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Význam lokalizace: funkce paxillinu a fosfolipidů v buněčném jádře / Localization matters: function of paxillin and phopholipids in the cell nucleus

Marášek, Pavel January 2015 (has links)
(English) Both paxillin and PIP2 are well known components of the cell, although of a distinct origin. Focal adhesion protein paxillin spreads the signals from extracellular matrix via integrins and growth factor receptors to affect cellular motility and migration (Schaller, 2001). PIP2, a major structural component of cytoplasmic membrane, is utilized by phospholipase C to generate second messenger molecules (Hokin and Hokin 1953; Streb et al. 1983). Both molecules were recently shown to be localized in the nucleus. Their original functions have been well established, but together with other research colleagues we are now shedding more light on completely different functions of these biological molecules and moreover, in the different compartments than they were primarily believed to function in. Here, we introduce paxillin as an important factor of the cell nucleus, where it regulates transcription of two important growth-related genes, IGF2 and H19. It does not affect the allelic expression of these imprinted genes, it rather regulates long-range chromosomal interactions between H19 or IGF2 promoter, and the shared distal enhacer on an active allele. In detail, paxillin stimulates the interaction between the enhancer and the IGF2 promoter, activating IGF2 gene transcription, while it restrains...
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Study of the role of plant nuclear envelope and lamina-like components in nuclear and chromatin organisation using 3D imaging / Analyse du rôle de l'enveloppe nucléaire et des composants de la lamina-like dans l'organisation chromatinienne et nucléaire chez les plantes en utilisant de l'imagerie 3D

Poulet, Axel 06 June 2016 (has links)
Le complexe linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) est un complexe protéique conservé au cours de l’évolution, reliant les compartiments cytoplasmiques et nucléaires au travers la membrane nucléaire. Bien que les données récentes montrent une de ce complexe dans la régulation de la morphologie nucléaire et de la méiose, son implication dans l’organisation de la chromatine a été moins étudié chez les plantes. Le premier objectif de ce travail était de développer un plugin NucleusJ ImageJ dédié à la caractérisation de la morphologie nucléaire et de l’organisation de la chromatine en 3D. NucleusJ calcul 15 paramètres, y compris la forme et la taille des noyaux ainsi que des objets intra-nuclaires et leur position dans le noyau. Une documentation pour ce programme est disponible pour son utilisation, ainsi que des qu’un jeu données de noyaux pour tester ce programme. Plusieurs améliorations sont en cours pour développer une nouvelle version de ce plugin. Dans une deuxième partie de ce travail, des méthodes d’imagerie 3D ont été utilisées pour étudier la morphologie nucléaire et l’organisation de la chromatine dans les noyaux interphasiques chez Arabidopsis thaliana dans lequel les domaines d’htrochromatique sont groupés en régions detectable appelés chromocentres. Ces chromocentres forment un environnement répressif contribuant la rpression transcriptionnelle de séquences répétées permettant la stabilité du génome. Des mesures quantitatives de la position 3D de chromocentres dans le noyau montrent que la plupart chromocentres sont situés proximité de la périphérie du noyau, mais que cette distance peut être modifiée par le volume nucléaire ou dans certains mutants affectant le complexe LINC. Ce complexe LINC est proposé pour contribuer l’organisation de la chromatine et à son positionnement, de plus la mutation de ce complexe est associée une dérégulation l’inactivation de la transcription, ainsi qu’a une décompaction des séquences hétérochromatiques. La dernière partie de ce travail tire profit de séquences gnomiques disponibles et les données de RNA-seq pour explorer l’évolution des protines de la NE chez les plantes. Au Final, le travail réalisé durant cette thèse associe la génétique, la biologie moléculaire, la bioinformatique et de l’imagerie afin de mieux comprendre la contribution de l’enveloppe nucléaire dans l’organisation de la morphologie du noyaux et de la chromatine