ZnIILP2] (FeZnLP1) são derivados pireno-substituídos do complexo [FeIII-(µ-OH)ZnIILH] (FeZnOH). Ambos os complexos foram capazes de clivar o DNA plasmidial gerando não só quebras-simples, bem como quebras-duplas, efeito não observado para o complexo FeZnOH. A variação do pH afeta fortemente a atividade de ambos os complexos e concorda com a hidrólise do éster de fosfato 2,4-BDNPP, sugerindo que o mesmo mecanismo de hidrólise do éster modelo pode ser aplicado ao DNA. Todos os complexos tiveram sua atividade fortemente inibida pela adição crescente de NaCl ou NaClO4 sugerindo a participação de interações eletrostáticas entre os complexos e o DNA. Nenhum sequestrador de ROS foi capaz de inibir a atividade dos complexos, sugerindo um mecanismo predominantemente hidrolítico o que já havia sido visto com o complexo FeZnOH. Ambos os complexos apresentaram preferência pela interação com o sulco menor, o que também foi observado nos ensaios com dicroísmo circular. Os ensaios cinéticos revelaram que a introdução de um único grupo pireno levou ao aumento de mais de 11,3 vezes na atividade deste complexo em comparação ao complexo modelo. Já a adição de dois grupos pireno aumentou ainda mais esta atividade atingindo um incremento de 18,6 vezes. Quando se compara os complexos FeZnLP1 e FeZnLP2 entre si, vemos um aumento de 1,65 vezes na atividade de FeZnLP2 vs FeZnLP1, ou seja, corroborando os resultados anteriores que apontavam FeZnLP2 como mais reativo que FeZnLP1. Nenhum dos complexos mostrou-se apto a clivar o oligonucleotídeo de 49-mer, mas ensaios de Footprinting por DNAse I revelaram que os complexos tendem a ligar mais fortemente em regiões contendo sequências AT, sendo sugerido que quanto maior o volume que o complexo ocupa no espaço, maior é a extensão da interação. De modo geral, o incremento substancial da atividade dos complexos pireno modificados ratifica a hipótese de que a introdução de grupos que se ligam ao DNA é uma viável estratégia para potencializar a ação de agentes artificiais de clivagem de DNA.<br> / Abstract : The development of new molecules and/or new strategies for DNA cleavage is an increasing investment issue in recent years for the discovery of new molecular biology tools or prototypes for antitumor drugs. In this study aimed to determine the DNA interaction and cleavage by new ternary complexes of copper(II) which have anti-tumor activity against a strain of leukemia cells in order to determine whether their cytotoxic activity is related to the ability to fragment DNA. In addition, DNA photocleavage studies (under UV light) were conducted to analyze their potential use in photodynamic therapy. Meanwhile, a potential strategy to increase the DNA cleavage activity of Fe(III)Zn(II) complexes was characterized as a practical way to enhance the activity of synthetic agents that are known to cleave DNA. The four new copper complexes are [Cu(hyd)(bpy)]2+ (Cu(hyd)(bpy), [Cu(hyd)(phen)]2+ (Cu(hyd)(phen), [Cu(S-hyd)(bpy)]2+ (Cu(S-hyd)(bpy) e [Cu(S-hyd)(phen)]2+ (Cu(S-hyd)(phen)) where: S-hyd and hyd are hydrazides from 2-furoic acid and 2-thiophenecarboxylic acid and bpy and phen are the heterocyclic ligands 2,2'-bipyridine and 1,10-phenanthroline, respectively. All four complexes were able to cleave the plasmid DNA in a concentration-dependent manner with different efficiencies. Changes in pH did not influence the activity of the complex and its activity should be derived from the chemical nature of the complex formation: ligand-metal-ligand. Electrostatic interactions and groove binding shown to be required for the DNA cleavage which, is suggested, be predominantly oxidative. The kinetic experiments confirmed the reactivity order of the complex Cu(hyd)(bpy) << Cu(hyd)(phen) ~ Cu(S-hyd)(bpy) < Cu(S-hyd)(phen) which follow the order of DNA affinity, indicating that the last three complexes are among the most reactive examples found in the literature. The speed of reaction and the ability to trigger cell death in tumor cells showed an excellent correlation suggesting that the antitumour activity of these molecules can be derived from the DNA cleavage activity. In photocleavage conditions, however, the reactivity order was: Cu(S-hyd)(bpy) < Cu(S-hyd)(phen) < Cu(hyd)(bpy) < Cu (hyd)(phen). The ratio of the observed rates of DNA photocleavage by DNA cleavage ranged from about 6 to 146-fold. Under conditions of photocleavage, no changes in DNA cleavage mechanism were found; suggesting that exposure to UV light should amplify the oxidative activity of the complexes towards DNA. Oligonucleotide cleavage assays revealed that all the complexes were able to fragment the DNA in a non-specific way, with scission events throughout the DNA molecule. Complexes containing phen ligand showed the best results was evidenced the formation of fragments containing terminal 3'-phosphoglycolate, whose formation is related to oxidative processes, reinforcing the hypothesis that these complexes cleaves the DNA for the generation of ROS. Circular Dichroism assays suggest that the DNA binding behavior of theses complexes must proceed as a non-intercalative way. In general, the tested four Cu(II) complexes showed as promise for development of new models complexes with antitumor activity linked to DNA cleavage. In addition, the use of UV light exposure was shown to be able to increase the activity of the complex, which moots a possible use as a prototype drug for Photodynamic Therapy. The studied Fe(III)Zn(II) complexes [FeIII-(µ-OH)ZnIILP1] (FeZnLP1) and [FeIII-(µ-OH)ZnIILP2] (FeZnLP1) are pyrene derivatives from [FeIII-(µ-OH)ZnIILH] complex (FeZnOH). Both complexes were able to cleave the plasmid DNA generating not only single- but also double-strand breaks, which were not observed for the FeZnOH complex. The pH variation strongly affects the activity of both complex and agrees with the hydrolysis of 2,4-BDNPP phosphate ester, suggesting that the same mechanism hydrolysis of the ester model can be applied to DNA. Both complexes had their activity strongly inhibited by the increasing addition of NaCl or NaClO4 suggesting the participation of electrostatic interactions between the complex and the DNA. None of ROS inhibitors were able to inhibit the activity of the complex, suggesting a predominantly hydrolytic mechanism which had already been seen with the FeZnOH complex. Both complexes have preference for interaction with the DNA minor groove, which was also observed in Circular Dichroism assays. Kinetic studies showed that introduction of a single pyrene group led to an increase of 11.3-fold compared to FeZnOH. Besides, the addition of two pyrene groups further increased this activity 18.6-fold. When comparing the FeZnLP1 to FeZnLP2 an increase of 1.65-fold was observed, confirming the previous results which showed that FeZnLP2 is more reactive than FeZnLP1. None of the complexes were able to cleave a short oligonucleotide, but DNAse footprinting assays revealed that the complexes tend to bind preferentially (and more affinity) to AT-rich regions and suggested that as much larger was the complex (in terms of volume), the greater is the extent of the interaction. In general, the substantial increase in activity of the modified pyrene complexes exemplifies the hypothesis that the introduction of groups that bind to DNA is a viable strategy to enhance the action of artificial DNA cleaving agents.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-22T04:08:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334472.pdf: 1503354 bytes, checksum: 8164ff883d8936286df1bfdcd2be8e23 (MD5) Previous issue date: 2015 / Nucleases e proteases são enzimas que possuem a capacidade de degradar hidroliticamente ligações fosfodiéster e peptídicas, respectivamente. Neste sentido, nas ultimas décadas diversos modelos de nucleases e proteases sintéticas vêm sendo desenvolvidos a fim de mimetizar a função dessas proteínas. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade catalítica de complexos metálicos como modelo de hidrolases frente à clivagem de DNA ou proteína. Os complexos testados na clivagem de DNA foram os seguintes: complexo mononuclear de lantânio (III) [La(L1)(NO3)2].0,25H2O (1) e sua forma imobilizada em sílica 3-aminopropil (APS-1) e o complexo mononuclear de Cu(II) [Cu(LPurina)Cl] (CuLPu). Já na BSA foram testados dois complexos de Cu(II): [Cu(Shyd)(byp)] e [Cu(Shyd)(phen)]. Quando se comparou a atividade catalítica de 1 com sua forma imobilizada (APS-1) foi possível observar que ambas possuem a capacidade de clivar o DNA, sendo esta mais branda com o complexo imobilizado. Através de experimentos com sequestradores de espécies reativas de oxigênio é possível sugerir que estes atuam por uma via hidrolítica, como já demonstrado para diversos outros complexos de lantânio. Com relação ao complexo CuLPu, este mostrou-se capaz de clivar DNA plasmidial em condições brandas de pH e temperatura e em concentrações na escala de micromolar. O mecanismo de ação mostrou-se dependente de espécies reativas de oxigênio, sendo comprovadamente oxidativo pelo experimento em atmosfera de argônio, onde a atividade do complexo diminui drasticamente. Não há preferência por sulcos específicos do DNA, sugerindo que a interação ocorra por ambos, como mostrado pelo espectro de dicroísmo circular e o ensaio com inibidores de sulco. A influência da força iônica mostrou que o complexo também pode interagir com o DNA através de interações eletrostáticas, dado também corroborado pelo espectro de DC. O complexo mostrou-se capaz de acelerar a reação de clivagem de DNA em uma escala de 107 vezes quando comparado com a reação não catalisada, mostrando assim o importante papel da adição da purina para a eficiência catalítica. Os complexos [Cu(Shyd)(byp)] e [Cu(Shyd)(phen)] também se mostraram bastantes ativos na clivagem de BSA, interagindo com a proteína por interações eletrostáticas e atuando provavelmente por um mecanismo oxidativo. As constantes cinéticas de clivagem observadas mostram alta eficiência catalítica, sendo [Cu(Shyd)(phen)] (1,2790 h-1) mais ativo que [Cu(Shyd)(byp)] (0,7159 h-1) efeito provavelmente causado pelo ligante de fenantrolina pertencente a [Cu(Shyd)(phen)], demostrando assim, o potencial destes complexos como miméticos de proteases.<br> / Abstract : Nucleases and proteases are enzymes which are able to hydrolyze phosphodiester and peptide bonds, respectively. In this regard, the last decades many nucleases and synthetic proteases have been developed to mimic the function of these proteins. Thus, this study aimed to evaluate the catalytic activity of metal complexes model of hydrolases for cleavage of DNA or protein. The tested complexes in terms of DNA cleavage were: a mononuclear complex of lanthanum (III) [La(L1)(NO3)2].0,25H2O (1) and its immobilized form 3-aminopropyl silica (APS-1); and a mononuclear complex of Cu(II) [Cu(LPurina)Cl] (CuLPu). Protein (BSA) cleavage were investigated with two complexes of Cu (II) [Cu(Shyd)(bpy)] and [Cu(Shyd)(phen)]. Comparing the catalytic activity of immobilized form (APS-1) with 1, has been observed that both have the ability to cleave the DNA, which is more mild to the immobilized complex. Through experiments with reactive oxygen species scavengers, was possible to suggest that 1 and APS-1 act by a hydrolytic pathway, as demonstrated for several other lanthanum complexes. Regarding CuLPu complex, this proved to be able of cleaving plasmid DNA under mild conditions and temperature and concentrations at the micromolar range. The mechanism of cleavage was dependent on reactive oxygen species proved by experiment in an argon atmosphere, where the activity of the complex decreases dramatically. There is no specific preference for DNA grooves which is also observed by circular dichroism studies. The influence of ionic strength showed that the complex may also interact with DNA through electrostatic interactions. The complex was shown to be able to accelerate DNA cleavage reaction on a scale 107 times when compared with the uncatalyzed reaction, thus showing the important role of purine addition to the catalytic efficiency. The complexes [Cu(Shyd)(bpy)] and [Cu(Shyd)(phen)] were also quite active in BSA cleavage, interacting with the protein by electrostatic interactions and with an oxidative mechanism. The observed cleavage rate constants show high catalytic efficiency, and [Cu (Shyd) (phen)] (1.2790 h-1) was more active than [Cu(Shyd)(byp)] (0.7159 h-1) effect probably caused by the phenanthroline ligand belonging to [Cu(Shyd)(phen)], thereby demonstrating the potential mimetics such as proteases.