Les états chromatiniens peuvent être étudiés à l’échelle des unités transcriptionnelles par des approches moléculaires ou à l'échelle plus globale de l'hétérochromatine structurée au sein de chromocentres par des approches cytogénétiques. Ces deux niveaux d’organisation de la chromatine sont dynamiques et influencent l'ensemble des processus nucléaires. L’objectif de cette thèse était d'avancer la compréhension des dynamiques chromatiniennes à ces deux échelles chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, en se focalisant sur une transition développementale majeure, la photomorphogenèse. Le processus de dé-étiolement implique la reprogrammation de l’expression de centaines de gènes en réponse à la lumière, constituant ainsi un excellent modèle d'étude. La première partie des travaux montre que la reprogrammation de l’expression du génome au cours de la photomorphogenèse est associée à des dynamiques de l’hétérochromatine qui sont régulés de façon différentielles dans les hypocotyles et les cotylédons. Ces dynamiques à grande échelle ont des conséquences localement, car les états décompactés sont associés à la réactivation d'éléments hétérochromatiniens répétés. Dans une deuxième partie, le répresseur transcriptionnel DE-ETIOLATED-1 (DET1) a été utilisé afin de rechercher l'implication de régulateurs de la photomorphogenèse dans les mécanismes chromatiniens. Ce répresseur majeur de la photomorphogenèse peut lier l'histone H2B et influence le niveau global de sa modification par mono-ubiquitination (H2Bub). Dans le cadre de ma thèse, j'ai révélé d'une part l’existence d’interactions génétiques entre DET1 et les gènes contrôlant l’homéostasie de H2Bub et d'autre part un défaut de la régulation chromatinienne des variants des gènes ribosomiques 5S et 45S dans le mutant det1-1. L’ensemble de ces données permet de proposer un modèle impliquant DET1 dans la régulation de H2Bub de façon différentielle dans l’euchromatine et l’hétérochromatine, constituant ainsi le premier lien entre régulateurs de la photomorphogenèse et modifications des histones. La marque H2Bub étant directement liée à l'activité transcriptionnelle chez divers eucaryotes, l'impact de H2Bub sur l'expression des gènes durant la photomorphogenèse a été analysé. La combinaison d’approches épigénomiques et transcriptomiques a permis de montrer que le gain de H2Bub est associé à l’induction des gènes. L’utilisation du mutant hub1 dans lequel le dépôt de H2Bub est aboli a également permis de révéler le rôle de cette marque pour une régulation rapide de l’induction et de la répression de nombreux gènes. De façon générale, ce travail a révélé des dynamiques chromatiniennes impliquant des réorganisations massives au niveau cytologique ainsi que des variations fines des modifications d'histones au niveau des gènes de l'euchromatine, ainsi que le rôle de DET1 dans la régulation de ces processus. Il ouvre donc la voie à l'étude des connections entre ces deux échelles de dynamiques pour la régulation de l'activité transcriptionnelle, liant compartimentation nucléaire et activité des gènes dans le contexte global de la réponse aux signaux lumineux. / Chromatin states can be studied both at the level of individual transcriptional units by molecular approaches or at the larger scale of heterochromatin by cytogenetic approaches. These two levels of chromatin organization are dynamic and influence all nuclear processes. The objective was to enhance the understanding of chromatin dynamics at these two scales in the model plant Arabidopsis thaliana, focusing on a major developmental transition, photomorphogenesis. The process of de-etiolation involves the reprogramming of the expression of hundreds of genes in response to the perception of light therefore constituting an excellent experimental system. The first part of the work shows that reprogramming of genome expression during photomorphogenesis is associated with heterochromatin dynamics that is differentially regulated in the hypocotyls and the cotyledons. These widespread dynamics have local consequences, as the decompacted states are associated with reactivation of heterochromatic repeat elements. In the second part, the transcriptional repressor DE-ETIOLATED-1 (DET1) was used to investigate the involvement of photomorphogenesis regulators in chromatin mechanisms. This major repressor of photomorphogenesis can bind histone H2B and influences the overall level of mono-ubiquitinated H2B (H2Bub). As part of my thesis, I uncovered the existence of genetic interactions between DET1 and the genes controlling H2Bub homeostasis and also a defect in the regulation of the chromatin around the 45S and 5S ribosomal genes in the mutant det1-1. These data have led me to propose a model involving DET1 in the differential regulation of H2Bub in heterochromatin and euchromatin, thus constituting for the first time a link between photomorphogenesis regulators and histone modifications. Because the H2Bub mark has been directly linked to transcriptional activity in a diverse range of eukaryotes, I analysed the impact of H2Bub on gene expression during photomorphogenesis in the third part of my thesis. The combination of transcriptomic and epigenomic approaches showed that the gain of H2Bub is associated with gene induction. The use of a hub1 mutant in which H2Bub deposition is abolished also revealed the role of this mark for the rapid control of many genes. In general terms, this work has revealed both dynamic chromatin changes that result in major genome reorganizations at the cytological scale and fine variations of histone modifications on euchromatic genes, as well as the role of DET1 in regulating these changes. My study paves the way for further studies on the connections between these two scales of dynamics and their function in the nuclear localization and changes in expression of genes in the overall context of light signaling.