et suggère l’implication fonctionnelle du complexe LINC dans ces processus. / The linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex is an evolutionarily well-conserved protein bridge connecting the cytoplasmic and nuclear compartments across the nuclear membrane. While recent data supports its function in nuclear morphology and meiosis, its implication for chromatin organisation has been less studied in plants. The first aim of this work was to develop NucleusJ a simple and user-friendly ImageJ plugin dedicated to the characterisation of nuclear morphology and chromatin organisation in 3D. NucleusJ quantifies 15 parameters including shape and size of nuclei as well as intra-nuclear objects and their position within the nucleus. A step-by-step documentation is available for self-training, together with data sets of nuclei with different nuclear organisation. Several improvements are ongoing to release a new version of this plugin. In a second part of this work, 3D imaging methods have been used to investigate nuclear morphology and chromatin organisation in interphase nuclei of the plant model Arabidopsis thaliana in which heterochromatin domains cluster in conspicuous chromatin regions called chromocentres. Chromocentres form a repressive chromatin environment contributing to the transcriptional silencing of repeated sequences a general mechanism needed for genome stability. Quantitative measurements of 3D position of chromocentres in the nucleus indicate that most chromocentres are situated in close proximity to the periphery of the nucleus but that this distance can be altered according to nuclear volume or in specific mutants affecting the LINC complex. Finally, the LINC complex is proposed to contribute at the proper chromatin organisation and positioning since its alteration is associated with the release of transcriptional silencing as well as decompaction of heterochromatic sequences. The last part of this work takes advantage of available genomic sequences and RNA-seq data to explore the evolution of NE proteins in plants and propose a minimal requirement to built the simplest functional nuclear envelope. Altogether, work achieved in this thesis associate genetics, molecular biology, bioinformatics and imaging to better understand the contribution of the nuclear envelope in nuclear morphology and chromatin organisation and suggests the functional implication of the LINC complex in these processes.
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Molecular and functional analysis of cardiac diversification by cell specific translatomic approaches in Drosophila Melanogaster / Analyses moléculaires et fonctionnelles de la diversification cardiaques par des approaches translatomiques cellules-spécifiques chez la Drosophile

Dondi, Cristiana 08 June 2018 (has links)
Le cœur humain est un organe composé de différents types cellulaires tels que les cardiomyocytes, les fibroblastes, les muscles lisses et les cellules endothéliales. Ces cellules se diversifient grâce à des mécanismes moléculaires spécifiques en acquérant leurs propriétés fonctionnelles spécifiques. L’embryon de Drosophile est un modèle simple et adapté pour étudier la diversification des cellules cardiaques et leurs propriétés spécifiques. Le but du projet est d’améliorer notre connaissance sur les acteurs moléculaires qui contrôlent la diversification des cellules cardiaques. Pour atteindre cet objectif nous avons appliqué la méthode TRAP-rc ("rare cell Translation Ribosome Affinity Purification") suivie du séquençage ARN pour identifier les ARN messagers en cours de traduction spécifiques des cellules cardiaques Tin et Lb (Tin CBs et Lb CBs) à deux stades de développement corrélés avec la morphogenèse du cœur embryonnaire. Dans une première analyse focalisée sur l'analyse des données issues des TRAP-Seq sur cellules Tin nous avons mis en évidence que CAP et MSP-300 sont impliqués dans la migration des cardioblasts pendant la fermeture du cœur. En parallèle, nous avons également identifié deux autres gènes impliqués dans la morphogenèse, kon-tiki et dGrip qui semblent contrôler la cohésion des CBs au cours de la migration. En outre, nous avons trouvé qu'au stade 16, environ 60% des gènes enrichis sont communs entre les populations Tin et Lb. Parmi ces gènes, Src42, sqa et flr participent à la régulation du cytosquelette d'actine