Le complexe linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) est un complexe protéique conservé au cours de l’évolution, reliant les compartiments cytoplasmiques et nucléaires au travers la membrane nucléaire. Bien que les données récentes montrent une de ce complexe dans la régulation de la morphologie nucléaire et de la méiose, son implication dans l’organisation de la chromatine a été moins étudié chez les plantes. Le premier objectif de ce travail était de développer un plugin NucleusJ ImageJ dédié à la caractérisation de la morphologie nucléaire et de l’organisation de la chromatine en 3D. NucleusJ calcul 15 paramètres, y compris la forme et la taille des noyaux ainsi que des objets intra-nuclaires et leur position dans le noyau. Une documentation pour ce programme est disponible pour son utilisation, ainsi que des qu’un jeu données de noyaux pour tester ce programme. Plusieurs améliorations sont en cours pour développer une nouvelle version de ce plugin. Dans une deuxième partie de ce travail, des méthodes d’imagerie 3D ont été utilisées pour étudier la morphologie nucléaire et l’organisation de la chromatine dans les noyaux interphasiques chez Arabidopsis thaliana dans lequel les domaines d’htrochromatique sont groupés en régions detectable appelés chromocentres. Ces chromocentres forment un environnement répressif contribuant la rpression transcriptionnelle de séquences répétées permettant la stabilité du génome. Des mesures quantitatives de la position 3D de chromocentres dans le noyau montrent que la plupart chromocentres sont situés proximité de la périphérie du noyau, mais que cette distance peut être modifiée par le volume nucléaire ou dans certains mutants affectant le complexe LINC. Ce complexe LINC est proposé pour contribuer l’organisation de la chromatine et à son positionnement, de plus la mutation de ce complexe est associée une dérégulation l’inactivation de la transcription, ainsi qu’a une décompaction des séquences hétérochromatiques. La dernière partie de ce travail tire profit de séquences gnomiques disponibles et les données de RNA-seq pour explorer l’évolution des protines de la NE chez les plantes. Au Final, le travail réalisé durant cette thèse associe la génétique, la biologie moléculaire, la bioinformatique et de l’imagerie afin de mieux comprendre la contribution de l’enveloppe nucléaire dans l’organisation de la morphologie du noyaux et de la chromatine et suggère l’implication fonctionnelle du complexe LINC dans ces processus. / The linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex is an evolutionarily well-conserved protein bridge connecting the cytoplasmic and nuclear compartments across the nuclear membrane. While recent data supports its function in nuclear morphology and meiosis, its implication for chromatin organisation has been less studied in plants. The first aim of this work was to develop NucleusJ a simple and user-friendly ImageJ plugin dedicated to the characterisation of nuclear morphology and chromatin organisation in 3D. NucleusJ quantifies 15 parameters including shape and size of nuclei as well as intra-nuclear objects and their position within the nucleus. A step-by-step documentation is available for self-training, together with data sets of nuclei with different nuclear organisation. Several improvements are ongoing to release a new version of this plugin. In a second part of this work, 3D imaging methods have been used to investigate nuclear morphology and chromatin organisation in interphase nuclei of the plant model Arabidopsis thaliana in which heterochromatin domains cluster in conspicuous chromatin regions called chromocentres. Chromocentres form a repressive chromatin environment contributing to the transcriptional silencing of repeated sequences a general mechanism needed for genome stability. Quantitative measurements of 3D position of chromocentres in the nucleus indicate that most chromocentres are situated in close proximity to the periphery of the nucleus but that this distance can be altered according to nuclear volume or in specific mutants affecting the LINC complex. Finally, the LINC complex is proposed to contribute at the proper chromatin organisation and positioning since its alteration is associated with the release of transcriptional silencing as well as decompaction of heterochromatic sequences. The last part of this work takes advantage of available genomic sequences and RNA-seq data to explore the evolution of NE proteins in plants and propose a minimal requirement to built the simplest functional nuclear envelope. Altogether, work achieved in this thesis associate genetics, molecular biology, bioinformatics and imaging to better understand the contribution of the nuclear envelope in nuclear morphology and chromatin organisation and suggests the functional implication of the LINC complex in these processes.

Afin d’étudier la prise en charge des histones H3 jusqu’à l’ADN et pour comprendre l’influence de leur dynamique dans l’organisation d’ordre supérieur de la chromatine, une analyse des chaperonnes d’histones a été menée. Nous avons identifié et caractérisé les sous-unités du complexe HIR, impliqué dans l’assemblage de la chromatine réplication-indépendante chez Arabidopsis. La perte d’AtHIRA, la sous-unité centrale du complexe, affecte le niveau d’histone soluble, l’occupation nucléosomale des régions euchromatiniennes et héterochromatiniennes ainsi que la mise sous silence transcriptionnel des séquences d’ADN répétées. Alors que le complexe HIR ne participe pas à l’organisation d’ordre supérieur de la chromatine, j’ai montré que CAF-1, impliqué dans l’assemblage de la chromatine au cours de la réplication, joue un rôle central dans la formation des chromocentres. Lors du développement post-germinatif des cotylédons, les séquences d’ADN répétées centromériques et péricentromériques se concentrent dans les chromocentres et s’enrichissent en histone H3.1 de manière CAF-1 dépendante. Cet enrichissement, associé à des modifications post-traductionnelles d’histones associées à un état répressif de la transcription, participe à la formation des chromocentres et met en évidence l’importance de l’assemblage de la chromatine par CAF-1 dans la structure et le maintien du génome. Alors que la perte individuelle de HIR ou de CAF-1 n’affecte pas la viabilité, l’absence des deux complexes altère fortement l’occupation nucléosomale et le développement des plantes. Ceci suggère que la compensation fonctionnelle entre ces complexes de chaperonnes ainsi que la plasticité des voies de dépôt des histones restent limitées. / To understand how histones H3 are handled and how histone dynamics impact higher-order chromatin organization such as chromocenter formation in Arabidopsis, a comprehensive analysis of the different histone chaperone complexes is required. We identified and characterized the different subunits of the Arabidopsis HIR complex. AtHIRA is the central subunit and its loss affects non-nucleosomal histone levels, reduces nucleosomal occupancy not only at euchromatic but also at heterochromatic targets and alleviates transcriptional gene silencing. While the HIR complex-mediated histone deposition is dispensable for higher-order organization of Arabidopsis heterochromatin, I show that CAF-1 plays a central role in chromocenter formation. During postgermination development in cotyledons when centromeric and pericentromeric repeats cluster progressively into chromocenter structures, these repetitive elements but not euchromatic loci become enriched in H3.1 in a CAF-1- dependent manner. This enrichment, together with the appropriate setting of repressive histone post-translational marks, contributes to chromocenter formation, identifying chromatin assembly by CAF-1 as driving force in formation and maintenance of genome structure. Finally, while absence of HIR or CAF-1 complexes sustains viability, only the simultaneous loss of both severely impairs nucleosomal occupancy and plant development, suggesting a limited functional compensation between the different histone chaperone complexes and plasticity in histone variant interaction and deposition in plants.