et nos analyses ont permis de démontrer qu'ils avaient également des fonctions dans la morphogenèse cardiaque. Nous avons également identifié des groupes de gènes plus spécifiques à chacune des populations ciblées. Une catégorie fonctionnelle fortement associée à la population Lb, comprend les gènes qui régulent l'épissage des ARN messagers et certains de ces gènes semblent être requis au cours de la morphogenèse cardiaque. Enfin, nous avons comparé nos données de TRAP-seq cardiaque avec des données de TRAP-Seq issues du muscle somatique (de l'équipe), et ainsi identifié près de 90 gènes qui présentent des isoformes protéiques spécifiques à chaque tissu notamment impliquées dans la formation de l'unité contractile sarcomérique. Ceci suggère que des mécanismes d'épissage spécifiques sont mis en place dans différents types cellulaires pour moduler les fonctions de certaines protéines musculaires. A travers ce projet, nous avons identifié de nouveaux acteurs généraux de la migration collective des cardioblastes au cours de la fermeture du cœur mais également de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans l’acquisition des propriétés spécifiques dessous populations cardiaques Tin et Lb et de tissus musculaires distincts. Nous espérons que les données générées permettront dans le futur de mieux comprendre les mécanismes de la cardiogenèse des vertébrés ainsi que l’étiologie de maladies cardiaques. / Cardiac cells diversification is required for the formation of a functional heart. Human heart is a multi-lineage organ that develops through progressive diversification of progenitors derived from different heart fields. This process is underlined by numerous changes in the expression of a repertory of genes that allow cells to acquire their own identity and functions. The Drosophila embryo is a relatively simple model to study the diversification of cardiac cells and their properties. The goal of this project is to identify the repertories of genes that control the formation of different types of cardiac cells. To reach this objective we applied Translation Ribosome Affinity Purification (TRAP) method followed by RNA sequencing in order to identify mRNA engaged in translation specific to two cardiac cell types (Tinman (Tin) and Labybird (Lb) expressing cells), at two different time windows. We obtained a list of enriched genes for the different types of cardiac cells and time points. In a first part, we focused our attention on the Tindatasets and found that two genes, CAP and Msp300, are involved in cardioblasts migration during the heart closure. Then we identified two other candidate genes kontiki and dGrip that seem to contribute to maintain cohesion between CBs during heartmorphogenesis. Moreover by comparing our spatial datasets, we found that for the same time point, around 60% of Tin CBs enriched genes are common with Lb CBs enriched population and within this group we identified evolutionary conserved genes such as Src42, flr and sqa known to be involved in the cytoskeleton organization and in the actinpolymerization and depolymerisation. Our premiminary analyses show that they seem to be required for correct cardiac morphogenesis. We also identified sets of genes more specific for each cardiac cell population. Indeed, Lb CBs datasets show that in early stage there is the enrichment of genes mostly involved in transcriptional regulation and RNA splicing and some of these genes (prp8 and prp38) are involved in cardiac development. In parallel, we compared our TRAP-Seq dataset in the cardiac system with the TRAP-seqon muscle cells, and identified close to 90 genes that present cardiac or muscular specific isoforms. It is known that the alternative splicing, by increasing proteins diversity, contributes to the acquisition of specific cell properties. Furthermore, some cardiomyopathies are associated to defects in the alternative splicing of genes encoding sarcomeric proteins that we found in our dataset such as Tropomyosin and Zasp52. With this project, we have identified new actors of collective cardioblast migration and a set of genes with potential role in the acquisition of individual properties of Tin and Lbcardiac cells or of specific type of muscle tissue. We hope that our data could provide new insights into the genetic control of vertebrate cardiogenesis and into etiology of cardiac diseases.
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Characterisation of Nuclear Envelope-Associated Proteins (NEAPs) in Arabidopsis thaliana / Caractérisation des protéines associées à l'enveloppe nucléaire (NEAPs) chez Arabidopsis thaliana

Détourné, Gwénaëlle 29 May 2019 (has links)
Au cours de l'évolution, les cellules eucaryotes ont acquis une enveloppe nucléaire (NE) renfermant et protégeant le génome organisé en chromatine, une structure où l'ADN s’enroule autour de protéines histones. La NE est composé de deux membranes : du côté nucléoplasmique, la membrane nucléaire interne (INM) et du côté cytoplasmique, la membrane nucléaire externe. La NE permet la communication entre les deux compartiments par le biais des complexes de pores nucléaires et relie le cytosquelette au nucléosquelette via le complexe LINC (LInker of Nucleoskeleton to Cytoskeleton). Ainsi, le nucléosquelette associé à l'INM est nécessaire pour transmettre des signaux au noyau et induire des changements dans l'organisation de la chromatine et finalement dans l'expression des gènes.Une nouvelle famille de protéines associées à l'enveloppe nucléaire (NEAP),proposées comme nouveaux composants du nucléosquelette de la plante, a récemment été mise en évidence dans la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ces protéines sont codées par une famille de trois gènes et sont ciblées vers le noyau via un NLS où elles sont ancrées à l'INM via leur domaine transmembranaire C-terminal. Les protéines AtNEAPs possèdent également plusieurs longs domaines en spirale (coiled-coil) rappelant la structure des lamines chez les animaux. Cette thèse visait à réaliser une analyse fonctionnelle des AtNEAPs à l'aide de lignées mutantes T-DNA et CRISPR/Cas9. L'interactome AtNEAP a été étudié par des approches moléculaires (Yeast Two Hybrid), indiquant des interactions entre AtNEAPs pouvant former des homo- ou hétéro-dimères; ainsi que la localisation et la co-localisation in vivo couplées à de l’imagerie (apFRET), qui ont confirmé les interactions avec le facteur de transcription (TF) AtbZIP18. Les anticorps spécifiques à AtNEAP générés au cours de cette étude ont été utilisés pour confirmer l'expression in vivo. En outre, les résultats ont indiqué que les AtNEAPs font partie du nucléosquelette et jouent un rôle dans l’ancrage des TF à l’INM afin de maintenir la morphologie nucléaire et l’organisation de la chromatine. / During evolution, eukaryotic cells have acquired a nuclear envelope (NE) enclosingand protecting the genome, which is organized in chromatin, a structure wrapping DNAaround histone proteins. The NE is composed of two membranes: on the nucleoplasmic side,the Inner Nuclear Membrane (INM) and on the cytoplasmic side, the Outer NuclearMembrane. The NE allows communication between both compartments through Nuclear PoreComplexes and bridges the cytoskeleton to the nucleoskeleton through the LInker ofNucleoskeleton to Cytoskeleton complex. Thus, the nucleoskeleton associated with the INMis needed to transmit signals to the nucleus and induce changes in chromatin organisation andultimately gene expression.A novel family of NUCLEAR ENVELOPE ASSOCIATED PROTEINS (NEAPs)proposed to be new components of the plant nucleoskeleton has been recently evidenced inthe model plant Arabidopsis thaliana. AtNEAP proteins are encoded by a small gene familycomposed of three genes and are targeted through a nuclear localisation signal to the nucleuswhere they are anchored at the INM through their C-terminal transmembrane domain.AtNEAPs also possess several long coiled-coil domains reminiscent of the lamin structure inanimals. This thesis aimed at performing a functional analysis of AtNEAPs using T-DNAinsertion and CRISPR/Cas9 mutant lines. The AtNEAP interactome was investigated bymolecular approaches (Yeast Two Hybrid), which indicated AtNEAP interactions with eachother to form homo or hetero-dimers; as well as in vivo localisation and co-localisationcoupled to image analyses (apFRET, acceptor photobleaching Fluorescence ResonanceEnergy Transfer), which confirmed interactions with the transcription factor (TF) AtbZIP18.AtNEAP specific antibodies generated during this study were used to confirm expression invivo. Altogether, results indicated that AtNEAPs are part of the nucleoskeleton, with a role inanchoring TFs at the INM to maintain nuclear morphology and chromatin organisation.

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